泛素酶功能性匹配的筛选方法及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910806085.5 (22)申请日 2019.08.29 (71)申请人 苏州新格诺康生物技术有限公司 地址 215000 江苏省苏州市工业园区星湖 街218号生物纳米园A7楼203室 (72)发明人 姚晓晖苏妙贤来棽棽谢志伟 严俊 (51)Int.Cl. G01N 21/76(2006.01) G01N 1/38(2006.01) (54)发明名称 泛素酶功能性匹配的筛选方法及应用 (57)摘要 本发明公开了泛素酶功能性匹配的筛选方 法及应用， 包括配制2待测酶样品液。

2、及2反应 混合液； 在96孔板的反应孔中进行孵育； 在反应 孔中加入10LAMP-Glo试剂， 进行孵育； 加入20 LAMP检测液， 进行孵育； 测发光强度。 本发明 中的泛素酶有效匹配的筛选方法可提供更高的 准确度和可信度， 所有的反应步骤均在同一个96 孔板中均相完成， 无需洗涤， 分离等步骤， 整个方 案的完成只需约3个小时， 因而具有更强的可操 作性； 另外， 由于使用化学发光值作为最终结果 的读出， 本方案具有极高的灵敏度， 从而从很大 程度上减少了酶的用量， 降低了研究成本； 且本 发明中还提供了泛素酶有效组合图谱， 是当前所 知第一次基于体外泛素化反应所获得的该类功 能性图谱。。

3、 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 110361377 A 2019.10.22 CN 110361377 A 1.泛素酶功能性匹配的筛选方法， 其特征在于， 泛素酶功能性匹配的筛选方法包括以 下步骤： S1、 配制2待测酶样品液及2反应混合液； S2、 在96孔板的反应孔中加入S1中所配得的溶液各5 l， 并进行孵育； S3、 在反应孔中加入10 L AMP-Glo试剂， 在室温的条件下进行孵育； S4、 加入20 l AMP检测液， 在室温的条件下进行孵育； S5、 对S4中所制得的溶液的发光强度进行读取。 2.根据权利要求1所述的泛素酶功能性匹配的筛选方法及应用， 其特征在于，。

4、 所述2 待测酶样品液的制备方法包括步骤： S1、 配制50mmol/L的Tris-HCI缓冲液， 并在该缓冲液中加入MgCl2使其最终浓度为 5mmol/L， 调节pH值至7.5； S2、 使用前， 在S1中所制得的溶液中加入0.5mmol/L的DTT； S3、 在S2中所制得的溶液中加入RanBP2酶贮存液液至RanBP2最终浓度为200nmol/L， 制 备成2待测酶样品液。 3.根据权利要求1所述的泛素酶功能性匹配的筛选方法及应用， 其特征在于， 所述2 反应混合液的制备方法包括以下步骤： S1、 配制50mmol/L的Tris-HCI缓冲液， 并在该缓冲液中加入MgCl2使其最终浓度。

5、为 5mmol/L， 调节pH值至7.5； S2、 使用前， 在S1中所制得的溶液中加入0.5mmol/L的DTT； S3、 在S2中所制得的溶液中加入20nmol/L的SAE1/UBA2、 500nmol/L的UBE2I、 40 mol/L 的SUMO1和50 mol/L的ATP， 制备成2反应混合液。 4.根据权利要求1所述的泛素酶功能性匹配的筛选方法及应用， 其特征在于， 所述S2中 的孵育温度为37， 孵育时间为60分钟。 5.根据权利要求1所述的泛素酶功能性匹配的筛选方法及应用， 其特征在于， 所述S3中 的孵育时间为60分钟。 6.根据权利要求1所述的泛素酶功能性匹配的筛选方法及应。

