维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910557570.3 (22)申请日 2019.06.25 (83)生物保藏信息 CCTCC NO： M 2019076 2019.01.23 (71)申请人 张艾琳 地址 266000 山东省青岛市崂山区青大三 路6号保利中心801室 (72)发明人 王绍冰修德恒万贺飞 (74)专利代理机构 北京汇捷知识产权代理事务 所(普通合伙) 11531 代理人 张丽 (51)Int.Cl. C12N 1/16(2006.01) C12P 7/64(2006.01) C12R 1。

2、/72(2006.01) (54)发明名称 一种维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸 的方法 (57)摘要 本产品涉及一种利用维斯假丝酵母生物法 合成生产长链十二碳二元酸的方法， 包括以下步 骤： 种子培养阶段、 发酵培养阶段与十二碳二元 酸分离回收阶段， 所述维斯假丝酵母的保藏号 CCTCCNo.2019076。 其中， 所述种子培养阶段获 得的种子液的菌株生长OD值达到0.60.85。 本 发明方法生产的正十二碳二元酸具有令人满意 的结晶形态， 更容易满足欧洲、 美国、 日本无尘 化、 低粉尘产品出口要求； 而且特别适合作为高 级润滑油、 高级尼龙树脂的原料加工利用。 权利要求书1页 说明书7。

3、页 CN 110616158 A 2019.12.27 CN 110616158 A 1.一种利用生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法， 包括以下步骤： (1)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201种子培养阶段； (2)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201发酵培养阶段； (3)发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段， 其中， 所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201的保藏号CCTCC No.2019076。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述维斯假丝酵母Candida viswanathii 。

4、ws-1201的种子培养阶段为： 将维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201接种至发酵培 养基中生产菌体。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述发酵培养基包括碳源10-90g/L， 金属 磷酸盐415g/L， 最好为610g/L， 酵母膏38g/L， 玉米浆38g/L， 尿素0.5-1.5g/L， NaCl 0.5-1g/L， 钾盐1-10g/L， 吐温0.5-1.5g/L。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述发酵培养基包括碳源10-90g/L， 金属 磷酸盐为610g/L， 酵母膏38g/L， 玉米浆38g/L， 尿素0.5-1.5g/。

5、L， NaCl 0.5-1g/L， 钾 盐1-10g/L， 吐温0.5-1.5g/L。 5.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述种子培养阶段为在摇瓶中培养或在种 子发酵罐中培养。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所述种子培养阶段获得的种子液的菌株生 长OD值达到0.60.85。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201发酵培养阶段为将所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201种子培养阶 段获得的种子液在发酵罐中进行产酸培养， 所述发酵罐包括底部通气装置与搅拌装置， 以。

6、 及设置于发酵罐中部的烷烃输入装置。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201种子培养阶段的产酸培养条件为将所述种子液接入pH值为5.59.0含有540 (v/v)12个碳原子的正烷烃和6095(v/v)发酵培养基的混合液中； 所述混合液在pH值为 5.59.0下、 2429转化4852小时， 并从发酵培养第24小时开始， 每天补加正烷烃， 使 发酵液中正烷烃浓度始终20(v/v)。 9.根据权利要求18任意一项所述的方法获得的产品。 10.根据权利要求18任意一项所述的菌种维斯假丝酵母Candida viswanat。

7、hii ws- 1201。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110616158 A 2 一种维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法 技术领域 0001 本发明属于生物化工领域， 涉及一种维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法 及产品与菌种。 背景技术 0002 长链二元酸是指碳原子数在十个以及以上的二元酸， 一般指直链二元酸。 十二碳 二元酸(DC12)是合成高性能尼龙工程塑料尼龙1212和服装用高档尼龙热熔胶和高级涂料 的重要原料。 0003 DC12可以通过微生物发酵或化学合成两种方法制备生产。 传统的生产长链二酸的 化学方法需要9个复杂的反应步骤,高温、 高压和催化剂； 生产时需要防火。

