跨口蹄疫病毒血清型单克隆抗体的筛选方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910694339.9 (22)申请日 2019.07.30 (71)申请人 中国农业科学院兰州兽医研究所 地址 730046 甘肃省兰州市城关区盐场堡 徐家坪1号 (72)发明人 李坤曹轶梅卢曾军刘在新 包慧芳周莎莎王省白兴文 李平花付元芳 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569 代理人 瞿晓晶 (51)Int.Cl. C07K 16/10(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/85(2006.01) (54)发明名称 一。

2、种跨口蹄疫病毒血清型单克隆抗体的筛 选方法 (57)摘要 本发明涉及一种跨口蹄疫病毒血清型单克 隆抗体的筛选方法， 属于单克隆抗体筛选技术领 域。 本发明利用不同荧光素标记不同的血清型抗 原， 借助多色流式细胞仪直接分选获得结合不同 抗原的特异性B细胞， 设计出一种快速获得能与 不同血清型抗原反应的单克隆抗体筛选方法， 能 够得到可以快速产生跨血清单克隆抗体， 获得该 类型单克隆抗体可用于鉴定不同病毒血清型间 保守抗原位点， 可以为血清非依赖性ELISA检测 方法的建立前提必要工具。 权利要求书2页 说明书11页 序列表2页 附图4页 CN 110372790 A 2019.10.25 CN 。

3、110372790 A 1.一种跨口蹄疫病毒血清型单克隆抗体的筛选方法， 包括以下步骤： 1)从免疫O型和A型FMDV双价灭活疫苗的动物血液样本中分离外周血单个核细胞； 2)对O型FMDV 146S抗原进行第一超滤离心， 得到浓缩后的O型FMDV 146S抗原， 使用第 一染料对浓缩后的O型FMDV 146S抗原进行染色， 第二超滤离心， 得到标记后的O型FMDV 146S抗原； 3)对A型FMDV 146S抗原进行第三超滤离心， 得到浓缩后的A型FMDV 146S抗原， 使用第 二染料对浓缩后的A型FMDV 146S抗原进行染色， 第四超滤离心， 得到标记后的A型FMDV 146S抗原； 4。

4、)将步骤1)得到的外周血单个核细胞与步骤2)得到的标记后的O型FMDV 146S抗原、 步 骤3)得到的标记后的A型FMDV 146S抗原、 鼠抗牛CD21-RPE和鼠抗牛IgM-FITC荧光抗体混 合， 得到染色后的细胞； 5)使用多色流式细胞仪分选能同时结合O型和A型FMDV的双阳性单个B细胞； 6)对步骤5)得到的双阳性单个B细胞进行反转录， 得到cDNA后进行扩增， 得到单个B细 胞IgG抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因； 7)将步骤6)得到的单个B细胞IgG抗体的重链可变区基因的框架区前端引入如SEQ ID NO.9所示的第一分泌信号肽序列， 参考Homo sapiens(Hum。

5、an)密码子进行基因序列优化， 将 优化后的基因插入到含有IgG重链恒定区的pcDNA3.4载体， 得到重链质粒； 将步骤6)得到的单个B细胞IgG抗体的轻链可变区基因的框架区前端引入如SEQ ID NO.10所示的第二分泌信号肽序列， 参考Homo sapiens(Human)密码子进行基因序列优化， 将优化后的基因插入到含有IgG轻链恒定区的pcDNA3.4载体， 得到轻链质粒； 8)将步骤7)得到的重链质粒和轻链质粒转染细胞进行抗体的表达； 所述步骤1)、 2)和3)没有时间先后顺序的限定。 2.根据权利要求1所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤2)所述第一染料包括FluoProbes 。

6、647H、 Allophycocyanin、 DyLight 633、 DyLight 650、 Atto 633或Cynaine Dye 5。 3.根据权利要求1所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤3)所述第二染料包括Pacific BlueTM、 DyLight 405或Atto390。 4.根据权利要求1所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤2)所述第一超滤离心、 第二超滤 离心或步骤3)所述第三超滤离心独立地为： 使用截留量50300kDa的超滤管2500 4000rpm离心1030min， 将抗原或标记后的抗原置换至PBS缓冲液中。 5.根据权利要求1所述的筛选方法， 其特征在于， 步。

