基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910711923.0 (22)申请日 2019.08.02 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 马梁李雨亭吴钰桐张斌 杨华勇 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 郑海峰 (51)Int.Cl. C12N 5/09(2010.01) B29C 64/112(2017.01) B29C 64/321(2017.01) B33Y 10/00(2015.01) B33Y 40/00。

2、(2015.01) (54)发明名称 一种基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型 的构建方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于生物三维打印的体 外胶质母细胞瘤(GBM)侵袭模型的构建方法， 属 于组织工程和生物三维(3D)打印领域。 此方法采 用含细胞的水凝胶作为 “生物墨水” ， 利用生物三 维打印机构建体外GBM侵袭模型。 模型结构由载 有正常人脑胶质细胞的水凝胶打印而成， 并接种 神经胶质瘤细胞团。 此模型对研究GBM的侵润性 生长具有重要意义， 有望为多形性神经胶质母细 胞瘤的治疗方法研究提供帮助。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 110564690 A 2019.12.1。

3、3 CN 110564690 A 1.一种基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法， 其特征在于， 包括如下步 骤： 1)配制含有人脑胶质细胞的生物墨水； 所述生物墨水的溶剂为纯净水， 生物墨水成分 包括透明质酸、 藻酸盐和明胶； 所述透明质酸在生物墨水中的含量为0.01-0.02g/ml， 所述 藻酸盐在所述生物墨水中的含量为0.01-0.02g/ml， 所述明胶在所述生物墨水中的含量为 0.05-0.15g/ml； 2)将所述生物墨水加载到多喷头的微挤出式生物三维打印机的供料系统中， 按照指定 路径打印支架结构； 得到的支架结构用氯化钙溶液浸渍； 3)在步骤2)得到的支架结构中均匀接。

4、种GBM细胞团； 4)将接种了GBM的支架结构置于细胞培养箱持续培养， 每隔2-3天换液， 获得具有高细 胞存活率的体外GBM侵袭模型， 并在培养的第1,7,14天分别提取培养结构的RNA进行测序。 2.如权利要求1所述的基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法， 其特征在 于， 所述的生物墨水中， 所述透明质酸在所述生物墨水中的选用含量为0.02g/ml， 所述藻酸 盐在所述生物墨水中的选用含量为0.02g/ml， 所述明胶在所述生物墨水中的选用含量为 0.010g/ml。 3.如权利要求1所述的基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法， 其特征在 于， 所述生物墨水中还包括作为。

5、诱导侵袭因子的葡萄糖， 葡萄糖的加入量为0.005-0.02g/ ml。 4.如权利要求1所述的基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法， 其特征在 于， 所述的支架结构为单层、 多层的网格结构或立体框架结构。 5.如权利要求1所述的基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法， 其特征在 于， 所述的步骤4)中， 培养过程使用的培养基由普通细胞培养基、 胎牛血清以及双抗配制而 成。 6.如权利要求1所述的基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法， 特征在于， 所述的GBM细胞团的获得方法为： 贴壁培养U87细胞， 当培养瓶底部贴壁的U87细胞生长增殖到占90体积时， 离心并用 。

6、培养基吹打混匀， 计算细胞浓度， 稀释到100-200万个/毫升， 吸取10 l的含U87细胞的培养 液滴， 滴在培养皿盖反面， 在培养皿内加入5毫升的PBS用来形成水合环境腔， 最后盖上培养 皿盖， 用封口膜包裹， 置入37摄氏度细胞培养箱； 悬滴内分散的细胞在重力作用下逐渐聚集 形成若干片状聚集体， 片状聚集体逐渐相互靠近聚合， 经过6-8天的培养后， 最终形成直径 为200-300 m的球体， 即为GBM细胞团。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110564690 A 2 一种基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法 技术领域 0001 本发明涉及一种基于生物三维打印的体外GBM。

7、侵袭模型的构建方法， 用于构建具 有高细胞存活率的体外GBM侵袭模型， 属于组织工程技术和生物三维(3D)打印领域。 背景技术 0002 癌症严重危害着人民群众生命健康安全。 全球疾病负担组织研究表明， 仅2016年， 全球因为癌症造成高达893万人死亡， 另据美国癌症研究协会(AACR)发布的2017年度癌症 进展报告表明， 全球每年确诊的癌症病例数、 癌症死亡人数都在不断增加， 癌症病例数更是 有可能在2035年突破2400万， 这将造成医疗成本的大幅上升， 在我国， 2015年新增病例429 万例， 死亡281万例， 亟需找到更加有效的研究与治疗癌症的新方法。 0003 众所周知， 抗癌。