8、、 防爆和防毒装 置， 收率低、 成本高和环境污染严重。 而生物发酵法合成工艺简单， 常温常压下就能生产， 无 污染、 收率高， 具备成本优势。 0004 国内外生产菌株的、 -氧化能力强较强， 产酸可达200g/L， 如中国专利 CN1233658A、 CN1130685A、 CN1162644A、 CN1369464A、 CN1092108A、 CN1034579A、 CN1046757A 分别公开了通过硝基胍、 亚硝酸和紫外线多次反复诱变， 选育-氧化能力更强的热带假丝 酵母突变株并以烷烃作为生长碳源公开了一种生产长链二元酸的热带假丝酵母菌的筛选 方法， 该方法能快速而高效的获得 、 -。

9、氧化能力强的热带假丝酵母突变菌株， 其部分解决 长链二元酸发酵生产效率的低的问题： 如专利CN1928100A中DC12生产率为1.3g/Lh， 专利 CN10225411A中混合二元酸的生产率仅为0 .92g/Lh。 中国专利CN104862348A、 CN105755062A公开了使用维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的方法， 通过分离耦合装置 或氧化还原电位控制发酵过程部分提高了生产效率至1.782.0g/Lh， 但上述方法操作 步骤较为复杂， 且并没有缩短整个发酵周期， 占用生产设备时间较长， 不能解决二元酸工业 化难题。 发明内容 0005 有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种维斯假丝。

10、酵母发酵生产十二碳二元酸的方 法及产品与菌种， 该方法是基于以下发现： 通过在含烷烃(生产使用废弃石蜡油)废渣中以 基因高通量筛选结合特定化学诱变方法， 筛选出一株维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201， 保藏号CCTCC No.2019076， 保藏日期为2019年1月23日， 保藏地点为武汉大学， 中 国典型培养物保藏中心)， 其一方面能保持现有高水平发酵生产DC12的能力或略有提高， 又 极大地缩短了发酵生产DC12的发酵时间， 使得维斯假丝酵母发酵生产十二碳二元酸的工业 化成为可能。 该菌株发酵并使用本发明的精制方法获得产品十二碳二元酸， 形态为具有较 为。

11、紧密结晶体的结构， 大大减少了粉末程度的同时， 减少了产品包装尺寸， 使得产品更容易 达到后续工艺无尘化和低尘化要求的同时， 更利于长途集装箱的运输并减少货柜装量。 0006 维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)的培养特征如下： 0007 原料包括碳源的混合物， 包含一种或多种选自糖、 纤维素、 烷烃、 脂肪酸、 三酰甘 说明书 1/7 页 3 CN 110616158 A 3 油、 石蜡等或它们的组合的碳源。 氮可自无机(例如， (NH4)2SO4)或有机来源(例如， 脲或谷氨 酸)供应。 除合适的碳源和氮源外， 培养基还可含有适合微生物培养的适当矿物质、 。

12、盐、 辅因 子、 缓冲液、 维生素、 金属离子(例如， Mn+2、 Co+2、 Zn+2、 Mg+2)和其他组分。 或使用酵母复合培养 基(例如， 酵母提取物-蛋白胨-右旋糖肉汤(YPD)或其他可商品化制备的(如酵母氮基料 (DIFCO Laboratories,Detroit,Mich.)通用酵母培养基中培养维斯假丝酵母。 在本发明的 一个优选斜面培养基为麦芽汁琼脂培养基。 液体发酵培养基包括： 碳源10-90g/L， 金属磷酸 盐415g/L， 最好为610g/L， 酵母膏38g/L， 玉米浆38g/L， 尿素0.5-1.5g/L， NaCl 0.5-1g/L,钾盐1-10g/L， 消泡剂。

13、0.5-1.5g/L。 0008 发明所述的发酵转化正十二烷(nC12)生产十二碳二元酸(DC12)的方法是以热带 假丝酵母维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)为发酵菌种， 在以正十二烷 (nC12)为基质的发酵培养基中同步发酵， 生产 ， -正十二碳二元酸。 0009 发明所述的发酵转化正十二烷(nC12)生产十二碳二元酸(DC12)的方法的步骤为： 0010 第一阶段为维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)的种子培养， 即将维 斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)接入发酵培养基， 282922。

14、0转/分的旋转 摇床上培养4024小时， 菌株生长OD值达到0.60.85时， 作为发酵液的种子。 应当明确， 以 上种子培养基及培养方法仅为优选方法， 在本发明说明书给出了该菌株的培养特征、 营养 特征的前提下， 可以对上述条件进行改变， 只要使得菌株生长正常能够达到OD值达到0.6 0.85， 作为发酵液的种子即可。 0011 第二阶段为维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)的发酵产酸阶段， 即 将培养成的种子液接入pH值为5.59.0含有540(v/v)12个碳原子的正烷烃和60 95(v/v)发酵培养基的混合液中。 所述混合液2429转化4852小时， 。

