基因工程表达QX型鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原的制备方法与应用.pdf

《基因工程表达QX型鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原的制备方法与应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程表达QX型鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原的制备方法与应用.pdf（24页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910674813.1 (22)申请日 2019.07.25 (83)生物保藏信息 CCTCC NO： M 2018859 2018.12.05 (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大学南路88号 (72)发明人 张小荣王月欣吴艳涛郭梦娇 张成成曹永忠 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 33/558(2006.01) G01N 33/531(2。

2、006.01) C12N 15/70(2006.01) C07K 14/165(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种基因工程表达QX型鸡传染性支气管炎 病毒S1蛋白抗原的制备方法与应用 (57)摘要 本发明属于生物技术领域， 涉及一种基因工 程表达QX型鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原 的制备方法与应用。 本发明公开了序列如SEQID NO.9所示的S1-E蛋白作为检测IBV抗体的抗原的 应用。 公开了用于检测IBV抗体的检测试剂盒， 还 公开了基因工程表达QX型鸡传染性支气管炎病 毒S1蛋白抗原的制备方法。 本发明提供的基因工 程重组QX型IBVS1。

3、蛋白抗原S1-E可与QX型IBV阳 性血清发生特异结合， 与非QX型IBV阳性血清交 叉反应较弱， 可用于QX型IB疫苗免疫抗体的监测 与评估。 权利要求书1页 说明书8页 序列表10页 附图4页 CN 110376385 A 2019.10.25 CN 110376385 A 1.S1-E蛋白作为检测IBV抗体的抗原的应用， 所述S1-E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。 2.一种用于检测IBV抗体的检测试剂盒， 其特征在于， 包括包被有S1-E重组蛋白纯化复 性产物的酶标板、 阳性和阴性对照、 HRP标记的兔抗鸡IgG、 样品稀释液、 显色液以及洗涤液， 所述S1-E的氨基酸序。

4、列如SEQ ID NO.9所示。 3.根据权利要求2所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述包被有S1-E重组蛋白的ELISA 酶标板， 是通过将纯化复性的S1-E蛋白原核表达产物包被于96孔酶标板而制备。 4.一种基因工程表达QX型鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原的制备方法， 其特征在 于， 包括以下步骤： 根据S1-E的氨基酸序列确定对应的IBVQXL87株S1基因编码区序列为SEQ ID NO.14； 根据该基因序列设计引物将该基因片段PCR扩增并克隆入pET-32a(+)载体， 将重 组表达载体进一步转化到感受态BL21(DE3)大肠杆菌中进行诱导表达； 通过Ni-NTA亲和层 析法从重。

5、组菌中纯化获得重组蛋白命名为S1-E。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110376385 A 2 一种基因工程表达QX型鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原的 制备方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种优选的QX型传染性支气管炎病毒(IBV) S1蛋白的抗原制备方法及其在检测QX型IBV抗体中的应用。 背景技术 0002 鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis， IB)是由传染性支气管炎病毒 (Infectious bronchitis virus， IBV)引起的一种急性、 高度接触性呼吸道传染病， 是世界 范围内危害养鸡业发展的最主要的。

6、传染病之一。 IBV可感染所有日龄的鸡， 临床表现为咳 嗽、 喷嚏、 气管啰音， 雏鸡会表现出更严重的呼吸道症状和更高的死亡率。 大多数IBV野毒株 既能引起呼吸道症状也能引起肾脏的病变， 尤其是雏鸡发生感染后， 可引起肾脏肿大且伴 有尿酸盐沉积， 表现为 “花斑肾” ， 当与其他疾病混合或者继发感染时， 死淘率会大大增加。 IBV还可以侵害母鸡的生殖系统， 但不同毒株致病力存在差异。 产蛋期感染IBV会导致产蛋 量下降， 并出现大量畸形蛋和软壳蛋， 蛋品质也会有明显下降。 如果在幼龄时期发生IBV早 期感染， 可引起输卵管严重发育不良， 形成所谓的 “假母鸡” ， 至性成熟时虽然卵巢可能发育。

