基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同固态发酵剂.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911076661.1 (22)申请日 2019.11.06 (71)申请人 华中农业大学 地址 430000 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 胡杨赵钰杜红英蔡晓雯 胡筱波李金玲丛林刘茹 熊善柏 (74)专利代理机构 北京金智普华知识产权代理 有限公司 11401 代理人 杨采良 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 9/50(2006.01) A23L 17/10(2016.01) A23L 29/00(2016.01)。

2、 C12R 1/25(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协 同固态发酵剂 (57)摘要 本发明属于发酵食品生产技术领域， 公开了 一种基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协 同固态发酵剂， 固态发酵剂由菌酶母液、 填充料、 保护剂组成； 菌酶母液由所述菌酶母液植物乳杆 菌、 乳酸片球菌、 戊糖片球菌及胰蛋白酶组成； 植 物乳杆菌、 乳酸片球菌、 戊糖片球菌按菌泥体积 比为100： (10100)： (10100)； 无花果蛋白酶 的添加量为0.53.5mL/100g鱼肉。 本发明采用 优良的固态复配发酵菌剂进行接种发酵， 。

3、能够明 显缩短发酵鱼肉的周期， 避免杂菌的污染， 提升 了产品的安全性， 降低生产成本， 还可以改善产 品的营养、 品质和风味， 有助于使传统发酵鱼制 品实现工业化、 标准化和规模化的生产。 权利要求书3页 说明书13页 附图3页 CN 110643546 A 2020.01.03 CN 110643546 A 1.一种基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂， 其特征在于， 所 述基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂由菌酶母液、 填充料、 保护 剂组成； 按质量计， 填充料为菌酶母液质量的515、 保护剂为菌酶母液质量的520； 所述菌酶母液由植物乳杆菌、 乳酸片。

4、球菌、 戊糖片球菌及无花果蛋白酶组成； 所述植物乳杆菌、 乳酸片球菌、 戊糖片球菌菌体活菌数106109cfu/mL； 所述植物乳杆 菌、 乳酸片球菌、 戊糖片球菌分别培养至1115h、 712h、 516h后6000rpm进行冷冻离心 浓缩， 按按菌泥体积比植物乳杆菌： 乳酸片球菌： 戊糖片球菌为100： (10100)： (10100)； 所述无花果蛋白酶的添加量为0.53.5mL/100g鱼肉， 所述无花果蛋白酶含量10000 20000U/mL； 所述填充料分为喷雾干燥填充料、 真空冷冻干燥填充料、 微波干燥填充料中的一种； 所述喷雾干燥填充料， 按质量比由26的可溶性淀粉、 26的脱。

5、脂奶粉组成； 真空 冷冻干燥填充料按质量比由510的预糊化淀粉、 26的脱脂奶粉组成； 微波干燥 填充料按质量比由0.52淀粉和0.52麦芽糊精组成； 所述保护剂分别为喷雾干燥保护剂、 真空冷冻干燥保护剂、 微波干燥保护剂中的一种； 所述喷雾干燥保护剂按质量比由15甘油、 48蔗糖、 15明胶组成； 真空冷冻 干燥保护剂按质量比由13胶原小肽、 48海藻糖、 14 -环糊精组成； 微波干燥保 护剂按质量比由0.52蔗糖、 0.11甘油、 0.52脱脂乳和0.52海藻酸钠组 成。 2.一种如权利要求1所述基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂 的制备方法， 其特征在于， 所述基于复。

6、合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵 剂的制备方法包括以下步骤： 步骤一， 菌种的制备： 植物乳杆菌、 乳酸片球菌、 戊糖片球菌均采用MRS琼脂培养基活化 2次， 30培养分别培养至48h； 接种至200m L MRS液体培养基分别培养1115h、 712h、 5 16h， 使菌体活菌数均达到106109cfu/mL； 46000rpm冷冻离心， 菌体沉淀用无菌生理盐 水清洗两次， 重新悬浮于无菌生理盐水， 4冰箱保存， 24h内备用； 步骤二， 菌酶母液的制备： 步骤一得到的活菌数达到106109cfu/mL的植物乳杆菌、 乳 酸片球菌、 戊糖片球菌在46000rpm冷冻离心浓缩后，。