15、然后将生产的十 二碳二元酸进行分离纯化。 更优选地， 所述混合液在pH 6.07.5下2429下转化52小 时， 然后将生产的十二碳二元酸进行分离纯化。 更优选地， 从24小时开始， 每天补加一定量 正烷烃， 使发酵液中正烷烃浓度始终20(v/v)。 0012 优选地， 本发明还包括将发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段： 即发酵结束 后， 将发酵液加热加碱破乳， 加热至80-90， 加碱至pH10左右， 压入静置分层罐分层。 优选 地， 本发明还包括将残余正烷烃回收再用的步骤， 即膜分离除去菌体， 清液放置， 冷却至20 ， 收集DC12钠盐的晶体， 母液直接酸化结晶， 收集DC12钠盐和D。

16、C12， 用水或有机溶剂进行 重结晶， 得到DC12白色结晶。 0013 本发明与现有技术相比， 本发明具有以下优点： 0014 用本发明的维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)菌株和发酵方法， 可 在工业化发酵罐， 从nC12发酵生产DC12时， 培养52h时产酸142g/L。 发酵52h结束， 平均产酸 速率为2.73g/hL， 转化率93.2。 DC12纯度达到99以上， 其中一元酸的含量小于 0.01。 此外， 令人意外地， 本发明的DC12生产产品具有令人满意的片层状形态， 这对欧洲 无尘化、 低粉尘产品进口要求而言更具有竞争力。 具体实施方式 001。

17、5 在本发明的一个实施例中， 提供了利用生物法合成生产长链十二碳二元酸的方 法， 包括以下步骤： 说明书 2/7 页 4 CN 110616158 A 4 0016 (1)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201种子培养阶段； 0017 (2)维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201发酵培养阶段； 0018 (3)发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段， 其中， 0019 所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201的保藏号CCTCC No.2019076。 0020 优选地， 在本发明的一个实施例中， 所述维斯假丝酵。

18、母Candida viswanathii ws- 1201的种子培养阶段为： 将维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201接种至发酵培养 基中生产菌体。 0021 优选地， 在本发明的一个实施例中， 所述发酵培养基包括碳源10-90g/L， 金属磷酸 盐415g/L， 最好为610g/L， 酵母膏38g/L， 玉米浆38g/L， 尿素0.5-1.5g/L， NaCl 0.5-1g/L， 钾盐1-10g/L， 消泡剂0.5-1.5g/L。 0022 优选地， 在本发明的一个实施例中， 所述发酵培养基包括碳源10-90g/L， 金属磷酸 盐为610g/L， 酵母膏38g/L。

19、， 玉米浆38g/L， 尿素0.5-1.5g/L， NaCl 0.5-1g/L， 钾盐1- 10g/L， 消泡剂0.5-1.5g/L。 0023 优选地， 在本发明的一个实施例中， 所述种子培养阶段为在摇瓶中培养或在种子 发酵罐中培养。 0024 优选地， 在本发明的一个实施例中， 所述种子培养阶段获得的种子液的菌株生长 OD值达到0.60.85。 0025 优选地， 在本发明的一个实施例中， 所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws- 1201发酵培养阶段为将所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws-1201种子培养阶段获 得的种子液在发酵罐中进行产酸。

20、培养， 所述发酵罐包括底部通气装置与搅拌装置， 以及设 置于发酵罐中部的烷烃输入装置， 所述发酵罐中部包括自发酵罐顶部1/3处至下部1/3处的 中间1/3处之间任意位置， 可以设置一个或多个烷烃输入口， 只要使得烷烃的流入速度保持 在本发明实施例所需的特定速率即可； 所述底部通气装置的通气量为1:0.51:0.7； 所述 搅拌装置的转速为100150转/分钟。 0026 优选地， 在本发明的一个实施例中， 所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws- 1201种子培养阶段的产酸培养条件为将所述种子液接入pH值为5.59.0含有540(v/ v)12个碳原子的正烷烃和6095(。