7、 正常， 但由于输卵管退化， 不能正常产蛋， 卵黄掉入腹腔后可引起卵黄性腹膜炎， 有的鸡还 可表现输卵管的严重积液。 0003 由于IBV很容易发生变异， 因此导致新的血清型毒株不断出现， 在全球范围内已经 发现的IBV血清型有数十种之多。 QX型(最近也被命名为GI-19型)IBV是近年来发现的一个 新的血清型， 1997年首次发现于我国山东省青岛市， 随后迅速蔓延至亚洲、 欧洲及非洲多个 国家和地区， 已经成为目前亚洲及欧洲最主要的优势血清型， 对世界养禽业造成了巨大的 经济损失。 根据国内最新的流行病学研究资料， QX型流行毒株已经占国内流行毒株的70 左右。 0004 IBV基因组主要。

8、编码S蛋白、 N蛋白、 M蛋白、 E蛋白四个结构蛋白， 其中S、 M和N在成熟 病毒粒子中含量较为丰富。 S蛋白是IBV的主要结构蛋白， 是构成病毒粒子最表层纤突的主 要成分， 含有与病毒中和、 诱导宿主血凝抑制抗体产生、 细胞吸附、 组织嗜性、 血清型有关的 抗原位点， 也是IBV蛋白中变异程度最大的结构蛋白。 S蛋白在翻译后经过宿主细胞蛋白酶 的裂解产生S1蛋白和S2蛋白， 两者之间由二硫键连接， 其中S1蛋白氨基酸序列的差异与毒 株的血清型相关。 Cavanagh D等(Cavanagh D,Elus MM,Cook JK.Relationship between sequence va。

9、riation in the S1spike protein of infectious bronchitis virus and the extent of cross-protection in vivoJ.Avian pathology,1997,26(1):63-74.) 研究表明， 大多数IBV的血清型抗原决定簇位于S1蛋白的N端， 其中存在3个高度变异的区域 (HVR)： N端第3781氨基酸处、 第117160氨基酸处和第269298氨基酸处。 Ignjatovic等 (Ignjatovic J,Sapats S.Identification of previously unkn。

10、own antigenic epitopes on the S and N proteins of avian infectious bronchitis virusJ .Archives of virology,2005,150(9):1813-31.)的研究表明， 除上述HVR外， 在S1蛋白和 说明书 1/8 页 3 CN 110376385 A 3 S2蛋白上分别还有2个和1个额外的抗原决定簇区域， 可能与中和保护有关， 它们分别定位 于氨基酸第294316位， 第532537位和第566584位。 相对于S蛋白的高度变异性， M蛋白 和N蛋白在不同血清型的毒株间相对保守。 0005 。

11、迄今为止， 疫苗免疫仍是生产中控制IB的最常用、 也是最有效的措施， 选择与流行 毒株血清型一致的疫苗是确保良好免疫保护效果的重要前提条件。 自从QX型IBV在我国首 次被发现以来， 研制与抗原性相一致的疫苗就成为重要的研究方向， 2018年5月10日中华人 民共和国农业农村部第24号公告批准了由扬州大学等5家单位联合申报的鸡新城疫-传染 性支气管炎二联活疫苗(La Sota株+QXL87株)为新兽药并核发新兽药注册证书(2018)新 兽药证字24号， 该疫苗产品中的传染性支气管炎活疫苗毒株(QXL87株)为国内首个研发成 功的QX型疫苗株， 标志着与QX型流行毒株匹配的疫苗产品在我国正式进入。

12、生产应用。 0006 目前对于IB疫苗免疫效果的评价主要有两种方法， 一种是免疫攻毒保护试验， 另 外一种是检测特异性免疫抗体应答水平。 其中免疫攻毒保护试验需要具备特定生物安全防 护条件的实验动物实施， 且评估周期长、 代价大， 不适合于鸡场使用。 而检测特异性抗体应 答水平操作相对简单， 成本低， 不存在散毒的生物安全风险， 因此适合在鸡场进行推广应 用。 目前商品化的IBV抗体监测试剂盒基本上都是以马萨诸塞型(Mass型)IBV毒株全病毒作 为抗原包被酶标板制备而成， 检测的抗体水平不具备血清型特异性， 无法应用于血清型特 异性免疫抗体的评估。 因此针对QX型IB疫苗的推广应用， 急需要。