7、 植物乳杆菌： 乳酸片球菌： 戊糖片球 菌按菌泥体积比为100： (10100)： (10100)计， 将菌泥混合， 加入1000020000U/mL无花 果蛋白酶液体； 无花果蛋白酶的添加量为0.53.5mL/100g鱼肉， 记为菌酶母液； 步骤三， 采用喷雾干燥、 真空冷冻干燥或微波干燥方式中的一种进行干燥。 3.如权利要求2所述基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂的制 备方法， 其特征在于， 所述步骤一菌种制备前需进行菌种活化， 具体包括： (1)冷冻干燥管开管， 用沾有70酒精的棉花擦拭外管， 在火焰上加热外管的尖端， 滴 数滴无菌水于加热处， 使外管破裂， 再敲破尖端。

8、， 取出隔热纤维纸和内管， 再取出内管的棉 塞； (2)无菌吸管， 吸取0.3-0.5mL指定的液体培养基， 滴入管内， 并震荡， 直到均匀悬浮； (3)取0.1-0.2mL的菌体悬浮液于指定平板培养基上， 做划线分离培养或做稀释， 用无 菌L型玻璃棒均匀涂抹， 检验菌种的纯度及活化情况； 剩余菌体全部移入指定液体培养基 内， 并依据指定温度培养。 权利要求书 1/3 页 2 CN 110643546 A 2 4.如权利要求2所述基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂的制 备方法， 其特征在于， 步骤三中， 所述三种干燥方式具体包括： (1)喷雾干燥： 按质量比计向菌酶母液加15。

9、甘油、 48蔗糖、 15明胶作为抗 热保护剂， 另加26的可溶性淀粉、 26的脱脂奶粉作为填充料； 设定其喷雾干燥条件 为： 进料温度1020、 出料温度6080、 流速为120mL/h180mL/h即得到固态复合发酵 菌剂， 该复合发酵剂的内控质量标准为三种菌株的活菌总数达到107cfu/mL； 采用聚乙烯包 装袋密封包装上述固态复合发酵菌剂， 在4保存备用； (2)真空冷冻干燥： 按质量比向菌酶母液中添加保护剂13胶原小肽、 48海藻 糖、 14 -环糊精作为保护剂， 另加510的预糊化淀粉、 26的脱脂奶粉作为 填充料； 先在-20冰箱预冻12h， 随后放入真空冷冻干燥机； 冻干程序为：。

10、 以-20-45 冻结菌酶母液， 持续34h， 随后以2/h程序升温到室温20， 真空度保持在100mbar以下； 冻干之后进行粉碎处理并装入铝箔包装袋， 在4保存备用； (3)微波干燥： 按质量比计加0.52蔗糖、 0.11甘油、 0.52脱脂乳和0.5 2海藻酸钠作为保护剂， 另加0.52淀粉和0.52麦芽糊精； 设定的微波条件 是： 采用脉冲微波或间歇微波， 微波剂量为0.53kW/kg， 总处理时间为260min， 其中微波 时间占总处理时间的3070， 使干燥结束时发酵剂的温度小于70， 水分含量小于15 20。 5.一种应用如权利要求1所述基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作用。

11、固态发 酵剂的发酵鲊鱼的发酵方法， 其特征在于， 所述发酵鲊鱼的发酵方法包括以下步骤： 步骤1， 接种发酵， 新鲜草鱼洗净， 去头、 去尾、 去内脏， 切成约1cm2cm2cm的小块， 洗 净并沥水； 鲜红辣椒洗净， 去籽后剁碎； 生姜洗净去皮， 切碎； 称取鱼肉100g、 米粉1560g、 辣椒1030、 生姜210、 食盐15， 加水3050mL， 接入固态发酵剂， 按鱼体 重量计加入110， 装瓶、 压实并密封； 置于1535恒温培养箱， 保温发酵2472h； 步骤2， 终止发酵， 将发酵好的草鱼肉块取出， 按质量比计加入0.51.5的安琪酵 母抽提物FA02或FA28或KK02或FA3。

12、1或KU012或FIG12LS或FIG18LS或FA01或FIG00或F55或 F58进行混匀后放入真空包装袋， 将100蒸煮20min40min终止发酵， 冷却至室温； 自然发 酵作为空白对照组。 6.如权利要求5所述发酵鲊鱼发酵方法， 其特征在于， 所述自然发酵作为空白对照组的 方法步骤包括： 新鲜草鱼洗净， 去头、 去尾、 去内脏， 切成约1cm2cm2cm的小块， 洗净并沥水； 鲜红辣 椒洗净， 去籽后剁碎； 生姜洗净去皮， 切碎； 称取鱼肉100g、 米粉1560g、 辣椒1030、 生姜210、 食盐15， 加水3050mL， 混合均匀装瓶、 压实并密封； 置于1535 恒温培养箱。