21、v/v)发酵培养基的混合液中； 所述混合液在pH值为5.5 9.0下、 2429转化4852小时， 并从发酵培养第24小时开始， 每天补加正烷烃， 使发酵 液中正烷烃浓度始终20(v/v)。 0027 优选地， 在本发明的一个实施例中， 所述维斯假丝酵母Candida viswanathii ws- 1201种子培养阶段的产酸培养条件为将所述种子液接入pH值为5.59.0含有540(v/ v)12个碳原子的正烷烃和6095(v/v)发酵培养基的混合液中； 所述混合液在pH 6.0 7.5下2429下转化4852小时， 并从发酵培养第24小时开始， 每天补加正烷烃， 使发酵 液中正烷烃浓度始终2。

22、0(v/v)。 0028 在本发明的一个实施例中， 还包括将发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段： 即发酵结束后， 将发酵液加热加碱破乳， 加热至80-90， 加碱至pH10左右， 压入静置分层罐 分层。 优选地， 本发明还包括将残余正烷烃回收再用的步骤， 即膜分离除去菌体， 清液放置， 冷却至20， 收集DC12钠盐的晶体， 母液直接酸化结晶， 收集DC12钠盐和DC12， 用水或有机 溶剂进行重结晶， 得到DC12白色结晶。 说明书 3/7 页 5 CN 110616158 A 5 0029 优选地， 在本发明的一个实施例中， 提供了上述方法获得的产品及上述方法使用 的菌种维斯假丝酵母Ca。

23、ndida viswanathii ws-1201。 0030 下面将结合本发明中的实施例， 对本发明中的技术方案进行清楚、 完整地描述。 显 然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实 施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属 于本发明保护的范围。 0031 实施例1 0032 发酵合成长链二元酸的过程如下： 0033 1、 培养基配制 0034 斜面培养基： 麦芽汁琼脂培养基； 0035 种子培养基： 葡萄糖25g/L， 磷酸氢二钠6g/L， 酵母膏3g/L， 玉米浆5g/L， 尿素 1.5g/L， Na。

24、Cl 0.5g/L， KCl 1g/L， 吐温0.5g/L。 0036 发酵培养基:葡萄糖40g/L， 磷酸氢二钠8g/L， 酵母膏3g/L， 玉米浆5g/L， 尿素 1.5g/L， NaCl 0.5g/L， KCl 1g/L， 吐温0.5g/L。 0037 2、 种子培养阶段 0038 取一环维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)涂布在20180mm的大试 管固体斜面培养基上， 于27培养72h。 将斜面上活化的种子培养物接种于装200ml种子培 养基的500ml三角瓶中， 在29， 230240r/min条件下振荡培养24小时， 检测菌种OD为0.6 0.8。

25、5之间。 0039 3、 发酵产酸阶段： 0040 将种子液以20的接种量接种于装5L发酵培养基的10L发酵罐中， 初始pH6.0， 温 度27， 通气量1 0.7， 发酵罐转速120转/分， 通过连续或间歇的方式补加正十二烷， 使发酵 液中正十二烷浓度始终大于等于20(v/v)， 培养48h产酸80.2g/L， 培养52h时产酸120g/L。 发酵52h结束， 平均产酸速率为2.31g/hL。 0041 其中， DC12回收方法为有机溶剂回收法， 发酵结束后， 用6N的HCl调节PH至2-3， 用 120ml乙醚抽提后， 蒸去乙醚， 得到DC12白色结晶， 用15ml中性乙醇溶解后， 用标准。

26、NaOH溶液 滴定， 计算出发酵液中DC12纯度98.23， 其中一元酸含量0.030。 0042 实施例2： 0043 发酵合成长链二元酸的过程如下： 0044 1、 培养基配制 0045 斜面培养基： 麦芽汁琼脂培养基； 0046 种子培养基： 葡萄糖25g/L， 磷酸氢二钠6g/L， 酵母膏3g/L， 玉米浆5g/L， 尿素 1.5g/L， NaCl 0.5g/L， KCl 1g/L， 吐温0.5g/L。 0047 发酵培养基:葡萄糖35g/L， 磷酸氢二钠8g/L， 酵母膏3g/L， 玉米浆5g/L， 尿素 1.5g/L， NaCl 0.5g/L， KCl 1g/L， 吐温1.5g/L。