6、用， 其特征在于， 所述S4中 的孵育时间为40分钟。 7.一种如权利要求1所述泛素酶功能性匹配的筛选方法可用于对相关酶组分进行泛素 化催化反应的研究。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110361377 A 2 泛素酶功能性匹配的筛选方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医药技术相关领域， 尤其涉及泛素酶功能性匹配的筛选方法及应 用。 背景技术 0002 泛素(Ub)或类泛素(UBL)对蛋白质的修饰直接参与到许多关键的细胞进程， 比如 细胞周期调控， DNA修补， 肿瘤发生， 抗病毒反应， 以及最为显著的对目标蛋白的降解。 蛋白 质的泛素化和类泛素化有着类似的催化过程。 这个过程需。

7、要3种不同泛素酶(或类泛素酶) 的循序协调作用： 泛素激活酶E1， 泛素结合酶E2， 泛素连接酶E3.当前人类基因编码的泛素 酶， 已发现有两种E1激活酶， 至少30种E2结合酶和超过600种E3连接酶。 这三种酶的有效组 合， 介导着细胞内泛素化过程的顺利进行。 由于E2与E3决定着泛素链的连接位点和结构以 及底物的特异性， 正确的选择具有功能性的E2与E3的匹配， 对研究泛素酶相关的细胞进程 尤为重要。 0003 目前筛选E2-E3功能组合的方法主要是利用酵母双杂交系统来检测蛋白-蛋白相 互作用。 然而， 这个系统在实际应用中常会遇到假阳性和假阴性的问题。 假阳性是由于融合 的诱饵蛋白或者。

8、靶蛋白本身就对报告基因有激活作用， 所以即使在待研究的两个蛋白间没 有发生相互作用的情况下， 报告基因也会被激活。 假阴性则是因为融合的诱饵蛋白或靶蛋 白通常只是所属蛋白的某单一结构域， 而蛋白-蛋白相互作用有时需要多个结构域的同时 参与。 另外， 该方法所揭示的E2-E3的相互作用并不能反映泛素化催化过程中的真实情况， 也不代表该作用可以介导泛素化反应的发生。 这是由于酵母双杂交技术只能筛选E3和游离 E2的相互作用， 然而功能相关性的相互作用是发生在E3与泛素化E2(激活后E2)之间的。 由 于这些局限， 迄今为止仍没有文献报道过生化功能上有效的泛素化酶的广泛组合。 0004 为此， 我们。

9、提出了泛素酶功能性匹配的筛选方法及应用。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供泛素酶功能性匹配的筛选方法及应用， 以解决上述背景技 术中提出的问题。 0006 为了实现上述目的， 本发明采用了如下技术方案： 0007 泛素酶功能性匹配的筛选方法及应用， 泛素酶功能性匹配的筛选方法包括以下步 骤： 0008 S1、 配制2待测酶样品液及2反应混合液； 0009 S2、 在96孔板的反应孔中加入S1中所配得的溶液各5 L， 并进行孵育； 0010 S3、 在反应孔中加入10 L AMP-Glo试剂， 在室温的条件下进行孵育； 0011 S4、 加入20 LAMP检测液， 在室温的条件下进行孵育。

10、； 0012 S5、 对S4中所制得的溶液的发光强度进行读取。 0013 优选地， 所述2待测酶样品液的制备方法包括步骤： 说明书 1/4 页 3 CN 110361377 A 3 0014 S1、 配制50mmol/L的Tris-HCI缓冲液， 并在该缓冲液中加入MgCl2使其最终浓度为 5mmol/L， 调节pH值至7.5； 0015 S2、 使用前， 在S1中所制得的溶液中加入0.5mmol/L的DTT； 0016 S3、 以S2中所制得的溶液稀释RanBP2酶贮存液至RanBP2最终浓度为200nmol/L， 制 备成2待测酶样品液。 0017 优选地， 所述2反应混合液的制备方法包括。