7、骤3)所述第四超滤离心为： 用PBS缓 冲液稀释后， 使用截留量50300kDa的超滤管25004000rpm离心1030min， 弃去流穿液 体， 反复补加PBS缓冲液三次进行超滤离心浓缩。 6.根据权利要求1所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤5)所述分选为： 把每孔含有10 L 裂解液的96-PCR孔板放入分选舱， 设置每孔分选1个细胞模式， 上样； 划门圈出淋巴及单核 细胞， 根据FSC-A与FSA-H设置排除粘连细胞， 圈出对角线单一细胞； 对CD21+IgM-O-FMDV+A- FMDV+细胞进行射门分选。 7.根据权利要求1所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤6)所述扩增包括巢式。

8、PCR扩增方 法。 8.根据权利要求1所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤8)所述细胞包括Expi293悬浮细 权利要求书 1/2 页 2 CN 110372790 A 2 胞。 9.根据权利要求1或8所述的筛选方法， 其特征在于， 步骤8)所述重链质粒和所述轻链 质粒混合的摩尔比为1:(13)。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110372790 A 3 一种跨口蹄疫病毒血清型单克隆抗体的筛选方法 技术领域 0001 本发明涉及单克隆抗体筛选技术领域， 具体涉及一种跨口蹄疫病毒血清型单克隆 抗体的筛选方法， 即A型和O型口蹄疫病毒交互反应性单克隆抗体的筛选方法。 背景技术 0002 口蹄疫。

9、(foot-and-mouth disease， FMD)是严重危害猪、 牛与羊的重大动物疫病， 给我国畜牧养殖业造成了巨大损失。 口蹄疫病毒(FMDV)有七个血清型， 分别为O型、 A型、 Asia 1型、 C型、 SAT13型， 其中每个血清型又根据流行的区域划分为多个拓扑型(VP1， 85氨基酸同源性)。 我国主要流行O型和A型FMDV， 其中O型FMDV在我国主要有三个拓扑型： 东南亚型(SEA)、 中国古典型(Cathay)和中东-南亚型(ME-SEA)； A型FMDV主要存在亚洲拓扑 型中的G1和G2分支。 不同血清型之间不能提供交叉免疫保护， 甚至同一血清型内不同拓扑 型病毒之间。

10、也存在抗原结构的差异， 不能对异源毒株提供很好的交叉免疫保护。 可以看出 FMDV血清型众多， 虽然可以通过反向遗传技术制备良好的疫苗毒株， 但是针对不同血清型 之间具有交叉保护作用的疫苗毒株的研究仍是一个巨大难题， 因为对决定FMDV血清型间保 守抗原结构还没有清晰的认识。 跨血清型间保守抗原结构的解析始终是抗病毒免疫学研究 的一个焦点， 尽管对FMDV血清型内抗原位点有了大量的研究报道， 然而对于FMDV血清型间 保守的抗原结构研究仍然存在空白。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种跨口蹄疫病毒血清型单克隆抗体的筛选方法。 筛选方 法对FMDV血清型间保守抗原结构的鉴定具有重要指导。

11、意义。 可为广谱长效口蹄疫分子疫苗 的研制奠定基础， 为建立FMDV血清型非依赖性ELISA检测方法提供前提条件。 0004 本发明提供了一种跨口蹄疫病毒血清型单克隆抗体的筛选方法， 包括以下步骤： 0005 1)从免疫O型和A型FMDV双价灭活疫苗的动物血液样本中分离外周血单个核细胞； 0006 2)对O型FMDV 146S抗原进行第一超滤离心， 得到浓缩后的O型FMDV 146S抗原， 使 用第一染料对浓缩后的O型FMDV 146S抗原进行染色， 第二超滤离心， 得到标记后的O型FMDV 146S抗原； 0007 3)对A型FMDV 146S抗原进行第三超滤离心， 得到浓缩后的A型FMDV。

12、 146S抗原， 使 用第二染料对浓缩后的A型FMDV 146S抗原进行染色， 第四超滤离心， 得到标记后的A型FMDV 146S抗原； 0008 4)将步骤1)得到的外周血单个核细胞与步骤2)得到的标记后的O型FMDV 146S抗 原、 步骤3)得到的标记后的A型FMDV 146S抗原、 鼠抗牛CD21-RPE和鼠抗牛IgM-FITC荧光抗 体混合， 得到染色后的细胞； 0009 5)使用多色流式细胞仪分选能同时结合O型和A型FMDV的双阳性单个B细胞； 0010 6)对步骤5)得到的双阳性单个B细胞进行反转录， 得到cDNA后进行扩增， 得到单个 B细胞IgG抗体的重链可变区基因和轻链可变。