27、。 0048 2、 种子培养阶段 0049 取一环维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)涂布在20180mm的大试 管固体斜面培养基上， 于27培养72h。 将斜面上活化的种子培养物接种于装200ml种子培 养基的500ml三角瓶中， 在27， 250r/min条件下振荡培养24小时， 将培养液以20的接种 说明书 4/7 页 6 CN 110616158 A 6 量接种于装5L发酵培养基的10L发酵罐中， 初始pH 6.0， 温度27， 通气量1 0.6， 发酵罐转 速120转/分， 检测获得的种子液菌种OD为0.60.85之间。 0050 3、 发酵产酸阶段。

28、： 0051 将获得的种子液以20的接种量接种于装35L发酵培养基的50L发酵罐中， 初始pH 7.0， 温度28， 通气量1 0.7， 发酵罐转速120转/分， 通过连续或间歇的方式补加正十二烷， 使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20(v/v)， 培养48h产酸91.5g/L， 培养52h时产酸 136g/L。 发酵52h结束， 平均产酸速率为2.62g/hL， 转化率92.1。 0052 发酵结束后， 进行破乳分层， 回收上层残余nC12， 下层菌体层通过压滤， 除去菌体， 合并清液， 加入0.60.7活性炭90脱色20分钟， 压滤除去活性炭， 脱色清液加热后加入 浓H2SO4至pH3，。

29、 冷却至室温， 压滤， 空气吹干， 固形物经烘干机烘干， 得白色结晶状DC12产品。 DC12纯度达到99.35， 其中一元酸的含量0.005。 0053 实施例3： 0054 发酵合成长链二元酸的过程如下： 0055 1、 培养基配制 0056 斜面培养基： 麦芽汁琼脂培养基； 0057 种子培养基： 葡萄糖25g/L， 磷酸氢二钠6g/L， 酵母膏3g/L， 玉米浆5g/L， 尿素 1.5g/L， NaCl 0.5g/L， KCl 1g/L， 吐温0.5g/L。 0058 发酵培养基:葡萄糖35g/L， 磷酸氢二钠8g/L， 酵母膏3g/L， 玉米浆5g/L， 尿素 1.5g/L， NaC。

30、l 0.5g/L， KCl 1g/L， 吐温1.5g/L。 0059 2、 种子培养阶段 0060 取一环维斯假丝酵母(Candida viswanathii ws-1201)涂布在20180mm的大试 管固体斜面培养基上， 于27培养72h。 将斜面上活化的种子培养物接种于装200ml种子培 养基的500ml三角瓶中， 在27， 250r/min条件下振荡培养24小时， 将培养液以20的接种 量接种于装3L发酵培养基的5L发酵罐中， 初始pH 6.0， 温度27， 通气量1 0.6， 发酵罐转速 120转/分， 检测获得的种子液菌种OD为0.60.85之间。 0061 将5L发酵罐中的3L种。

31、子液接种到装有1.5m3发酵液的2m3发酵罐中， 初始pH 6.0， 温 度27， 通气量1 0.6， 发酵罐转速120转/分， 检测获得的种子液菌种OD为0.60.85之间。 0062 3、 发酵产酸阶段： 0063 将获得的种子液以20的接种量接种于装189L发酵培养基的50L发酵罐中， 初始 pH 7.0， 温度28， 通气量1 0.7， 发酵罐转速120转/分， 通过连续或间歇的方式补加正十二 烷， 使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于20(v/v)， 培养48h产酸94.3g/L， 培养52h时产 酸142g/L。 发酵52h结束， 平均产酸速率为2.73g/hL， 转化率93.2。 。

32、0064 发酵结束后， 进行破乳分层， 回收上层残余nC12， 下层菌体层通过压滤， 除去菌体， 合并清液， 加入0.60.7活性炭90脱色20分钟， 压滤除去活性炭， 脱色清液加热后加入 浓H2SO4至pH3， 冷却至室温， 压滤， 空气吹干， 固形物经烘干机烘干， 得白色结晶状DC12产品。 DC12纯度达到98.75， 其中一元酸的含量0.010。 0065 对比例1： 0066 该对比例使用热带假丝酵母UH-2-48， 保藏号为CGMCC NO.0239菌株(参见专利ZL 95117436.3)， 其他方法同实施例1即： 说明书 5/7 页 7 CN 110616158 A 7 006。

