从头孢菌素C发酵液中分离纯化脱乙酰氧基头孢菌素C的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910853175.X (22)申请日 2019.09.10 (71)申请人 丽珠集团新北江制药股份有限公司 地址 511518 广东省清远市人民一路 (72)发明人 张勇陈倩倩王珂黄恩贤 李想唐阳刚 (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 44205 代理人 许飞 (51)Int.Cl. C07D 501/28(2006.01) C07D 501/12(2006.01) (54)发明名称 一种从头孢菌素C发酵液中分离纯化脱乙酰 氧基头孢菌素C的方法 (57。

2、)摘要 本发明公开了一种从头孢菌素C发酵液中分 离纯化脱乙酰氧基头孢菌素C的方法。 该方法包 括以下步骤： 1)取头孢菌素C发酵液进行浓缩， 得 头孢菌素C浓缩液； 2)将头孢菌素C浓缩液进行液 相色谱制备柱分离， 得脱乙酰氧基头孢菌素C。 本 发明首次从头孢菌素C发酵液中分离出DOCPC， 并 且本发明分离纯化得到的DOCPC的纯度在97以 上， 这说明本发明能够有效地从头孢菌素C发酵 液中分离纯化得到高纯度的DOCPC， 这不仅为 DOCPC的药理研究提供了可靠的基础， 同时也为 进一步得到高纯度的DOCPC奠定了基础， 具有非 常重要的现实意义。 权利要求书1页 说明书6页 附图9页 C。

3、N 110627816 A 2019.12.31 CN 110627816 A 1.一种从头孢菌素C发酵液中分离纯化脱乙酰氧基头孢菌素C的方法， 其特征在于： 包 括如下步骤： 1)取头孢菌素C发酵液进行浓缩， 得头孢菌素C浓缩液； 2)将头孢菌素C浓缩液进行液相色谱制备柱分离， 得脱乙酰氧基头孢菌素C。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 步骤1)浓缩至头孢菌素C浓缩液的体积为 头孢菌素C发酵液体积的1/61/4。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 步骤2)的液相色谱制备柱处理， 包括如下 步骤： )将头孢菌素C浓缩液进行第一次液相色谱制备柱处理， 得溶液 ； )将溶液。

4、 进行第二次液相色谱制备柱处理， 得脱乙酰氧基头孢菌素C。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于： 步骤 )采用C18填料色谱制备柱进行处理； 优选地， 制备柱填料为Peace ODS。 5.根据权利要求3或4所述的方法， 其特征在于： 步骤 )利用流动相A为乙腈， 流动相B为 体积分数为0.1的甲酸水溶液进行梯度洗脱； 优选地， 梯度洗脱中洗脱时间和流动相的体 积比为： 060min 112流动相A。 6.根据权利要求3或4所述的方法， 其特征在于： 步骤 )所述色谱制备柱中的流速为10 12mL/min； 优选地， 步骤 )所述色谱制备柱中的柱温为2025。 7.根据权利要求3所述的。

5、方法， 其特征在于： 步骤)采用Sepax GP-C18或Welch XtimateC18色谱制备柱进行处理。 8.根据权利要求3或7所述的方法， 其特征在于： 步骤)利用流动相C为体积比为0.1： 100的甲酸乙腈混合溶液， 流动相D为体积分数为0.1的甲酸水溶液进行梯度洗脱； 优选 地， 梯度洗脱中洗脱时间和流动相的体积比为： 040min 3.5流动相C。 9.根据权利要求3或7所述的方法， 其特征在于： 步骤)所述色谱制备柱中的流速为 3.03.5mL/min； 优选地， 步骤)所述色谱制备柱中的柱温为30。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110627816 A 2 一种从头孢菌素。

6、C发酵液中分离纯化脱乙酰氧基头孢菌素C的 方法 技术领域 0001 本发明涉及分离纯化领域， 尤其涉及一种从头孢菌素C发酵液中分离纯化脱乙酰 氧基头孢菌素C的方法。 背景技术 0002 头孢菌素属 内酰胺类抗生素家族成员， 目前占我国抗生素类药物市场份额高达 51， 青霉素约占17。 头孢菌素C(CPC)生物合成类似于青霉素， 为确定发酵终点、 合理补 料以便控制发酵过程， 必须有效地检测发酵过程中培养基成份、 早期杂质及发酵产物与副 产物比例。 0003 头孢菌素C发酵过程中包括有CPC、 脱乙酰头孢菌素C(DCPC)、 脱乙酰氧基头孢菌素 C(DOCPC)等物质， 脱乙酰氧基头孢菌素C(D。