13、区基因； 说明书 1/11 页 4 CN 110372790 A 4 0011 7)将步骤6)得到的单个B细胞IgG抗体的重链可变区基因的框架区前端引入如SEQ ID NO.9所示的第一分泌信号肽序列， 参考Homo sapiens(Human)密码子进行基因序列优 化， 将优化后的基因插入到含有IgG重链恒定区的pcDNA3.4载体， 得到重链质粒； 将步骤6) 得到的单个B细胞IgG抗体的轻链可变区基因的框架区前端引入如SEQ ID NO.10所示的第 二分泌信号肽序列， 参考Homo sapiens(Human)密码子进行基因序列优化， 将优化后的基因 插入到含有IgG轻链恒定区的pcD。

14、NA3.4载体， 得到轻链质粒； 0012 8)将步骤7)得到的重链质粒和轻链质粒转染细胞进行抗体的表达； 0013 所述步骤1)、 2)和3)没有时间先后顺序的限定。 0014 优选的是， 步骤2)所述第一染料包括FluoProbes 647H、 Allophycocyanin、 DyLight 633、 DyLight 650、 Atto 633或Cynaine Dye 5。 0015 优选的是， 步骤3)所述第二染料包括Pacific BlueTM、 DyLight 405或Atto390。 0016 优选的是， 步骤2)所述第一超滤离心、 第二超滤离心或步骤3)所述第三超滤离心 独立地。

15、为： 使用截留量50300kDa的超滤管25004000rpm离心1030min， 将抗原或标记 后的抗原置换至PBS缓冲液中。 0017 优选的是， 步骤3)所述第四超滤离心为： 用PBS缓冲液稀释后， 使用截留量50 300kDa的超滤管25004000rpm离心1030min， 弃去流穿液体， 反复补加PBS缓冲液三次进 行超滤离心浓缩。 0018 优选的是， 步骤5)所述分选为： 把每孔含有10 L裂解液的96-PCR孔板放入分选舱， 设置每孔分选1个细胞模式， 上样； 划门圈出淋巴及单核细胞， 根据FSC-A与FSA-H设置排除 粘连细胞， 圈出对角线单一细胞； 对CD21+IgM-。

16、O-FMDV+A-FMDV+细胞进行射门分选。 0019 优选的是， 步骤6)所述扩增包括巢式PCR扩增方法。 0020 优选的是， 步骤8)所述细胞包括Expi293悬浮细胞。 0021 优选的是， 步骤8)所述重链质粒和所述轻链质粒混合的摩尔比为1:(13)。 0022 本发明提供了一种跨口蹄疫病毒血清型单克隆抗体的筛选方法。 本发明利用不同 荧光素标记不同的血清型抗原， 借助多色流式细胞仪直接分选获得结合不同抗原的特异性 B细胞， 设计出一种快速获得能与不同血清型抗原反应的单克隆抗体筛选方法， 能够得到可 以快速产生跨血清单克隆抗体， 获得该类型单克隆抗体可用于鉴定不同病毒血清型间保守 。

17、抗原位点， 可以为血清非依赖性ELISA检测方法的建立前提必要工具。 在本发明实施例中， 以口蹄疫病(foot-and-mouth disease virus， FMDV)为模式抗原， 成功筛选得到能与O、 A型 FMDV反应的单克隆抗体， 本发明所述筛选方法对FMDV血清型间保守抗原结构的鉴定具有重 要指导意义， 可为广谱长效口蹄疫分子疫苗的研制奠定基础， 为建立FMDV血清型非依赖性 ELISA检测方法提供前提条件。 附图说明 0023 图1为荧光染料标记的O、 A型FMDV抗原电镜观察(25000倍放大)； 0024 图2为流式分选O、 A型FMDV双阳性单个B细胞； 0025 图3为I。

18、gG抗体可变区基因PCR扩增； 0026 图4为表达和纯化后的IgG抗体； 0027 图5为IFA检测结果； 说明书 2/11 页 5 CN 110372790 A 5 0028 图6为间接ELISA实验结果； 0029 图7为WB实验结果。 具体实施方式 0030 本发明提供了一种跨口蹄疫病毒血清型单克隆抗体的筛选方法， 包括以下步骤： 0031 1)从免疫O型和A型FMDV双价灭活疫苗的动物血液样本中分离外周血单个核细胞； 0032 2)对O型FMDV 146S抗原进行第一超滤离心， 得到浓缩后的O型FMDV 146S抗原， 使 用第一染料对浓缩后的O型FMDV 146S抗原进行染色， 第。