13、研制与之相对应的免疫抗 体检测试剂产品用于该血清型疫苗的免疫效果评估。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种优选的基因工程重组QX型IBV S1蛋白抗原的制备方 法与应用。 0008 本发明的原理和最核心的关键技术是综合运用各种生物信息学方法对IBV S1蛋 白进行抗原性分析， 选取位于S1高变区且抗原性较好的5个多肽片段， 针对对应的S1基因编 码区序列分别设计引物， 构建原核表达质粒， 之后将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态中细 菌中进行原核表达并对重组蛋白进行纯化， 进一步将纯化蛋白作为抗原包被酶标板， 通过 酶联免疫吸附试验(ELISA)分别对QX型、 Mass型、 79。

14、3/B型和tl/ch/LDT3/03型阳性血清IBV 阳性血清进行检测， 优选出与QX型阳性血清反应效果最佳而且与Mass型、 793/B型和tl/ch/ LDT3/03型等非QX型IBV阳性血清交叉反应较弱的S1-E重组蛋白作为检测抗原， 建立ELISA 方法， 用于QX型IB疫苗免疫抗体的检测。 0009 实现本发明目的的技术方案是： 0010 本发明所述的一种基于QX型IBV S1-E重组蛋白为检测抗原， 用于检测IBV抗体， 包 括包被有S1-E重组蛋白纯化复性产物的酶标板、 阳性和阴性对照、 HRP标记的兔抗鸡IgG、 样 品稀释液、 显色液以及洗涤液。 0011 进一步地， 所述包。

15、被有S1-E重组蛋白的ELISA酶标板， 是通过将纯化复性的S1-E蛋 白原核表达产物包被于96孔酶标板而制备。 0012 本发明所述基于IBV S1蛋白用于检测IBV抗体的抗原制备与应用方法， 可以通过 以下步骤得到： 0013 (1)QX型IBV S1基因的生物信息学分析： 以QX型IBV疫苗毒株QXL87株为分析对象， 说明书 2/8 页 4 CN 110376385 A 4 首先根据该毒株的S1基因序列(GenBank登录号： MH743141； SEQ ID NO .1) ， 应用 BioEdit7.0、 Lasergene 7.0软件包中的MegAlign程序等与Mass型H120。

16、株(GenBank登录号： FJ888351.1； SEQ ID NO.2)、 793/B型4/91株(GenBank登录号： AF093793.1； SEQ ID NO.3)和 tl/ch/LDT3/03型LDT3-A株(GenBank登录号： KR608272.1； SEQ ID NO.4)等序列进行核苷酸 和氨基酸序列比对， 然后通过Lasergene 7.0软件包中的Protean程序对蛋白序列进行抗原 性分析， 经综合比较， 筛选出位于S1高变区且抗原性较好的AE 5个多肽片段进行进一步 筛选， 5个多肽片段对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.5SEQ ID NO.9。 0014 。

17、(2)AE 5个多肽片段的基因工程表达： 根据筛选出的5个多肽片段确定对应的 IBVQXL87株S1基因编码区序列， 依次为S1-A(SEQ ID NO.10)、 S1-B(SEQ ID NO.11)、 S1-C (SEQ ID NO.12)、 S1-D(SEQ ID NO.13)、 S1-E(SEQ ID NO.14)。 根据各段基因序列设计引物 将5个基因片段分别PCR扩增并克隆入pET-32a(+)载体， 将重组表达载体进一步转化到感受 态BL21(DE3)大肠杆菌中进行诱导表达。 通过Ni-NTA亲和层析法从重组菌中纯化获得重组 蛋白， 分别命名为S1-A、 S1-B、 S1-C、 S。

18、1-D和S1-E。 0015 (3)基因工程重组蛋白的优选： 将S1-A、 S1-B、 S1-C、 S1-D和S1-E 5种重组蛋白按照 2 g/mL的浓度100 L/孔包被96孔酶标板， 将QX型QXL87株、 Mass型H120株、 793/B型4/91株和 tl/ch/LDT3/03型LDT3-A株分别免疫SPF鸡制备的多抗血清作1:100稀释， 进行ELISA试验， 优选出对QX型特异性抗体检测效果最佳且同时与非QX型IBV抗体交叉反应较弱的重组蛋白 应用于QX型疫苗免疫抗体检测。 0016 本发明的有益效果体现在： S蛋白是IBV的主要结构蛋白， 是构成病毒粒子最表层 纤突的主要成分。