7、OCPC)是头孢菌素C(CPC)发酵过程中的副产物， 为头孢菌素C的结构类似物。 由于脱乙酰氧基头孢菌素C可通过结构修饰转化为某些重要的 新型头孢类药物的中间体， 引起人们的广泛关注。 0004 目前尚未有对DOCPC进行纯化分离的相关报道， 如何从头孢菌素C发酵液中分离纯 化得到高纯度的DOCPC具有一定难度且具有很重要的现实意义。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种从头孢菌素C发酵液中分离纯化脱乙酰氧基头孢菌素 C的方法。 0006 本发明所采取的技术方案是： 0007 本发明的目的之一在于提供一种从头孢菌素C发酵液中分离纯化脱乙酰氧基头孢 菌素C 的方法， 包括如下步骤： 00。

8、08 1)取头孢菌素C发酵液进行浓缩， 得头孢菌素C浓缩液； 0009 2)将头孢菌素C浓缩液进行液相色谱制备柱分离， 得脱乙酰氧基头孢菌素C。 0010 优选地， 步骤1)浓缩至头孢菌素C浓缩液的体积为头孢菌素C发酵液体积的1/6 1/4。 0011 优选地， 步骤2)的液相色谱制备柱处理， 包括如下步骤： 0012 )将头孢菌素C浓缩液进行第一次液相色谱制备柱处理， 得溶液 ； 0013 )将溶液 进行第二次液相色谱制备柱处理， 得脱乙酰氧基头孢菌素C。 0014 优选地， 步骤 )采用C18填料色谱制备柱进行处理； 优选地， 制备柱填料为Peace ODS。 0015 优选地， 步骤 )。

9、利用流动相A为乙腈， 流动相B为体积分数为0.1的甲酸水溶液进 行梯度洗脱。 0016 优选地， 步骤 )梯度洗脱中洗脱时间和流动相的体积比为： 060min 112 流动相A。 说明书 1/6 页 3 CN 110627816 A 3 0017 优选地， 步骤 )上述色谱制备柱中的流速为1012mL/min； 更优选为10mL/min。 0018 优选地， 步骤 )上述色谱制备柱中的柱温为2025。 0019 优选地， 步骤 )中的检测波长为254nm。 0020 优选地， 步骤)采用Sepax GP-C18或Welch Xtimate C18色谱制备柱进行处理。 0021 优选地， 步骤)。

10、利用流动相C为体积比为0.1： 100的甲酸乙腈混合溶液， 流动相D 为体积分数为0.1的甲酸水溶液进行梯度洗脱。 0022 优选地， 步骤)梯度洗脱中洗脱时间和流动相的体积比为： 040min 3.5流动 相C。 0023 优选地， 步骤)色谱制备柱中的流速为3.03.5mL/min。 0024 优选地， 步骤)色谱制备柱中的柱温为30。 0025 优选地， 步骤)中的检测波长为254nm。 0026 本发明的有益效果是： 0027 本发明首次从头孢菌素C发酵液中分离出DOCPC， 并且本发明分离纯化得到的 DOCPC 的纯度在97以上， 这说明本发明能够有效地从头孢菌素C发酵液中分离纯化得。

11、到 高纯度的 DOCPC， 这不仅为DOCPC的药理研究提供了可靠的基础， 同时也为进一步得到高纯 度的 DOCPC奠定了基础， 具有非常重要的现实意义。 附图说明 0028 图1为实施例1头孢菌素C浓缩液的高效液相色谱图； 0029 图2为实施例1溶液 的高效液相色谱图； 0030 图3为实施例1分离纯化得到的脱乙酰氧基头孢菌素C的高效液相色谱图； 0031 图4为实施例1分离纯化得到的脱乙酰氧基头孢菌素C的核磁共振氢谱图； 0032 图5为实施例1分离纯化得到的脱乙酰氧基头孢菌素C的核磁共振碳谱图； 0033 图6为实施例1分离纯化得到的脱乙酰氧基头孢菌素C的红外光谱图； 0034 图7为。