13、， 保温发酵2472h后， 将发酵好的草鱼肉块取出放入真空包装袋， 将100蒸煮 20min40min终止发酵， 冷却至室温。 7.如权利要求5所述发酵鲊鱼发酵方法， 其特征在于， 步骤1、 步骤2中， 所述发酵温度为 2535。 8.一种应用如权利要求1所述基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作用固态发 酵剂的发酵臭鳜鱼的发酵方法， 其特征在于， 所述发酵臭鳜鱼的发酵方法包括以下步骤： 步骤I， 接种发酵， 新鲜鳜鱼去头、 去尾、 去内脏， 洗净并沥水； 鲜红辣椒洗净， 去籽后剁 权利要求书 2/3 页 3 CN 110643546 A 3 碎； 生姜洗净去皮， 切碎； 称取鱼肉100g、。

14、 辣椒1030、 生姜210， 食盐15， 加水3050mL， 接入固态发酵剂， 按鱼体重量计加入110， 装瓶、 压实并密封； 置于10 25恒温培养箱， 保温发酵2d10d； 步骤II， 终止发酵， 将发酵好的鳜鱼肉取出， 按质量比计加入0.51.5的酵母抽提 物FA02或FA28或KK02或FA31或KU012或FIG12LS或FIG18LS或FA01或FIG00或F55或F58进行 混匀后放入真空包装袋中， 将100蒸煮2040min终止发酵， 冷却至室温； 自然发酵作为空 白对照组。 9.如权利要求8所述发酵臭鳜鱼的发酵方法， 其特征在于， 所述自然发酵作为空白对照 组的方法步骤包括。

15、： 新鲜鳜鱼去头、 去尾、 去内脏， 洗净并沥水； 鲜红辣椒洗净， 去籽后剁碎； 生姜洗净去皮， 切碎； 称取鱼肉100g、 辣椒1030、 生姜210， 食盐15， 加水3050mL， 混合 均匀装瓶、 压实并密封； 置于1025恒温培养箱， 保温发酵210d后取出鳜鱼， 放入真空 包装袋中， 将100蒸煮2040min终止发酵， 冷却至室温。 10.如权利要求8所述发酵臭鳜鱼的发酵方法， 其特征在于， 步骤I、 步骤II中， 所述发酵 温度为1025。 权利要求书 3/3 页 4 CN 110643546 A 4 基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同固态发酵剂 技术领域 0001 本发明。

16、属于发酵食品生产技术领域， 尤其涉及一种基于复合菌种结合无花果蛋白 酶的菌酶协同固态发酵剂， 具体涉及一种基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作用 固态发酵剂、 增鲜方法及发酵方法。 背景技术 0002 目前， 最接近的现有技术如下： 0003 我国拥有丰富的淡水鱼资源量， 全国内陆水域鱼类800多种， 纯淡水鱼类760种， 本 世纪初以来淡水鱼产量逐年递增， 2018年达3156.23万吨， 占世界淡水鱼总产量70以上， 其中大宗淡水鱼产量占我国淡水鱼产量的70以上(中国渔业统计年鉴， 2019)。 虽然淡水 鱼养殖产业的迅速发展， 但仍主要以鲜销为主， 淡水鱼加工比例不足淡水鱼产品总量的。

17、 11， 其加工比例远低于世界平均水平， 且加工方式仅局限在传统的初级加工， 精深加工产 业发展不足， 从而加工业和养殖业之间的矛盾日益突出， 甚至会影响淡水鱼产业的发展。 0004 水产品加工方式可分为传统手工加工和现代自动化加工两大类， 传统加工主要指 腌制、 干制、 熏制和天然发酵等。 目前， 我国有许多地方特色传统发酵鱼制品， 如湖南祁阳的 鲊鱼， 安徽的臭鳜鱼， 苗族侗族的酸鱼， 安庆、 聂家和绍兴等地的糟醉鱼， 民间自制的咸鱼和 腊鱼等也属于发酵鱼制品。 这些发酵鱼制品大多是利用自然界的微生物在适宜的温湿条件 下发酵而成的， 但这种传统自然发酵方式的加工环境和发酵条件随机性强且因原。