19、， 其中S1蛋白含有与病毒中和、 诱导宿主血凝抑制抗体产生、 细胞吸附、 组 织嗜性、 血清型有关的抗原位点， 也是IBV蛋白中变异程度最大的结构蛋白。 相对于以全病 毒抗原为基础建立的抗体检测方法， 以S1蛋白为基础建立的抗体检测方法可用于血清型特 异性IBV抗体检测。 本发明提供一种优选的基因工程重组QX型IBV S1蛋白抗原S1-E可与QX 型IBV阳性血清发生特异结合， 与非QX型IBV阳性血清交叉反应较弱， 可用于QX型IB疫苗免 疫抗体的监测与评估。 附图说明 0017 图1是S1-AS1-E 5个肽段在S1蛋白上的对应位置示意图 0018 图2是S1-AS1-E基因片段的PCR扩。

20、增鉴定电泳图(M： DNA Marker DL2000； 1： S1- A； 2： S1-B； 3： S1-C； 4： S1-D； 5： S1-E； 6： 阴性对照)。 0019 图3是S1-AS1-E基因片段插入到pET-32a(+)载体得到的阳性重组质粒的酶切鉴 定图片， (M： DNA Marker DL2000； 1： S1-A酶切产物； 2： S1-B酶切产物； 3： S1-C酶切产物； 4： S1-D酶切产物； 5： S1-E酶切产物) 0020 图4是S1-AS1-E重组菌诱导表达SDS-PAGE鉴定图(M： 蛋白Marker； 1： S1-A重组菌 诱导上清； 2： S1-A重。

21、组菌诱导沉淀； 3： S1-B重组菌诱导上清； 4： S1-B重组菌诱导沉淀； 5： S1- C重组菌诱导上清； 6： S1-C重组菌诱导沉淀； 7： S1-D重组菌诱导上清； 8： S1-D重组菌诱导沉 淀； 9： S1-E重组菌诱导上清； 10： S1-E重组菌诱导沉淀。 箭头所示为目的蛋白条带。 ) 0021 图5是SDS-PAGE鉴定S1-AS1-E重组蛋白纯化效果图(M： 蛋白Marker； 1： S1-A纯化 滤液； 2： S1-B纯化滤液； 3： S1-C纯化滤液； 4： S1-D纯化滤液； 5： S1-E纯化滤液； 6： S1-A纯化洗 说明书 3/8 页 5 CN 11037。

22、6385 A 5 脱液； 7： S1-B纯化洗脱液； 8： S1-C洗脱液； 9： S1-D洗脱液； 10： S1-E纯化洗脱液。 箭头所示为 目的蛋白条带。 ) 0022 图6是Western-Blot鉴定S1-A重组蛋白纯化复性结果图(箭头标示的为S1-A目的 蛋白条带) 0023 图7是Western-Blot鉴定S1-B重组蛋白纯化复性结果图(箭头标示的为S1-B目的 蛋白条带) 0024 图8是Western-Blot鉴定S1-C重组蛋白纯化复性结果图(箭头标示的为S1-C目的 蛋白条带) 0025 图9是Western-Blot鉴定S1-D重组蛋白纯化复性结果图(箭头标示的为S1-。

23、D目的 蛋白条带) 0026 图10是Western-Blot鉴定S1-E重组蛋白纯化复性结果图(箭头标示的为S1-E目的 蛋白条带)。 0027 本发明中用于制备抗原的优选重组菌BL21(DE3)/pET-QXIBV-S1E， 于2018年12月5 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址中国武汉武汉大学， 保藏编号CCTCC NO： M2018859； 分类命名是： 大肠杆菌BL21(DE3)/pET-QXIBV-S1E， Escherichia coli BL21 (DE3)/pET-QXIBV-S1E。 具体实施方式 0028 下面将通过附图和具体实施方例对本发明做进一步的具体描述， 但。

24、不能理解为是 对本发明保护范围的限定， 如关于QX型IBV的命名根据公开的文献还可能命名为LX4型或 GI-19型等。 0029 实施例1QX型IBV S1基因的生物信息学分析 0030 以QX型IBV疫苗毒株QXL87株为分析对象， 首先根据该毒株的S1基因序列(GenBank 登录号： MH743141； SEQ ID NO.1)， 应用BioEdit7.0、 Lasergene 7.0软件包中的MegAlign程 序等与Mass型H120株(GenBank登录号： FJ888351.1； SEQ ID NO.2)、 793/B型4/91株 (GenBank登录号： AF093793.1；。