12、实施例1分离纯化得到的脱乙酰氧基头孢菌素C的紫外光谱图； 0035 图8为实施例1分离纯化得到的脱乙酰氧基头孢菌素C的质谱图； 0036 图9为对比例1分离纯化得到的脱乙酰氧基头孢菌素C的制备液相色谱图； 0037 图10为实施例1分离纯化得到的脱乙酰氧基头孢菌素C的制备液相色谱图。 具体实施方式 0038 下面进一步列举实施例以详细说明本发明。 同样应理解， 以下实施例只用于对本 发明进行进一步说明， 不能理解为对本发明保护范围的限制， 本领域技术人员根据本发明 阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。 下述示例具体的工 艺参数等也仅是合适范围中的一个示例， 即本领域技。

13、术人员可以通过本文的说明做合适范 围内的选择， 而并非要限定于下文示例的具体数据。 0039 下述实施例中的头孢菌素C发酵液由焦作健康元生物制品有限公司提供。 0040 实施例1 0041 一种从头孢菌素C发酵液中分离纯化脱乙酰氧基头孢菌素C的方法， 包括如下步 骤： 说明书 2/6 页 4 CN 110627816 A 4 0042 1)取一定量的头孢菌素C发酵液， 经旋转蒸发仪(水浴温度40)减压浓缩至原体 积的1/61/4， 得头孢菌素C浓缩液； 0043 2)将头孢菌素C浓缩液进行高压液相色谱制备柱处理， 具体包括如下步骤： 0044 )将头孢菌素C浓缩液进行第一次高压液相色谱制备柱处。

14、理， 高压液相色谱柱处 理条件为： 采用C18填料色谱制备柱， 填料为Peace ODS， 流动相A为乙腈， 流动相B为体积分 数为0.1的甲酸水溶液进行梯度洗脱， 梯度洗脱的洗脱时间和流动相的体积比为： 0 60min 112流动相A， 色谱制备柱中的流速为10mL/min， 色谱制备柱的柱温为2025 ， 检测波长为254nm， 得溶液 ； 0045 )将溶液 进行第二次高压液相色谱制备柱处理， 高压液相色谱柱处理条件为： 采用色谱制备柱为Sepax GP-C18， 流动相C为体积比为0.1： 100的甲酸-乙腈溶液， 流动相D 为体积分数为0.1的甲酸水溶液进行梯度洗脱， 梯度洗脱中的洗。

15、脱时间和流动相的体积 比为： 040min 3.5流动相C， 色谱制备柱中的流速为3.5mL/min， 色谱制备柱的柱温为 30， 检测波长为254nm， 后经旋转蒸发仪(水浴温度40)浓缩， 再将浓缩液经冻干机冻干 后得脱乙酰氧基头孢菌素C。 0046 检测分析： 0047 将实施例1中步骤1)制备得到的头孢菌素C浓缩液进行高效液相色谱分析， 检测条 件如下： 色谱柱为ZORBAX SB-Aq， 4.6250mm， 5 m， 流动相A为水-0.1FA， 流动相B为乙腈- 0.1FA进行梯度洗脱， 梯度洗脱中洗脱时间和流动相A的体积比的顺序为： 020min： 99 95.5， 2030min。

16、： 95.590， 3040min： 9080， 色谱柱中的流速为1.0 mL/ min， 色谱柱的柱温为30， 检测波长为254nm， 色谱图见图1， 数据见下表1。 0048 表1 0049 峰编号 峰名称 保留时间(min) 峰面积 峰高 相对峰面积 1 杂质1 5.855 35.946 242.641 4.69 2 杂质2 7.857 11.689 44.166 1.53 3 杂质3 8.627 3.699 21.331 0.48 4 杂质4 9.15 117.115 429.885 15.29 5 杂质5 9.98 3.923 7.483 0.51 6 杂质6 10.69 4.298。

17、 13.546 0.56 7 杂质7 11.265 3.147 9.908 0.41 8 杂质8 11.577 20.761 95.36 2.71 9 杂质9 12.027 1.109 4.267 0.14 10 杂质10 12.495 5.486 21.273 0.72 11 DOCPC 12.873 14.981 57.305 1.96 12 杂质11 13.43 0.184 1.075 0.02 13 杂质12 13.732 0.663 1.765 0.09 14 杂质13 14.47 3.932 11.55 0.51 15 杂质14 15.227 0.259 0.779 0.03 16。