18、料的不 同， 使得每种发酵制品的风味差异大， 产品品质难以控制， 发酵周期较长， 从而导致这类发 酵鱼制品缺乏统一的生产质量标准， 难以实现工业化和规模化生产。 0005 随着研究的深入， 微生物接种技术慢慢应用到发酵食品的生产过程中。 接种发酵 是指在特定发酵阶段选择性的接种目的优势菌株， 通过在鱼体上接种微生物发酵剂， 不仅 能够缩短发酵周期， 在一定程度上避免杂菌的污染， 提升产品的安全性， 提高设备利用率和 生产效率， 降低生产成本， 还可以改善产品的营养、 品质和风味， 有助于使传统发酵鱼制品 实现工业化、 标准化和规模化的生产。 Devi等分析了印度传统非盐腌鱼产品Ngari在发酵。

19、过 程中菌落结构的变化情况， 发现第3个月嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)大 量增殖， 第6个月破布子乳酸菌(Lactobacillus pobuzihii)大量增殖， 而3至6个月出现了 肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)以及6至9个月出现了印度杆菌(Bacillus indicus)， 这些已确定的优势菌株可用来优化发酵技术和缩短发酵时间， 使Ngari实现工业 化生产。 Riebroy等对泰国鱼糜Som-fug的加工工艺进行了改进， 将戊糖片球菌、 植物乳杆菌 和乳酸片球菌分别接种至黄笛鲷上， 发现与自然发酵鱼糜相比， 接种了。

20、乳酸片球菌的鱼糜 发酵周期更短， 并且具有较高的感官品质。 卢晓莉从传统鱼鲊中筛选出植物乳杆菌和戊糖 片球菌这两种优势菌株， 作为复合发酵剂接种鱼鲊， 明显提高了产品的营养品质， 并使产品 具有更浓郁的发酵风味。 裘迪红等用植物乳杆菌发酵草鱼， 并对草鱼发酵过程中的挥发性 成分进行了分析， 结果表明， 发酵使土腥味的己醛、 庚醛减少， 蘑菇香味的1-辛烯-3-醇增 多， 发酵后期还产生了有薄荷香味的丙酮和有奶油香味的乙偶姻等增香成分。 高沛对发酵 说明书 1/13 页 5 CN 110643546 A 5 成熟酸鱼的风味物质进行主成分分析， 发现Lp-120主要促进乙酸酯类风味物质的形成， S。

21、x- 135和Sc-31主要促进乙酯类风味物质的形成。 张潇等用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、 木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、 戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)混合发酵草鱼制作鲊鱼， 结果表 明， 接种发酵可使鲊鱼中的有害菌和生物胺得到抑制， 有利于保证鲊鱼产品的生物安全性。 因此如果采用优良的发酵剂进行接种发酵， 可在一定程度避免上述自然发酵方式所产生的 问题。 0006 目前， 用于发酵动物性食品的菌株种类主要是以乳酸菌、 葡萄球菌和酵母。

22、菌为主， 发酵植物性食品主要是以乳酸菌、 酵母菌和霉菌为主。 乳酸菌在发酵过程中能与发酵体系 中其他微生物等互相作用， 共同发酵产生醇、 醛、 酮、 酸等， 生成发酵食品的特殊风味物质， 同时它能够起到分解有机物， 产生乳酸、 醋酸、 丙酸等有机酸以及类似细菌素的细小蛋白质 或肽类(抗菌肽)， 具有抑制其他有害细菌生长的作用。 0007 然而， 发酵鱼类制品风味的形成不仅只是依靠乳酸菌代谢产生， 鱼体自身还含有 大量的内源酶会使蛋白质降解， 释放出游离氨基酸， 这就为微生物提供了可利用的底物。 然 而内源酶的释放需要较长的时间， 对风味的增加起到的作用比较慢。 因此， 可以通过添加一 些风味酶。