19、二超滤离心， 得到标记后的O型FMDV 146S抗原； 0033 3)对A型FMDV 146S抗原进行第三超滤离心， 得到浓缩后的A型FMDV 146S抗原， 使 用第二染料对浓缩后的A型FMDV 146S抗原进行染色， 第四超滤离心， 得到标记后的A型FMDV 146S抗原； 0034 4)将步骤1)得到的外周血单个核细胞与步骤2)得到的标记后的O型FMDV 146S抗 原、 步骤3)得到的标记后的A型FMDV 146S抗原、 鼠抗牛CD21-RPE和鼠抗牛IgM-FITC荧光抗 体混合， 得到染色后的细胞； 0035 5)使用多色流式细胞仪分选能同时结合O型和A型FMDV的双阳性单个B细胞。

20、； 0036 6)对步骤5)得到的双阳性单个B细胞进行反转录， 得到cDNA后进行扩增， 得到单个 B细胞IgG抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因； 0037 7)将步骤6)得到的单个B细胞IgG抗体的重链可变区基因的框架区前端引入如SEQ ID NO.9所示的第一分泌信号肽序列， 参考Homo sapiens(Human)密码子进行基因序列优 化， 将优化后的基因插入到含有IgG重链恒定区的pcDNA3.4载体， 得到重链质粒； 将步骤6) 得到的单个B细胞IgG抗体的轻链可变区基因的框架区前端引入如SEQ ID NO.10所示的第 二分泌信号肽序列， 参考Homo sapiens(Hum。

21、an)密码子进行基因序列优化， 将优化后的基因 插入到含有IgG轻链恒定区的pcDNA3.4载体， 得到轻链质粒； 0038 8)将步骤7)得到的重链质粒和轻链质粒转染细胞进行抗体的表达； 0039 所述步骤1)、 2)和3)没有时间先后顺序的限定。 0040 本发明从免疫O型和A型FMDV双价灭活疫苗的动物血液样本中分离外周血单个核 细胞。 本发明对所述免疫的方法没有特殊限定， 采用本领域技术人员熟知的常规免疫方法 即可。 本发明对所述动物的类型没有特殊限定。 在本发明实施例中， 所述动物优选为牛。 当 所述动物优选为牛时， 本发明优选采取免疫O、 A型FMDV双价疫苗1430天， 更优选为。

22、21天的 牛外周血作为血液样本。 0041 本发明对O型FMDV 146S抗原进行第一超滤离心， 得到浓缩后的O型FMDV 146S抗 原， 使用第一染料对浓缩后的O型FMDV 146S抗原进行染色， 第二超滤离心， 得到标记后的O 型FMDV 146S抗原。 在本发明中， 所述第一染料包括FluoProbes 647H、 Allophycocyanin、 DyLight 633、 DyLight 650、 Atto 633或Cynaine Dye 5。 本发明对所述FluoProbes 647H、 Allophycocyanin、 DyLight 633、 DyLight 650、 Atto。

23、 633或Cynaine Dye 5的来源没有特殊 限定， 采用上述染料常规市售产品即可， 如Lightning-LinkTM RapidFluoProbes 647H标记 试剂盒(InnovaBiosciences， San Diego， USA)， Lightning-LinkTM Allophycocyanin标记试 剂盒(Innova Biosciences， San Diego， USA)， Lightning-LinkTM DyLight 633标记试剂盒 说明书 3/11 页 6 CN 110372790 A 6 (InnovaBiosciences， San Diego， US。

24、A)， Lightning-LinkTM DyLight 650标记试剂盒 (Innova Biosciences， San Diego， USA)， Lightning-LinkTM Atto 633标记试剂盒(Innova Biosciences， San Diego， USA)或Lightning-LinkTM Cynaine Dye 5标记试剂盒 (InnovaBiosciences， San Diego， USA)。 在本发明中， 所述第一超滤离心优选为用截留量50 300kDa， 更优选为100kDa的超滤管把O型FMDV 146S抗原置换至PBS缓冲液中， 2500 4000rp。

25、m离心1030min， 更优选4000rpm离心10min， 浓缩抗原至1mg/ml。 本发明对所述染色 的过程没有特殊限定， 依照上述染料试剂盒进行常规操作即可。 在本发明中， 所述第二超滤 离心优选为用50300kDa， 更优选为100kDa的超滤管离心， 25004000rpm离心1030min， 更优选4000rpm离心10min， 把标记后的抗原置换至PBS缓冲液中。 得到标记后的O型FMDV 146S抗原后， 本发明优选加入等体积100的甘油， 于-70进行保存。 0042 本发明对A型FMDV 146S抗原进行第三超滤离心， 得到浓缩后的A型FMDV 146S抗 原， 使用第二染。