8、药物的研发需要投入巨额的人力、 财力和时间， 往往要耗费十几年 与数十亿美元的投入才能研发出一个切实有效的抗癌药物。 传统的抗癌药物试验时通常选 用二维平面细胞培养的方法， 这种方法虽然简便快速， 然而二维表面上的微环境所含的生 物学信息， 与含有多种特异性生物学信号(生物力学与细胞信号转导)的真实体内细胞外基 质三维网络相去甚远， 因为细胞对微环境的感知、 识别以及刺激-响应行为以及自身功能调 节都会存在显著性差异， 不能反映体内真实的肿瘤细胞行为， 从而导致药物研发失败。 近年 来， 人们开始利用生物相容性优良的三维多孔材料、 水凝胶等来构建肿瘤体外模型， 并发现 肿瘤细胞能够在三维多孔支。

9、架中生长、 增殖、 迁移和分化。 0004 神经胶质瘤， 也叫作多形性神经胶质母细胞瘤(GBM)， 是脑类肿瘤中侵袭性最强的 肿瘤。 它占脑瘤的15， 是脑瘤中第二常见的肿瘤， 仅次于脑膜瘤。 现在治疗它的方法主要 有手术切除， 放疗和化疗， 但即使经过了最大程度的治疗， 胶质瘤也经常复发， 患者在确诊 后的寿命通常只有12到15个月， 只有3到5的人能够存活超过五年。 若不接受治疗， 存活 时间通常只有三个月。 每年每十万人中就有3人被确诊为此病。 而GBM不同于其他肿瘤的最 大特点就是其存在的原位侵袭性， GBM并不像其余癌症那样进行远端转移而是会发生原位 的侵袭， 这一特性使得GBM术后。

10、极易复发。 因此研究胶质母细胞瘤的侵袭特性， 了解其发生 发展的分子机制对于治疗此类疾病具有重要的意义。 传统二维细胞培养模型缺乏细胞外基 质与复杂的三维结构， 动物模型成本高昂且具有伦理学问题， 因此迫切需要新的研究手段 来研究GBM的侵润性生长。 3D生物打印技术能够快速简便地构建三维含细胞的水凝胶体系， 使得直接构建体外3D胶质瘤模型成为了可能。 国内外现有的体外肿瘤模型大部分都是将含 有细胞的水凝胶以挤出和喷墨等方式构成网格状的或实心的模型， 或者先用水凝胶构建出 肿瘤微环境基底， 再将肿瘤等相关细胞嵌入或注射到水凝胶环境中。 发明内容 0005 本发明的目的是针对现有技术的不足之处，。

11、 发明一种基于生物三维打印的体外 GBM侵袭模型的构建方法， 0006 本发明的技术方案如下： 说明书 1/4 页 3 CN 110564690 A 3 0007 基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 0008 1)配制含有人脑胶质细胞的生物墨水； 所述生物墨水的溶剂为纯净水， 生物墨水 成分包括透明质酸、 藻酸盐和明胶； 所述透明质酸在生物墨水中的含量为0.01-0.02g/ml， 所述藻酸盐在所述生物墨水中的含量为0.01-0.02g/ml， 所述明胶在所述生物墨水中的含 量为0.05-0.15g/ml； 0009 2)将所述生物墨水加载到多喷头的。

12、微挤出式生物三维打印机的供料系统中， 按照 指定路径打印支架结构； 得到的支架结构用氯化钙溶液浸渍； 0010 3)在步骤2)得到的支架结构中均匀接种GBM细胞团； 0011 4)将接种了GBM的支架结构置于细胞培养箱持续培养， 每隔2-3天换液， 获得具有 高细胞存活率的体外GBM侵袭模型， 并在培养的第1,7,14天分别提取培养结构的RNA进行测 序。 0012 优选的， 所述的生物墨水中， 所述透明质酸在所述生物墨水中的选用含量为 0.02g/ml， 所述藻酸盐在所述生物墨水中的选用含量为0.02g/ml， 所述明胶在所述生物墨 水中的选用含量为0.010g/ml。 0013 优选的， 。