23、、 脂肪酶等蛋白酶类与微生物发酵协同作用， 使其在发酵过程中释放出更多的游 离氨基酸或游离脂肪酸， 加快发酵的进程， 丰富鱼肉的滋味成分并使其营养特性、 感官品质 得到一定程度的提高。 另外， 也可加入溶菌酶等抑菌酶类， 提高发酵鱼肉制品的安全性。 0008 此外， 鱼肉腌制前若含水量较高会在发酵过程中出水过多， 导致鱼肉鲜味降低， 因 此， 可以通过添加酵母抽提物来起到一个明显的增鲜作用。 酵母抽提物是以食品用酵母为 主要原料， 以酵母自身的酶或外加食品级酶的共同作用下， 酶解自溶(可再经分离提取)后 得到的产品， 并富含氨基酸、 肽、 多肽等酵母细胞中的可溶性成分， 具有良好的增鲜、 增香。

24、作 用。 酵母抽提物主要分为高肽类、 高I+G类以及高葡聚糖类， 具体特性描述见表1。 关于酵母 提取物用于改善发酵鱼制品风味， 提高鱼肉的鲜度研究报道还鲜有报道。 0009 在众多发酵淡水鱼产品中， 固态发酵是一种能提供优质蛋白质资源、 深受人们喜 爱的发酵方法， 在现代工业化生产中， 固态发酵相对液态发酵具有设备投资少、 操作简便等 优点， 因此， 微生物固态发酵剂逐渐成为热点， 对各种固态发酵剂的研究也相继增多。 固态 发酵剂是指经过真空冷冻干燥法、 喷雾干燥法或微波干燥法等方法制得呈干粉状或颗粒状 的发酵剂。 真空冷冻干燥作为目前多数微生物干燥的主要方法， 是指将菌液在较低的温度 (一。

25、般为-10-50)下冻结成固态， 然后在真空条件下使其中的水分不经液态直接升华成 气态， 最终使物料脱水的干燥技术， 其对菌体和菌体内的活性生物大分子保存较完备， 也适 用于热敏性和对热敏感的微生物； 喷雾干燥是直接将制备好的菌悬液经过雾化装置喷雾成 雾状， 在干燥室内与高温空气直接接触进行传热传质， 产品分散性和溶解性较好， 生产过程 简单， 设备相对成本较低， 特别适用于工业化连续生产； 微波干燥法是通过微波加热原理使 物料内部水分加热蒸发得到干燥效果的， 具有加热速度快的优点， 低剂量的微波还具有较 明显非热效应(亦称生物效应)， 能够改变微生物的细胞膜通透性、 代谢情况以及繁殖时间， 。

26、若采用较低温度的微波条件不仅可以降低物料的水分含量， 起到干燥作用， 同时还可以促 进菌体的代谢和生长， 且对食品的营养成分影响不大。 0010 综上所述， 现有技术存在的问题是： 说明书 2/13 页 6 CN 110643546 A 6 0011 (1)发酵鱼制品大多是利用自然界的微生物在适宜的温湿条件下发酵而成的， 这 种传统自然发酵方式的加工环境和发酵条件随机性强且因原料的不同， 使得每种发酵制品 的风味差异大， 产品品质难以控制， 安全性难以保证， 发酵周期较长， 从而导致这类发酵鱼 制品缺乏统一的生产质量标准， 难以实现工业化和规模化生产。 如果采用优良的菌种发酵 剂进行接种发酵，。

27、 可在一定程度避免上述自然发酵方式所产生的问题。 0012 (2)液态发酵是以液体为培养基， 进行微生物的生产繁殖并将其菌液进行接种， 此 法存在菌体生长量低， 占用空间大， 不易保存等缺点。 采用微生物固态发酵剂进行固态发 酵， 更有利于现代工化生产的现状， 具有设备投资少， 占用空间小， 易于保存， 操作简便等优 点。 0013 (3)在发酵过程中， 鱼体自身含有大量的内源酶会使蛋白质降解， 释放出游离氨基 酸， 为微生物提供了可利用的底物。 然而， 由于快速发酵的周期时间短， 从而导致内源酶的 释放需要较长的时间， 对风味的增加起到的作用比较慢。 无花果蛋白酶为蛋白酶的一种， 是 一种巯。

28、基肽链内切酶， 其活性部位含半胱氨酸残基， 优先水解酪氨酸及苯丙氨酸残基， 使其 在发酵过程中蛋白质水解成更多的分子小肽， 在短时间内释放出更多的游离氨基酸， 有利 于发酵鲊鱼制品在一个短期发酵周期中释放出更多的风味物质。 另外， 无花果蛋白酶可以 水解肌肉蛋白质和胶原蛋白， 使鱼肉制品嫩化， 使得鲊鱼制品的营养特性、 感官品质得到更 好地提升。 0014 (4)发酵鱼肉制品通常会随着发酵过程中水分的产生以及其他环境因素的影响， 从而导致鱼肉鲜香味不足。 酵母抽提物(YE)主要成分为多肽、 氨基酸、 呈味核苷酸、 B族维生 素和微量元素， 其中谷氨酸含量达到8左右， 呈味核苷酸(IMP， GM。