26、料对浓缩后的A型FMDV 146S抗原进行染色， 第四超滤离心， 得到标记后的A 型FMDV 146S抗原。 在本发明中， 所述第二染料包括Pacific BlueTM、 DyLight405或Atto390。 本发明对所述Pacific BlueTM、 DyLight405或Atto390的来源没有特殊限定， 采用上述染料 常规市售产品即可， 如Pacific BlueTM抗体标记试剂盒(Thermo Scientific， USA)， Lightning-LinkTM DyLight405标记试剂盒(InnovaBiosciences， San Diego， USA)和 Lightning。

27、-LinkTM Atto390标记试剂盒(Innova Biosciences， San Diego， USA)。 在本发明 中， A型FMDV 146S抗原标记用染料优选与O型FMDV 146S标记抗原染料之间不相互干扰， 二 者所用通道之间无需调节荧光补偿。 在本发明中， 所述第三超滤离心优选为用截留量50 300kDa， 更优选为100kDa超滤管把A型FMDV 146S抗原置换至PBS缓冲液中， 调整抗原浓度至 1mg/ml。 本发明对所述染色的过程没有特殊限定， 依照上述染料试剂盒进行常规操作即可。 在本发明中， 所述第四超滤离心优选为吸取染色后的产物用10ml PBS缓冲液稀释， 。

28、转移至 50300kDa， 更优选为100kDa超滤管， 25004000rpm离心1030min， 更优选4000rpm离心 10min， 弃去流穿液体， 反复补加10ml PBS三次， 浓缩， 优选浓缩至100 L。 得到标记后的A型 FMDV 146S抗原后， 本发明优选加入等体积100甘油， -70保存。 0043 得到上述两种标记后的抗原后， 本发明优选采取电镜染色法对标记后的抗原进行 观察， 确认抗原粒子的完整性是否遭到破坏。 经验证， 本发明所述染色方法得到的标记后的 O型FMDV 146S抗原和标记后的A型FMDV 146S抗原的完整性并没有遭到破坏。 0044 本发明将外周血。

29、单个核细胞与标记后的O型FMDV 146S抗原、 标记后的A型FMDV 146S抗原、 鼠抗牛CD21-RPE和鼠抗牛IgM-FITC荧光抗体混合， 得到染色后的细胞。 在本发明 中， 所述荧光抗原优选包括FluoProbes 647H标记后的O型FMDV 146S抗原和Pacific Blue 标记后的A型FMDV 146S抗原。 0045 本发明使用多色流式细胞仪分选能同时结合O型和A型FMDV的双阳性单个B细胞。 本发明对所述多色流式细胞仪的型号没有特殊限定， 本发明优选使用BD FACSAria u流 式分选仪， 当使用BD FACSAria u流式分选仪时， 本发明优选将仪器参数设置。

30、为： 喷嘴大 小： 100 m； 分选模式： 单细胞模式； 分选速度： 10000细胞/秒； 振幅： 20psi； 震荡频率： 30kHz。 以上参数设置调节后关闭Sweat按钮， 使用Accudrop(货号： 642412)延迟微球执行计算液体 延迟时间。 在本发明中， 所述分选优选为： 把每孔含有10 L裂解液的96-PCR孔板放入分选 舱， 设置每孔分选1个细胞模式， 上样； 划门圈出淋巴及单核细胞， 根据FSC-A与FSA-H设置排 说明书 4/11 页 7 CN 110372790 A 7 除粘连细胞， 圈出对角线单一细胞； 对CD21+IgM-O-FMDV+A-FMDV+细胞进行射。

31、门分选。 在本发 明中， 分选前， 优选调节分选舱中96-PCR孔板位置， 直至分选细胞准确落入板孔正中央(通 过使用粘有封口膜的96孔板， 设置每孔分选60个细胞模式进行调节， 确保细胞能分选到每 孔正中心) 0046 本发明对双阳性单个B细胞进行反转录， 得到cDNA后进行扩增， 得到单个B细胞IgG 抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因。 本发明对所述反转录方法没有特殊限定， 采用 常规反转录方法即可。 在本发明中， 所述扩增包括巢式PCR扩增方法。 当本发明所述动物为 牛时， 本发明优选采用核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的引物进行扩增。 0047 本发明将单个B细胞IgG抗体。