11、以下步骤： 0018 S1、 配制50mmol/L的Tris-HCI缓冲液， 并在该缓冲液中加入MgCl2使其最终浓度为 5mmol/L， 调节pH值至7.5； 0019 S2、 使用前， 在S1中所制得的溶液中加入0.5mmol/L的DTT； 0020 S3、 在S2中所制得的溶液中加入20nmol/L的SAE1/UBA2、 500nmol/L的UBE2I、 40 mol/L的SUMO1和50 mol/L的ATP， 制备成2反应混合液。 0021 优选地， 所述S2中的孵育温度为37， 孵育时间为60分钟。 0022 优选地， 所述S3中的孵育时间为60分钟。 0023 优选地， 所述S4中。

12、的孵育时间为40分钟。 0024 优选地， 所述泛素酶功能性匹配的筛选方法可用于对相关酶组分进行泛素化催化 反应的研究。 0025 与现有技术相比， 本发明的有益效果是: 0026 本发明中的泛素酶有效匹配的筛选方法可提供更高的准确度和可信度， 所有的反 应步骤均在同一个96孔板中均相完成， 无需洗涤， 分离等步骤， 整个方案的完成只需约3个 小时， 因而具有更强的可操作性； 另外， 由于使用化学发光值作为最终结果的读出， 本方案 具有极高的灵敏度， 从而从很大程度上减少了酶的用量， 降低了研究成本； 且本发明中还提 供了泛素酶有效组合图谱， 是当前所知第一次基于体外泛素化反应所获得的该类功能。

13、性图 谱。 附图说明 0027 图1为本发明提出的泛素酶测活实验原理及方案示意图； 0028 图2为本发明提出的实施例一和实施例二的两组泛素酶的匹配筛选结果； 0029 图3为本发明提出的利用该泛素酶功能性匹配的筛选方法获得的一系列功能性泛 素酶组合图谱。 具体实施方式 0030 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完 整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 0031 下面结合具体实施例对本发明作进一步解说， 目的仅在于更好的理解本发明内 容。 0032 参照图1-3， 泛素酶功能性匹配的筛选方法及应用， 泛素酶功。

14、能性匹配的筛选方法 包括以下步骤： 0033 S1、 配制2待测酶样品液及2反应混合液； 0034 S2、 在96孔板的反应孔中加入S1中所配得的溶液各5 L， 并进行孵育； 说明书 2/4 页 4 CN 110361377 A 4 0035 S3、 在反应孔中加入10 L AMP-Glo试剂， 在室温的条件下进行孵育； 0036 S4、 加入20 LAMP检测液， 在室温的条件下进行孵育； 0037 S5、 对S4中所制得的溶液的发光强度进行读取。 0038 其中， 2待测酶样品液的制备方法包括步骤： 0039 S1、 配制50mmol/L的Tris-HCI缓冲液， 并在该缓冲液中加入MgC。

15、l2使其最终浓度为 5mmol/L， 调节pH值至7.5； 0040 S2、 使用前， 在S1中所制得的溶液中加入0.5mmol/L的DTT； 0041 S3、 在S2中所制得的溶液中加入RanBP2酶贮存液至RanBP2最终浓度为200nmol/L， 制备成2待测酶样品液。 0042 其中， 2反应混合液的制备方法包括以下步骤： 0043 S1、 配制50mmol/L的Tris-HCI缓冲液， 并在该缓冲液中加入MgCl2使其最终浓度为 5mmol/L， 调节pH值至7.5； 0044 S2、 使用前， 在S1中所制得的溶液中加入0.5mmol/L的DTT； 0045 S3、 在S2中所制得。

16、的溶液中加入20nmol/L的SAE1/UBA2、 500nmol/L的UBE21、 40 mol/L的SUMO1和50 mol/L的ATP， 制备成2反应混合液。 0046 其中， S2中的孵育温度为37， 孵育时间为60分钟。 0047 其中， S3中的孵育时间为60分钟。 0048 其中， S4中的孵育时间为40分钟。 0049 其中， 泛素酶功能性匹配的筛选方法可用于对相关酶组分进行泛素化催化反应的 研究。 0050 实施例一 0051 本发明还提出了泛素酶功能性匹配的筛选方法及应用， 泛素酶功能性匹配的筛选 方法包括以下步骤： 0052 S1、 配制2待测酶样品液及2反应混合液； 0。