18、 杂质15 15.913 0.785 3.708 0.1 17 杂质16 16.183 4.233 12.731 0.55 说明书 3/6 页 5 CN 110627816 A 5 18 CPC 17.872 532.988 1755.521 69.57 19 杂质17 18.925 0.968 2.482 0.13 0050 由图1和表1可知： 头孢菌素C浓缩液中含有DOCPC， 同时含有较多的杂质， 且DOCPC 周围存在与其保留时间相差不大的其他杂质， 因此存在非常大的分离难度。 0051 将经步骤 )处理得到的溶液 按照上述高效液相色谱分析方法进行分析， 结果见 图2 及表2： 005。

19、2 表2 0053 峰名称 保留时间(min) 峰面积 峰高 相对峰面积() 1 9.678 0.2179 0.85 1.13 2(杂质7) 11.238 11.4998 46.11 59.57 3(杂质9) 12.202 2.1694 8.65 11.24 4(DOCPC) 12.828 5.4169 19.88 28.06 0054 由图2和表2可知： 经步骤 )处理后， 溶液 中只剩3个杂质， 并且DOCPC的相对峰面 积(即DOCPC的含量)也有相依提高， 这说明经步骤 )能有效去除大部分杂质。 0055 将经步骤)处理得到的脱乙酰氧基头孢菌素C溶于水得脱乙酰氧基头孢菌素C水 溶液并按。

20、上述高效液相色谱分析方法进行分析， 结果见图3； 0056 由图3可知： 实施例1制备得到的脱乙酰氧基头孢菌素C和原头孢菌素C浓缩液中的 脱乙酰氧基头孢菌素C的保留时间基本一致， 这说明， 本发明成功分离得到脱乙酰氧基头孢 菌素C， 同时采用峰面积归一化方法计算得到实施例1得到的脱乙酰氧基头孢菌素C的纯度 为 97； 0057 进一步地， 将实施例1制备得到的脱乙酰氧基头孢菌素C进行核磁共振(氢谱、 碳 谱)、 红外光谱、 紫外光谱及质谱分析， 结果见图48， 氢谱、 碳谱数据详见下表3； 0058 表3 说明书 4/6 页 6 CN 110627816 A 6 0059 0060 注： 表3。

21、中的 “-” 表示没有该数据。 0061 由图48、 表3进一步分析得到本发明分离纯化得到的结构式如下， 该结构即为脱 乙酰氧基头孢菌素C， 这进一步说明了本发明成功分离纯化得到脱乙酰氧基头孢菌素C： 0062 0063 对比例1 0064 对比例1的分离纯化步骤同实施例1， 不同之处在于步骤)中的梯度洗脱中的洗 脱时间和流动相的体积比为： 040min 4.5流动相C， 也就是说步骤)的具体步骤如下： 0065 步骤)将溶液 进行第二次高压液相色谱制备柱处理， 高压液相色谱柱处理条件 为： 采用色谱制备柱为Sepax GP-C18， 流动相C为体积比为0.1： 100的甲酸-乙腈溶液， 流动。

22、 相 D为体积分数为0.1的甲酸水溶液进行梯度洗脱， 梯度洗脱中的洗脱时间和流动相的 体积比的顺序为： 040min 4.5流动相C， 色谱制备柱中的流速为3.5mL/min， 色谱制备柱 的柱温为30， 检测波长为254nm， 后经旋转蒸发仪(水浴温度40)浓缩， 再将浓缩液经冻 干机冻干后得脱乙酰氧基头孢菌素C。 0066 经对比例1和实施例1不同的步骤)处理得到的制备液相色谱图见图9和图10， 由 图 9和图10可知： 图9的主峰(即： DOCPC)和杂质的保留时间远比图10的接近， 这说明经对比 例1处理后其无法将DOCPC与杂质进行有效分离， 需要后续再继续分离纯化才能得到纯度较 说。

23、明书 5/6 页 7 CN 110627816 A 7 高的DOCPC， 而实施例1则无需再进行分离纯化即可获得纯度较高的DOCPC。 说明书 6/6 页 8 CN 110627816 A 8 图1 图2 说明书附图 1/9 页 9 CN 110627816 A 9 图3 说明书附图 2/9 页 10 CN 110627816 A 10 图4 说明书附图 3/9 页 11 CN 110627816 A 11 图5 说明书附图 4/9 页 12 CN 110627816 A 12 图6 说明书附图 5/9 页 13 CN 110627816 A 13 图7 说明书附图 6/9 页 14 CN 110627816 A 14 图8 说明书附图 7/9 页 15 CN 110627816 A 15 图9 说明书附图 8/9 页 16 CN 110627816 A 16 图10 说明书附图 9/9 页 17 CN 110627816 A 17 。