32、的重链可变区基因的框架区前端引入如SEQ ID NO.9 所示的第一分泌信号肽序列， 参考Homo sapiens(Human)密码子进行基因序列优化， 将优化 后的VH基因插入到含有IgG重链恒定区的pcDNA3.4载体， 得到重链质粒； 将步骤6)得到的单 个B细胞IgG抗体的轻链可变区基因的框架区前端引入如SEQ ID NO.10所示的第二分泌信 号肽序列， 参考Homo sapiens(Human)密码子进行基因序列优化， 将优化后的VL基因插入到 含有IgG轻链恒定区的pcDNA3.4载体， 得到轻链质粒。 0048 本发明将重链质粒和轻链质粒混合后转染细胞进行抗体的表达。 在本发明。

33、中， 所 述细胞包括Expi293悬浮细胞。 在本发明中， 所述重链质粒和所述轻链质粒混合的摩尔比为 1:(13)。 具体地， 本发明通过瞬时转染Expi293悬浮细胞表达抗体， 取重链质粒与轻链质 粒进行混匀， 加入OptiPROTM SFM培养基进行稀释， 同时取等量OptiPROTM SFM培养基稀释 ExpiFectamineTM 293转染试剂， 随后将稀释好的质粒和转染试剂混合， 室温作用5min。 0049 下面结合具体实施例对本发明所述的一种跨口蹄疫病毒血清型单克隆抗体的筛 选方法做进一步详细的介绍， 本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。 0050 实施例1 0051 1.。

34、FMDV抗原标记方案 0052 1.1O型FMDV 146S抗原标记方案 0053 使用Lightning-LinkTM Rapid FluoProbes 647H标记试剂盒(Innova Biosciences， San Diego， USA)标记O型FMDV 146S抗原。 首先用截留量100kDa超滤管把O型 FMDV 146S抗原置换至PBS缓冲液中。 4000rpm离心10min， 浓缩抗原至1mg/ml(OD2607.6约 等于1mg/ml)。 取100 L146S抗原加入10 L LL-modifierreagent， 轻轻混匀， 然后从中吸取 100 L加入到一管Lightni。

35、ng-LinkTM mix反应染料， 轻轻抽吸把粉末重悬， 室温(20-25)作 用3小时。 加入10 L LL-quencherreagent， 作用30分钟， 以终止反应。 然后用100kDa超滤管 离心， 4000rpm离心10min， 把标记后的抗原置换至PBS缓冲液中。 加入等体积100甘油， -70 保存。 标记后的抗原命名为O-FMDV 146S-FluoProbes 647H。 0054 1.2A型FMDV 146S抗原标记方案 0055 为避免与O型FMDV 146S标记抗原之间荧光补偿的相互干扰， 选择Pacific BlueTM 抗体标记试剂盒(Thermo Scient。

36、ific， USA)标记A型FMDV146S抗原。 首先用截留量100kDa超 滤管把A型FMDV 146S抗原置换至PBS缓冲液中， 调整抗原浓度至1mg/ml(OD2607.6约等于 1mg/ml)。 取10 L碳酸氢钠缓冲液(1M， pH8.3)加入100 L146S抗原， 轻轻混匀， 然后从中吸 取100 L加入到一管反应染料， 上下颠倒10次， 以充分溶解染料。 室温(20-25)孵育1小时， 期间每隔10-15分钟上下颠倒3次。 然后吸取染色后的产物用10ml PBS缓冲液稀释， 转移至 说明书 5/11 页 8 CN 110372790 A 8 100kDa超滤管， 4000rp。

37、m离心10min， 弃去流穿液体， 反复补加10ml PBS三次， 浓缩标记后的 抗原至100 L。 加入等体积100甘油， -70保存。 标记后的抗原命名为A-FMDV 146S- Pacific Blue。 0056 1.3电镜染色 0057 为证实选择上述荧光染料标记O、 A型FMDV抗原粒子不会对抗原粒子完整性造成破 坏， 因此对标记后的抗原进行负染色和透射电镜观察。 取标记后的抗原4微升轻轻加入铜网 上， 室温作用2min， 然后用滤纸侧向吸干样本。 然后用镊子夹住样本在1磷酸钨染色液中 进行穿梭染色， 采用3滴法， 每滴染液作用10秒， 然后用滤纸吸取染液， 晾干， 电镜观察。 0。

38、058 2.多色流式染色方案 0059 2.1外周血单个核细胞(PBMCs)分离 0060 采取免疫O、 A型FMDV双价疫苗21天(14天-30天区间)的牛外周血， 使用淋巴细胞分 离液(密度1.083g/mL)从中分离外周血单个核细胞(PBMCs)， 具体操作如下： 0061 (1)淋巴细胞分离液和PBS室温平衡， 加入6mL淋巴细胞分离液到15mL离心管中。 0062 (2)用PBS按1:1比例稀释牛EDTA抗凝血， 吸取8mL稀释后全血加入到淋巴细胞分离 液上层， 1200g离心30min。 0063 (3)吸取乳白色层外周血单个核细胞(PBMCs)细胞加入含有1/2体积细胞分选液 (。