25、 SEQ ID NO.3)和tl/ch/LDT3/03型LDT3-A株(GenBank登录 号： KR608272 .1； SEQ ID NO .4)等序列进行核苷酸和氨基酸序列比对， 然后通过 Lasergene7.0软件包中的Protean程序对蛋白序列进行抗原性分析， 经综合比较， 筛选出位 于S1高变区且抗原性较好的AE 5个多肽片段进行进一步筛选， 5个多肽片段对应的氨基 酸序列为SEQ ID NO.5SEQ ID NO.9。 各肽段在S1蛋白中的相对位置如图1所示， 各肽段与 H120株、 4/91株和LDT3-A株对应肽段氨基酸序列同源性如表1所示。 0031 表1多肽片段AE与。

26、其他血清型毒株对应肽段氨基酸序列同源性 0032 0033 实施例2： AE 5个多肽片段在大肠杆菌中的表达 0034 引物设计与目的片段的PCR扩增： 根据筛选出的AE5个多肽片段确定对应的IBV 说明书 4/8 页 6 CN 110376385 A 6 QXL87株S1基因编码区序列， 依次为S1-A(SEQ ID NO.10)、 S1-B(SEQ ID NO.11)、 S1-C(SEQ ID NO.12)、 S1-D(SEQ ID NO.13)、 S1-E(SEQ ID NO.14)。 根据各段基因序列分别设计5对特 异引物， 为方便克隆， 上游引物添加5 端添加BamH I酶切位点识别。

27、序列， 下游引物5 端添加 Xho I酶切位点识别序列， 引物序列见表2。 以QXL87株基因组RNA为模板利用RT-PCR方法扩 增5个目的片段， PCR产物电泳鉴定结果见图2。 将5个目的片段分别克隆到pEASY-T3载体(北 京全式金生物技术有限公司， 产品编号CT301)中， 转化到Trans1-T1大肠杆菌感受态细胞 (北京全式金生物技术有限公司， 产品编号CD401)中， 通过菌液PCR鉴定出阳性克隆菌并进 行测序鉴定， 选择无碱基突变的阳性克隆进行下一步试验。 0035 表2引物序列 0036 0037 0038 注： 下划线部分 “GGATCC” 为BamH I酶切位点识别序列。

28、，“CTCGAG” 为Xho I酶切位点 识别序列。 0039 重组表达载体的构建： 分别将5个重组克隆菌进行小量扩增并提取质粒， 利用限制 性内切酶BamH I和Xho I将目的片段定向亚克隆到原核表达质粒pET-32a(+)(Novagen公 司， 产品编号69015-3)相应位点之间， 获得重组表达载体。 重组表达载体经BamH I和Xho I 双酶切之后经琼脂糖凝胶电泳鉴定无误后(结果见图3)， 将重组表达载体转化到BL21(DE3) 大肠杆菌感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司， 产品编号CD601)中， 获得重组表达 菌。 0040 重组蛋白的诱导表达与鉴定： 将培养至对数生长期。

29、的重组菌以1:100的比例接种 于含100 g/mL氨苄青霉素的LB培养基中， 220r/min37培养至OD600nm值达到0.40.6时， 加 入IPTG至终浓度为0.5mM， 进行诱导表达， 5h后收集细菌， 用PBS洗涤3次后再用PBS重悬菌体 说明书 5/8 页 7 CN 110376385 A 7 沉淀， 然后60Hz， 间隔3s进行超声破碎， 破碎完成后离心分离上清和沉淀。 通过SDS-PAGE对 表达产物进行分析。 图4为诱导5h的细菌裂解产物上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图， 可见表达 产物大部分在沉淀中， 说明以包涵体表达为主。 0041 重组蛋白的纯化与复性： 重组表达。