33、7 (1)、 取一接种环热带假丝酵母UH-2-48菌体， 涂布在15180大试管麦芽汁固体斜 面上， 在28培养2天。 0068 (2)、 取上述菌种一支， 接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30 在220转/分的旋转摇床上培养40小时。 液体种子培养基中含有KH2PO4 8g/l， 酵母膏5g/l， 玉 米浆3g/l， 蔗糖30g/l， 尿素3g/l， 自来水配置， PH5.0。 0069 (3)、 在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中， 接入3.5ml上述培养好的种子液， 于28-30， 220转/分旋转摇床上发酵4天， 每24小时用6N NaOH调一次PH。

34、至7.5-8.0。 发酵培 养基混合液中含KH2PO410g/l， 蔗糖20/l， 酵母膏3g/l， 玉米浆3.5g/l， 尿素1.5g/l， 以及 nC12200ml/l， 自来水配置， PH7.2。 在110下灭菌30分钟。 0070 发酵结束后， 用6N的HCl调节PH至2-3， 用120ml乙醚抽提后， 蒸去乙醚， 得到DC12白 色粉末， 用15ml中型乙醇溶解后， 用标准NaOH溶液滴定， 计算出发酵液中DC12含量为62.7g/ l， 纯度97.23， 其中一元酸的含量为大于1.2。 0071 通过比较发现本发明的实施例1获得产品晶体更大， 产品体积更小， 而对比例1获 得产品基。

35、本为粉末状。 相同质量产品本发明实施例1产品仅为对比例50左右。 0072 对比例2： 0073 该对比例使用热带假丝酵母UH-2-48， 保藏号为CGMCC NO.0239菌株(参见专利ZL 95117436.3)， 其他方法同实施例2即： 0074 (1)种子培养基及培养方法及发酵培养基、 发酵方法同实例2。 0075 (2)把3000mL培养两天， OD(30， 620nm)为0.81pH 3.8， 健壮， 热带假丝酵母UH-2- 48无杂菌种液接入装有700L种子培养基， 经121灭菌40分钟的一级种子罐中， 29350转/ 分， 罐压0.8kg/cm2， 通气量1 0.8， 培养36。

36、小时， 作为二级种母的种子。 0076 (3)把(2)中培养的健壮， 无杂菌的700L种液接入装有6.5m3种子培养基， 经过121 灭菌40分钟的10m3二级种母罐中， 30， 200转/分， 罐压1kg/cm2， 通气量1 0.7， 培养40 24小时， 作为发酵的种子。 0077 (4)把(3)中培养的健壮、 无杂菌的无杂菌种液种液， 接入装有33m3发酵培养基， 经 121灭菌40分钟的50m3发酵罐中， 30， 200转/分， 罐压1kg/cm2， 通气量1 0.5， 开始时， nC12 4m3， 30小时内， 体系pH控制在7.0以下， 菌体迅速生长， 同时产生20.1g/L DC。

37、12， 然后体 系pH在7.08.0， 继续发酵， 到67小时， 产酸量达到108g/L， 70小时后每天补加一定量nC12， 使发酵液中正烷烃浓度始终5(v/v)。 发酵139小时， 产酸量达133g/L， 发酵到163小时结 束， 产酸量达143g/L。 0078 发酵结束后， 进行破乳分层， 回收上层残余nC12， 下层菌体层通过压滤， 除去菌体， 合并清液， 加入0.60.7活性炭90脱色20分钟， 压滤除去活性炭， 脱色清液加热后加入 浓H2SO4至pH 3， 冷却至室温， 压滤， 空气吹干， 固形物经烘干机烘干， 得白色粉末状DC12产 品。 nC12转化率为88.8， 后处理总收率达到85， DC12纯度达到96.35， 其中一元酸的含 量大于1.5。 0079 通过比较发现本发明的实施例2的获得产品晶体更大， 产品体积更小， 而对比例2 获得产品基本为粉末状。 相同质量产品本发明实施例2产品包装体积仅为对比例50左右。 0080 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 说明书 6/7 页 8 CN 110616158 A 8 视为本发明的保护范围。 说明书 7/7 页 9 CN 110616158 A 9 。