13、所述生物墨水中还包括作为诱导侵袭因子的葡萄糖， 葡萄糖的加入量为 0.005-0.02g/ml。 0014 优选的， 所述的支架结构为单层、 多层的网格结构或立体框架结构。 0015 优选的， 所述的步骤4)中， 培养过程使用的培养基由普通细胞培养基、 胎牛血清以 及双抗配制而成。 0016 优选的， 所述的GBM细胞团的获得方法为采用悬滴法， 具体过程为： 贴壁培养U87细 胞， 当培养瓶底部贴壁的U87细胞生长增殖到占90体积时， 离心并用培养基吹打混匀， 计 算细胞浓度， 稀释到100-200万个/毫升， 吸取10 l的含U87细胞的培养液滴， 滴在培养皿盖 反面， 在培养皿内加入5毫升。

14、的PBS用来形成水合环境腔， 最后盖上培养皿盖， 用封口膜包 裹， 置入37摄氏度细胞培养箱； 悬滴内分散的细胞在重力作用下逐渐聚集形成若干片状聚 集体， 片状聚集体逐渐相互靠近聚合， 经过6-8天的培养后， 最终形成直径为200-300 m的球 体， 即为GBM细胞团。 0017 本发明可通过一种复合调控方法， 确保模型中细胞存活率达到90以上且结构的 机械性能保持稳定。 0018 一般来说， 为了使体外模型所构建的微环境尽可能地接近体内真实环境， 以尽可 能真实地模拟体内药物反应等各项生物生理过程， 根据不同的细胞和组织， 生物墨水的组 分是各不相同的。 0019 在这里， 由于人脑中约2。

15、0的体积是细胞外基质， 其中绝大部分是由透明质酸 (HA)组成的， 而在大脑的细胞组成上， 占90细胞体积的是神经胶质细胞， 所以选择HA与 HEB的混合体系来模拟大脑的组成。 虽然生物打印组织结构的直接打印性能可能取决于生 物墨水本身的物理性质(如黏性)， 但结构随后的稳定性依赖于附加的交联步骤。 本发明选 择了海藻酸钠与氯化钙溶液(40wt.)通过钙离子胶化的物理交联方式， 通过改变组成生 物墨水的聚合物的浓度和交联密度， 在包括组织刚度和弹性的广泛范围内对生物打印后所 得的水凝胶基质的机械性能进行精调； 而明胶作为非常重要的天然生物高分子材料之一， 具有吸水和支撑骨架的作用， 明胶微粒溶。

16、于水后， 能相互吸引、 交织， 形成叠叠层层的网状 说明书 2/4 页 4 CN 110564690 A 4 结构， 并随温度下降而凝聚， 使打印结构能保持稳定形态， 即使承受较大的荷载也不变形。 在打印过程中可减少结构脆性， 有利于成型。 且明胶是天然的生物材料， 具有极好的生物活 性， 如生物相容性和固有的细胞粘附配体(如RGD)， 有利于结构中细胞的生存。 0020 所以生物墨水组分的正确选择以及打印过程中根据生物墨水的如粘度等各项性 能进行的合理个性化工艺调控， 使最终获得的GBM侵袭模型中细胞存活率达到90以上且 结构的机械性能在恒温37摄氏度的细胞培养箱中持续培养14天后仍能保持稳。

17、定。 0021 本发明获得的体外GBM侵袭模型通过模拟体内的GBM侵袭过程， 可以用来研究如侵 袭前后的基因表达差异、 在不同诱导侵袭因子作用下GBM的侵袭特性等生物学问题， 为研究 神经胶质瘤侵袭性生长的分子机制奠定理论和实验基础。 同时， 此模型的构建方法也可适 用于其他生物系统， 为模拟细胞间相互作用及微环境控制提供新的方法和手段。 0022 诱导肿瘤细胞的迁移和侵袭是体外肿瘤模型的重要功能之一。 在大多数二维培养 研究和芯片构建的例子中， 国内外学者广泛采用制造低氧或缺氧环境的方法来诱导肿瘤侵 袭的发生， 而在体外三维复杂组织器官的模型构建中， 局部缺氧环境的设计较为困难， 且其 引入。

18、的其他材料及局部特殊结构设计也会对模拟体内肿瘤微环境的准确性造成一定程度 的负面影响， 所以本发明使用葡萄糖作为诱导侵袭因子。 模型底部由加入0.005-0.02g/ml (优选-0.02g/ml)葡萄糖的生物墨水打印的实心四边形薄膜状的结构构成， 用作肿瘤细胞 发生侵袭过程的诱导。 葡萄糖向模型上方扩散形成的浓度梯度的设计可有效诱导接种在模 型表面的GBM球状体中的肿瘤细胞向下发生侵袭， 以此模拟体内神经胶质瘤细胞的侵袭过 程。 附图说明 0023 图1是体外GBM侵袭模型支架结构示意图。 0024 图2是体外GBM侵袭模型构建方法示意图。 具体实施方式 0025 下面结合附图和实施例对本发。