30、菌诱导表达后超声裂解并离心获取沉淀， 根据 Ni-NTA纯化介质(南京金斯瑞生物科技有限公司， 产品编号L00250)说明书， 在变性条件下 进行重组蛋白纯化， 利用SDS-PAGE对纯化效果进行鉴定(见图5)， 获得的纯化蛋白分别命名 为S1-A、 S1-B、 S1-C、 S1-D、 S1-E。 纯化后的重组蛋白置于透析袋中， 将装有重组蛋白的透析 袋放入蛋白透析液进行复性， 通过含不同浓度尿素(8mmol/L-0mmol/L)的蛋白透析液按照 由高浓度到低浓度依次进行梯度透析， 间隔12h置换到下一个梯度蛋白透析液中， 最后置于 PBS中透析12h。 将PEG6000包埋透析袋进行蛋白浓缩。

31、， 利用Western-blot对复性的纯化蛋白 进行鉴定(见图6图10)， 由图可知重组蛋白均可与QX型IBV阳性血清反应产生特异性条 带。 0042 实施例3： 以纯化的重组蛋白作为包被抗原对QX型IBV阳性血清进行ELISA检测 0043 将S1-A、 S1-B、 S1-C、 S1-D和S1-E 5种重组蛋白按照2 g/mL的浓度100 L/孔包被96 孔酶标板， 将QX型IBV(QXL87株)免疫SPF鸡制备的多抗血清作1:100稀释， 分别用5种抗原包 被的酶标板进行ELISA试验， 优选出对QX型特异性抗体检测效果最佳的抗原(P/N值最大)用 于建立QX型IBV特异性抗体检测的方法。

32、。 具体操作步骤如下： 0044 (1)QX型IBV阳性血清制备 0045 SPF鸡于14日龄进行第一次免疫， 免疫用QX型IBV疫苗株QXL87株(106.5EID50/ml) 由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室保藏和提供(陈启稳.QX型鸡传染性支气 管炎弱毒疫苗的研制.扬州大学硕士学位论文， 2014.)， 免疫方式为每只鸡按照0.2mL的免 疫剂量进行胸部肌肉注射； 间隔2周按照相同免疫剂量进行第二次免疫； 以后每间隔2周加 强免疫一次。 直到血清中和抗体水平达到1:64， 通过心脏采血的方式进行采血， 室温静置4h 后3000r/min离心10min， 收集的血清分装后于-20。

33、保存备用。 0046 (2)ELISA检测 0047 a.按2 g/mL稀释抗原， 每孔加入100 L抗原， 4包被12h， 抗原孵育结束后将液体 甩出， 每孔加入300 L PBST洗涤液， 室温放置5min后甩掉其中液体并拍干， 洗涤3次； 0048 b.封闭： 每孔加入300 L 1BSA-PBST， 置37水浴锅孵育3h， 孵育结束后将液体 甩出， 洗涤3次拍干； 0049 c.一抗孵育： 用0.2BSA-PBST按1:100稀释QX型IBV阳性血清和SPF鸡阴性血清作 为一抗， 将酶标板置37水浴锅孵育1h， 孵育结束后将孔中液体甩出， 洗涤3次拍干； 0050 d.二抗孵育： 用0。

34、.2BSA-PBST按1:20000稀释HRP标记的兔抗鸡IgG， 每孔加入100 L作为二抗， 置37水浴锅孵育1h， 孵育结束后将其中液体甩出后用PBST洗涤3次， 拍干； 0051 e.显色： 将TMB显色试剂盒(Thermo Scientific公司， 产品编号34021)中两种试剂 等比例混匀， 每孔加入100 L， 37避光孵育10min； 0052 f.终止： 每孔加入50 L的2mol/L H2SO4； 0053 g.读数： 将酶标板置于酶标仪中读数。 结果如表3所示， 以重组蛋白S1-E作为包被 抗原对QX型IBV阳性血清的抗体水平检测效果最佳， 产生的OD450读值最高， 。

35、且P/N值最大。 0054 表3.五种重组蛋白作为包被抗原对QX型IBV阳性血清的ELISA检测结果 说明书 6/8 页 8 CN 110376385 A 8 0055 0056 注： P为阳性血清， N为阴性血清， P/N为阳性血清和阴性血清的OD450nm读值的比 值。 0057 实施例4： 以优选的重组蛋白作为包被抗原建立检测QX型IBV特异性抗体的ELISA 方法 0058 将优选的重组蛋白S1-E按照2 g/mL的浓度100 L/孔包被96孔酶标板， 将QX型 QXL87株、 Mass型H120株、 793/B型4/91株和tl/ch/LDT3/03型LDT3-A株分别免疫SPF制备。