39、含有1BSA、 2mM EDTANa2的PBS)的15mL离心管中， 600g离心5min。 0064 (4)弃去上层液体， 加入12mL红细胞裂解液， 室温裂解12min后加入细胞分选 液， 250g离心10min。 0065 (5)弃去上层液体， 用细胞分选液洗细胞两遍， 400g离心5min。 弃去上层液体， 加 细胞分选液吹散为单个细胞， 最后得到的细胞即为外周血单个核细胞(PBMCs)， 计数。 0066 2.2流式细胞染色 0067 (1)取107个富集的B细胞重悬于200 L细胞分选液， 加入0.5 g O-FMDV 146S- FluoProbes 647H抗原、 0.5 g 。

40、A-FMDV 146S-Pacific Blue抗原、 2 g鼠抗牛CD21-RPE荧光 抗体(Bio-Rad， USA)和1 g鼠抗牛IgM-FITC荧光抗体(Bio-Rad， USA)， 冰上作用25min。 取相 同细胞设置同型对照和减一对照。 同时设置单阳管， 用于调节补偿。 0068 (2)细胞分选液洗细胞一次， 400g， 4离心5min。 0069 (3)重悬细胞于500 L细胞分选液中， 避光于冰上， 准备上机分选细胞。 0070 3.分选O、 A型FMDV交互反应性单个B细胞 0071 使用BD FACSAriau流式分选仪分选FMDV特异性单个B细胞。 仪器设置参数为， 喷。

41、 嘴大小： 100 m； 分选模式： 单细胞模式； 分选速度： 10000细胞/秒； 振幅： 20psi； 震荡频率： 30kHz。 以上参数设置调节后关闭Sweat按钮， 使用Accudrop(货号： 642412)延迟微球执行计 算液体延迟时间。 然后调节分选舱中96-PCR孔板位置， 直至分选细胞准确落入板孔正中央 (可通过使用粘有封口膜的96孔板， 设置每孔分选60个细胞模式进行调节)。 以上设置均完 成后， 把每孔含有10 L裂解液的96-PCR孔板放入分选舱， 开始上样。 划门圈出淋巴及单核细 胞， 根据FSC-A与FSA-H设置排除粘连细胞， 圈出对角线单一细胞。 然后对CD21。

42、+IgM-O-FMDV+ A-FMDV+细胞进行射门分选， 即可获得O、 A型FMDV交互反应性单个B细胞。 0072 4.单个B细胞来源IgG抗体可变区基因扩增 0073 4.1单细胞cDNA分子制备 说明书 6/11 页 9 CN 110372790 A 9 0074 分选完成后， 每孔加入1 L终止液， 室温作用5min， 终止反应。 然后每孔加入4 L SuperScriopt VILO mix溶液和6 L DNase/RNase-free water， 混匀。 1500rpm， 4离心 5min。 PCR仪进行反转录扩增。 0075 设置反应条件如表1 0076 表1 反转录扩增条件。

43、 0077 0078 0079 获得的cDNA-20存储， 用于后续PCR扩增。 0080 4.2单细胞cDNA的PCR扩增 0081 使用表2中所示引物， 采取巢式PCR方法对牛单个B细胞IgG抗体的重链可变区(VH) 基因和lambda轻链可变区(VL)基因。 0082 表2 扩增牛IgG VH和VL基因的引物 0083 0084 序列中的简并碱基注释， SC或G， YC或T， RA或G. 0085 第一轮PCR反应体系 0086 扩增IgG VH和VL基因的第一轮反应体系如表3， 除引物和模板不同外， 其余成分均 按照该体系进行。 0087 表3 第一轮PCR反应体系 0088 0089。

44、 因为退火温度不同， 所以不同引物所涉及的反应程序不同， 具体反应程序如表4和 说明书 7/11 页 10 CN 110372790 A 10 表5： 0090 表4 IgG VL基因第一轮扩增程序 0091 0092 0093 表5 IgG VH基因第一轮扩增程序 0094 0095 第二轮PCR反应体系 0096 扩增IgG VH和VL基因的第二轮反应体系， 也是除引物和模板(模板为第一轮PCR扩 增产物)不同， 其余成分均按照如表6所示体系进行： 0097 表6 第二轮PCR反应体系 0098 0099 第二轮PCR扩增IgG VH和VL基因的扩增程序相同， 反应程序如表7所示。 010。