19、明做进一步的说明。 0026 如图1-2所示， 本实施例中基于生物三维打印的体外GBM侵袭模型的构建方法， 包 括如下步骤： 0027 1)配制含有人脑胶质细胞的生物墨水； 所述生物墨水的溶剂为纯净水， 生物墨水 成分包括透明质酸、 藻酸盐和明胶； 所述透明质酸在所述生物墨水中的选用含量为0.02g/ ml， 所述藻酸盐在所述生物墨水中的选用含量为0.02g/ml， 所述明胶在所述生物墨水中的 选用含量为0.010g/ml。 所述生物墨水中还包括作为诱导侵袭因子的葡萄糖， 葡萄糖的加入 量为0.02g/ml。 0028 2)将所述生物墨水加载到多喷头的微挤出式生物三维打印机的供料系统中， 按照。

20、 指定路径打印支架结构； 得到的支架结构用氯化钙溶液浸渍， 如图1所示； 0029 3)在步骤2)得到的支架结构中均匀接种GBM细胞团； 0030 4)将接种了GBM的支架结构置于细胞培养箱持续培养， 每隔2天换液， 获得具有高 细胞存活率的体外GBM侵袭模型。 0031 为了得到GBM微肿瘤球状体， 本发明使用悬滴法。 当培养瓶底部贴壁的U87细胞生 说明书 3/4 页 5 CN 110564690 A 5 长增殖到约占90体积时， 离心并用培养基吹打混匀， 计算细胞浓度， 稀释到100-200万个/ 毫升， 吸取若干10 l左右的含U87细胞的培养液滴， 滴在直径60mm的培养皿盖反面， 。

21、注意每 滴之间留出一定间隔以防相互碰到， 在培养皿内加入5毫升的PBS用来形成水合环境腔， 最 后盖上培养皿盖， 用封口膜包裹， 置入37摄氏度细胞培养箱。 悬滴内分散的细胞在重力作用 下逐渐聚集形成若干片状聚集体， 片状体逐渐相互靠近聚合， 经过6-8天的培养后， 最终形 成直径约为200-300 m的球体， 即为GBM微肿瘤球状体。 0032 本发明可应用于药物筛选等领域， 通过设置多组对照实验， 可研究GBM侵袭性生长 的分子机制以及在药物作用下BM侵袭性生长的分子机制。 三维对照组可包括单独培养的 GBM球状体、 支架中不含人脑胶质细胞的GBM侵袭模型以及不接种GBM球状体的只含人脑胶。

22、 质细胞的模型支架； 二维对照组包括只含有神经胶质瘤细胞U87和人脑胶质细胞HEB中的一 种进行单独二维培养的对照组， 以及将两种细胞按实验组中相同的比例进行混合二维培养 的对照组。 分别在培养的第1,7,14天将实验组和对照组的模型剪碎， 采用标准提取RNA步骤 提取模型中所有细胞的RNA， 进行RNA测序， 分析测序结果。 通过基因测序的结果比对， 可以 获得多种细胞三维共培养与单一细胞三维或二维培养情况下基因表达的差异， 为研究GBM 侵袭性生长的分子机制积累更多有效的实验数据。 0033 平面肿瘤模型与体内环境有着明显的差异， 尤其是在药物反应上。 这种差异是由 于这些二维模型缺乏能够。

23、行使功能的3D肿瘤微环境， 从而导致细胞之间和细胞与外基质之 间的相互作用不足。 此外， 在塑料表面培养(单独二维培养的对照组)的过程中， 细胞更倾向 于表现出能够使它们附着在坚硬基底上的表现型。 因此， 平面肿瘤模型的利用度和有效性 都受到了限制。 本发明获得的体外GBM侵袭模型通过模拟体内的GBM侵袭过程， 可以用来研 究如侵袭前后的基因表达差异、 在不同诱导侵袭因子作用下GBM的侵袭特性等生物学问题， 为研究神经胶质瘤侵袭性生长的分子机制奠定理论和实验基础。 同时， 此模型的构建方法 也可适用于其他生物系统， 为模拟细胞间相互作用及微环境控制提供新的方法和手段。 说明书 4/4 页 6 CN 110564690 A 6 图1 图2 说明书附图 1/1 页 7 CN 110564690 A 7 。