36、的 多抗血清作1:400稀释， 进行ELISA试验， 比较对不同血清型IBV阳性血清的检测效果。 0059 具体操作步骤如下： 0060 (1)Mass型、 793/B型和tl/ch/LDT3/03型IBV阳性血清制备： 0061 Mass型、 793/B型和tl/ch/LDT3/03型IBV阳性血清制备方法同QX型IBV阳性血清制 备方法， 免疫所用的疫苗均为含对应血清型疫苗毒株的商品化弱毒活疫苗， 其中鸡传染性 支气管炎活疫苗(H120株)为青岛易邦生物工程有限公司产品、 鸡传染性支气管炎活疫苗 (4/91株)为MSD公司产品、 鸡传染性支气管炎活疫苗(LDT3-A株)为哈尔滨维科生物技术。

37、开 发公司产品。 免疫鸡血清中和抗体水平达到1:64， 通过心脏采血的方式进行采血， 室温静置 4h后3000r/min离心10min， 收集的血清分装后于-20保存备用。 0062 (2)ELISA检测： 0063 a.按2 g/mL稀释抗原， 每孔加入100 L抗原， 4包被12h， 抗原孵育结束后将液体 甩出， 每孔加入300 L PBST洗涤液， 室温放置5min后甩掉其中液体并拍干， 洗涤3次； 0064 b.封闭： 每孔加入300 L 1BSA-PBST， 置37水浴锅孵育3h， 孵育结束后将液体 甩出， 洗涤3次拍干； 0065 c.一抗孵育： 用0.2BSA-PBST按1:10。

38、0稀释QX型、 Mass型、 793/B型和tl/ch/LDT3/ 03型IBV阳性血清以及SPF鸡阴性血清作为一抗， 将酶标板置37水浴锅孵育1h， 孵育结束 后将孔中液体甩出， 洗涤3次拍干； 0066 d.二抗孵育： 用0.2BSA-PBST按1:20000稀释HRP标记的兔抗鸡IgG， 每孔加入100 L作为二抗， 置37水浴锅孵育1h， 孵育结束后将其中液体甩出后用PBST洗涤3次， 拍干； 0067 e.显色： 将TMB显色试剂盒(Thermo Scientific公司， 产品编号34021)中两种试剂 等比例混匀， 每孔加入100 L， 37避光孵育10min； 0068 f.终。

39、止： 每孔加入50 L的2mol/L H2SO4； 0069 g.读数： 将酶标板置于酶标仪中读数。 结果如表4所示， 以重组蛋白S1-E作为包被 抗原进行ELISA检测， 仅对QX型IBV阳性血清产生良好反应， 而对Mass型、 793/B型和tl/ch/ LDT3/03型IBV阳性血清检测结果OD450读值较低， 该结果说明S1-E蛋白作为检测抗原具有 良好的血清型特异性， 而与非QX型抗体交叉反应较小。 0070 表4.五种重组蛋白作为包被抗原对QX型IBV阳性血清的ELISA检测结果 0071 说明书 7/8 页 9 CN 110376385 A 9 0072 0073 注： P为阳性。

40、血清， N为阴性血清， P/N为阳性血清和阴性血清的OD450nm读值的比 值。 说明书 8/8 页 10 CN 110376385 A 10 SEQUENCE LISTING 扬州大学 一种基因工程表达QX型鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原的制备方法与应用 24 PatentIn version 3.3 1 1620 DNA 传染性支气管炎病毒 （Infectious bronchitis virus） 1 atgttgggga agtcactgtt tttagtgacc attttgtgtg cactatgtag tgcaaattta 60 ttcgatcctg ctaatactta tg。

41、tgtactac taccaaagtg cctttaggcc tccaaatgga 120 tggcacctac aagggggtgc ttatgcagta gtcaattcca ctaattatac taataatgcc 180 ggttctgcac aacattgcac tgttggtgtt attaaggacg tctataatca aagtgcggct 240 tccatagcta tgacagcacc tcttcagggt atggcttggt ctaagtcaca attttgtagt 300 gcacactgta acttttctga aattacagtt tttgtcacac 。