45、0 表7 IgG VH和VL基因的扩增程序 说明书 8/11 页 11 CN 110372790 A 11 0101 0102 4.3 PCR产物测序 0103 取5 L第二轮扩增的PCR产物， 用1.5琼脂糖凝胶进行电泳， 观察扩增结果。 成功 扩增出VH和VL基因的样本， 将剩余的45 L产物进行DNA测序， 使用DNASTAR和SnapGene软件 分析、 比对测序结果。 0104 5.载体构建与无内毒素质粒制备 0105 将 扩 增的 I g G 抗 体 V H 基 因的 框 架区 (F R 1) 前 端 引入 分 泌 信号 肽 序 列 “MNPLWTLLFVLSAPRGVLS” (S。

46、EQ ID NO.9)， 然后参考Homo sapiens(Human)密码子进行基因 序列优化， 通过Not1和Nhel酶切位点插入到含有牛IgG重链恒定区的pcDNA3.4载体。 将扩增 的VL基因框架区(FR1)前端引入分泌信号肽序列 “MAWSPLFLTLVAVYTGS” (SEQ ID NO.10)， 并 参考Homo sapiens(Human)密码子进行基因序列优化， 然后通过Nhe1和Ale1酶切位点插入 到含有IgG轻链恒定区的pcDNA3.4载体上。 以上抗体恒定区基因C末端均引入6His标签和 Myc标签， 以利于检测和纯化。 序列合成与载体构建委托金唯智生物技术公司进行。

47、合成。 使 用无内毒素质粒大量抽提试剂盒(TIANGEN， 北京， 中国)， 严格按照试剂盒说明书对构建的 抗体表达质粒进行无内毒素质粒制备。 0106 6.抗体的表达与纯化 0107 通过瞬时转染Expi293悬浮细胞表达抗体， 按2:1的比例取重链质粒15 g与轻链质 粒30 g进行混匀， 加入250 L OptiPROTM SFM培养基进行稀释， 同时取等量OptiPROTM SFM培 养基稀释ExpiFectamineTM 293转染试剂， 随后将稀释好的质粒和转染试剂混合， 室温作用 5min。 将该混合物缓慢加入至1.5108个Expi293细胞中。 转染后Expi293细胞置于3。

48、7恒 温悬浮培养箱， 悬浮培养18h后， 补加150 L Expi293TM Enhancer和6mL Expi293TM Feed。 37 继续培养9d后， 按10 000g离心30min， 收取细胞培养上清， 经0.22 m滤器过滤， 用于后 续抗体纯化。 使用HiTrap TALON柱子在AKAT蛋白纯化仪上进行抗体纯化， 使用250mM咪唑的 PBS液洗脱抗体， 然后装入透析袋置于PBS液中透析3次， 每次3h。 透析后的抗体， 用PEG 8 000进行浓缩， 浓缩后进行SDS-PAGE电泳分析。 0108 O、 A型FMDV交互反应的抗体活性验证 0109 7.1间接免疫荧光(ind。

49、irect immunofluorescence assay， IFA)试验 0110 将BHK-21细胞接入24孔板中， 待细胞生长至80时， 按MOI1的比例将O型FMDV (O/HN/CHA93毒株)与A型FMDV(A/GDMM/CHA/2013毒株)分别接种24孔细胞培养板， 同时设置 未接毒正常细胞对照， 37细胞培养箱中孵育4h后， 收集上清灭活处理。 然后加入-20预 冷的甲醇 丙酮(1:1)固定液固定细胞， 室温作用20min。 PBS洗细胞3次， 按5 g/mL浓度加入 纯化的抗体， 37孵育1h。 PBS洗3次， 加入工作浓度的荧光素标记兔抗牛IgG-FITC(Thermo。

50、 说明书 9/11 页 12 CN 110372790 A 12 Scientific， USA)， 37孵育30min。 PBS洗细胞5次， 荧光显微镜观察荧光信号并拍照记录。 0111 7.2蛋白印迹(WesternBlot， WB)试验 0112 分别取浓度为0.1mg/mL的O型FMDV(O/HN/CHA93毒株)与A型FMDV(A/GDMM/CHA/ 2013毒株)抗原进行SDS-PAGE电泳， 然后将分离的蛋白条带转印至硝酸纤维(NC)膜， 用含有 5脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭2h， 洗涤后， 用含5脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释抗体至工 作浓度(2 g/mL)， 室温孵育2h， 。