17、053 S2、 在96孔板的反应孔中加入S1中所配得的溶液各5 L， 并在温度为37的条件下 孵育60分钟； 0054 S3、 在反应孔中加入10 LAMP-Glo试剂， 在室温的条件下孵育60分钟； 0055 S4、 加入20 lAMP检测液， 在室温的条件下孵育40分钟； 0056 S5、 对S4中所制得的溶液的发光强度进行读取。 0057 其中， 2待测酶样品液的制备方法包括步骤： 0058 S1、 配制50mmol/L的Tris-HCI缓冲液， 并在该缓冲液中加入MgCl2使其最终浓度为 5mmol/L， 调节pH值至7.5； 0059 S2、 使用前， 在S1中所制得的溶液中加入0.。

18、5mmol/L的DTT； 0060 S3、 在S2中所制得的溶液中加入100nmol/L的UBE2D3及与其匹配的一系列的E3溶 液， 制备成2待测酶样品液。 0061 其中， 2反应混合液的制备方法包括以下步骤： 0062 S1、 配制50mmol/L的Tris-HCI缓冲液， 并在该缓冲液中加入MgCl2使其最终浓度为 5mmol/L， 调节pH值至7.5； 0063 S2、 使用前， 在S1中所制得的溶液中加入0.5mmol/L的DTT； 说明书 3/4 页 5 CN 110361377 A 5 0064 S3、 在S2中所制得的溶液中加入25 mol/L的ATP、 10 mol/L的U。

19、b、 25nmol/L的UBA1 和400nmol/L的UBE2D3， 制备成2反应混合液。 0065 实施例二 0066 本发明还提出了泛素酶功能性匹配的筛选方法及应用， 泛素酶功能性匹配的筛选 方法包括以下步骤： 0067 S1、 配制2待测酶样品液及2反应混合液； 0068 S2、 在96孔板的反应孔中加入S1中所配得的溶液各5 L， 并在温度为37的条件下 孵育60分钟； 0069 S3、 在反应孔中加入10 L AMP-Glo试剂， 在室温的条件下孵育60分钟； 0070 S4、 加入20 LAMP检测液， 在室温的条件下孵育40分钟； 0071 S5、 对S4中所制得的溶液的发光强。

20、度进行读取。 0072 其中， 2待测酶样品液的制备方法包括步骤： 0073 S1、 配制50mmol/L的Tris-HCI缓冲液， 并在该缓冲液中加入MgCl2使其最终浓度为 5mmol/L， 调节pH值至7.5； 0074 S2、 使用前， 在S1中所制得的溶液中加入0.5mmol/L的DTT； 0075 S3、 在S2中所制得的溶液中加入400nmol/L的RNF34及与其匹配的一系列的E2溶 液， 制备成2待测酶样品液。 0076 其中， 2反应混合液的制备方法包括以下步骤： 0077 S1、 配制50mmol/L的Tris-HCI缓冲液， 并在该缓冲液中加入MgCl2使其最终浓度为 。

21、5mmol/L， 调节pH值至7.5； 0078 S2、 使用前， 在S1中所制得的溶液中加入0.5mmol/L的DTT； 0079 S3、 在S2中所制得的溶液中加入25 mol/L的ATP、 10 mol/L的Ub、 25nmol/L的UBA1 和100nmol/L的RNF34， 制备成2反应混合液。 0080 根据图2可知， 筛选结果显示， E2结合酶UBE2D3可与BIRC3和RNF34两种E3匹配进行 有效的泛素化催化反应， 而E3连接酶RNF34可与UBE2D1、 UBE2D2、 UBE2D3三种E2匹配。 0081 以上所述， 仅为本发明较佳的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 110361377 A 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 110361377 A 7 图3 说明书附图 2/2 页 8 CN 110361377 A 8 。