42、attgttatag tagtggtagc 360 gggtcttgtc ctacaacagg catgattgca cgtgatcata ttcgtatttc tgcaatgaaa 420 aatggtactt tattttataa tttaacagtt agcgtatcta aataccctaa ttttaaatct 480 tttcaatgcg ttaataatct cacatctgtt tatctaaatg gtgatcttgt ttttacttcc 540 aacaaaacta ctgatgttac gtcagcaggt gtgtatttta aagcaggtgg acctgtaaa。

43、t 600 tatagtatta tgaaagaatt taaggttctt gcttactttg ttaatggtac agcacaagat 660 gtaattttgt gcgacaattc ccccaagggt ttgctagctt gtcaatataa cactggcaat 720 ttttcagatg gcttttatcc ttttactaat agtactttag ttagggaaaa gttcatcgta 780 tatcgcgaaa gtagtgttaa tactactctg gcgttaacta atttcacttt tactaatgta 840 agtaatgcac agc。

44、ctaatag tggtggtgtt aatacttttc atctatatca aacacaaaca 900 gctcagagtg gttattataa ttttaatttg tcatttctga gtcagtttgt gtataaggca 960 agtgatttta tgtatgggtc ctaccaccct agttgttctt ttagaccaga caccattaat 1020 agtggtttgt ggtttaattc tttgtcagtt tctctagctt acggaccact tcaaggtggg 1080 tgtaagcagt cagtttttag tggtagggca。

45、 acgtgttgct atgcctactc ttacaatggc 1140 ccgatagcct gtaaaggtgt ttattcaggc gaattacgga ctaattttga atgtggattg 1200 ctgatttatg ttactaagag tgatggttct cgtatacaga ctagaacaga gcccttagta 1260 ttaacgcaac acaattataa taatattact ttagataagt gtgttgacta taatatatat 1320 ggcagagtag gccaaggttt tattactaat gtgactgatt ctgc。

46、tgctaa ttttagttat 1380 ttagcagatg gtgggttagc tattttagat acttcgggtg ccatagatgt ctttgttgta 1440 cagggcagct atggtcttaa ttattacaag gtcaatcctt gtgaagatgt taacaaacag 1500 tttgtagtgt ctggtggcaa tatagttggc attcttactt ctagaaatga aacaggttct 1560 gaacaggttg agaaccagtt ttatgttaag ttaaccaata gctcacatcg tcgcaggcg。

47、t 1620 序列表 1/10 页 11 CN 110376385 A 11 2 1611 DNA 传染性支气管炎病毒 （Infectious bronchitis virus） 2 atgttggtaa cacctctttt actagtgact cttttgtgtg cactatgtag tgctgttttg 60 tatgacagta gttcttacgt gtactactac caaagtgcct tcagaccacc tgatggttgg 120 catttacatg ggggtgcgta tgcggttgtt aatatttcta gtgaatctaa taatgcaggc 180。

48、 tcttcatctg ggtgtactgt tggtattatt catggtggtc gtgttgttaa tgcttcttct 240 atagttatga cggcaccgtc atcaggtatg gcttggtcta gcagtcagtt ttgtactgca 300 tactgtaact tttcagatac tacagtgttt gttacacatt gttataaaca tgttgggtgt 360 cctataactg gcatgcttca acagcattct atacgtgttt ctgctatgaa aaatggccag 420 cttttttata atttaaca。

49、gt tagtgtagct aagtacccta cttttaaatc atttcagtgt 480 gttaataatt taacatctgt atatttaaat ggtgatcttg tttacacctc taatgagacc 540 acagatgtta catctgcagg tgtttatttt aaagctggtg gacctataac ttataaagtt 600 atgagagaag ttagagccct ggcttatttt gttaatggta ctgcacaaga tgttattttg 660 tgtgatgggt cacctagagg cttgttagca tgccag。

50、tata atactggcaa tttttcagat 720 ggcttttatc cttttactaa tagtagttta gttaagcaga agtttattgt ctatcgtgaa 780 aatagtgtta atactacttt tacgttacac aatttcactt ttcataatga gactggcgcc 840 aacccaaatc ctagtggtgt ccagaatatt caaacttacc aaacacaaac agctcagagt 900 ggttattata attttaattt ttcctttctg agtagttttg tttataagga gtct。