29、P)最高达到20以上， YE 是将MSG和IMP、 GMP三种鲜味物质集于一身的鲜味物质， 具有很好的增鲜特性。 0015 解决上述技术问题的难度： 0016 (1)菌酶比例复配比例的优选； 0017 (2)菌酶协同固态发酵剂干燥方式的优选； 0018 (3)为了起到增鲜作用酵母抽提物类型的选择。 0019 解决上述技术问题的意义： 0020 (1)确定一个最优的菌酶比例使得微生物与酶能更好地结合， 有利于在发酵过程 中增加其滋味成分并且使其营养特性得到一定程度地提高； 0021 (2)确定菌酶协同固态发酵剂的干燥方式能够最大程度地保留住该固态发酵剂的 活性和效果， 使得鲊鱼制品的品质得到更好。

30、地提升； 0022 (3)由于酵母菌抽提物的种类较多， 其根据种类的不同产品的特性也略有不同， 添 加一种最适合的酵母抽提物对鲊鱼制品的整体鲜味地提升起到一个很重要的作用。 发明内容 0023 针对现有技术存在的问题， 本发明提供了一种基于复合菌种结合无花果蛋白酶的 菌酶协同固态发酵剂。 0024 本发明是这样实现的， 一种基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作用固态 发酵剂， 所述基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作用固态发酵剂由菌酶母液、 填 充料(按菌酶母液质量的515加入)、 保护剂(按菌酶母液质量的520)组成。 说明书 3/13 页 7 CN 110643546 A 7 00。

31、25 所述菌酶母液由植物乳杆菌、 乳酸片球菌、 戊糖片球菌及无花果蛋白酶组成。 0026 所述植物乳杆菌XSB-0001， 已保藏于中国典型培养保藏中心CCTCC， 保藏号CCTCC M2012396。 0027 所述乳酸片球菌， 已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC， 保藏号CICC 10344。 0028 所述戊糖片球菌， 已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC， 保藏号CICC 10145。 0029 所述植物乳杆菌、 乳酸片球菌、 戊糖片球菌菌体活菌数106109cfu/mL； 所述植物 乳杆菌、 乳酸片球菌、 戊糖片球菌分别培养至1115h、 712h、 516h后。

32、6000rpm进行冷冻 离心浓缩后， 植物乳杆菌： 乳酸片球菌： 戊糖片球菌按菌泥体积比100： (10100)： (10 100)计。 0030 所述无花果蛋白酶的添加量为0.53.5mL/100g鱼肉， 所述无花果蛋白酶含量 1000020000U/mL。 0031 所述填充料分为喷雾干燥填充料(按质量比由26的可溶性淀粉、 26的脱 脂奶粉组成)、 真空冷冻干燥填充料(按质量比由510的预糊化淀粉、 26的脱脂 奶粉组成)、 微波干燥填充料(按质量比由0.52淀粉和0.52麦芽糊精组成)三 者中的一种。 0032 所述保护剂分别为喷雾干燥保护剂(按质量比由15甘油、 48蔗糖、 15 明。

33、胶组成)、 真空冷冻干燥保护剂(按质量比由13胶原小肽、 48海藻糖、 14 -环 糊精组成)、 微波干燥保护剂(按质量比由0.52蔗糖、 0.11甘油、 0.52脱脂乳和 0.52海藻酸钠组成)三者中的一种。 0033 本发明的另一目的在于提供一种基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作 用固态发酵剂的制备方法， 所述制备方法包括以下步骤： 0034 步骤一， 菌种的制备： 植物乳杆菌、 乳酸片球菌、 戊糖片球菌均采用MRS琼脂培养基 活化2次， 30培养分别培养至48h； 接种至200m L MRS液体培养基分别培养1115h、 7 12h、 516h， 使菌体活菌数均达到106109cf。

34、u/mL； 46000rpm冷冻离心， 菌体沉淀用无菌 生理盐水清洗两次， 重新悬浮于无菌生理盐水， 4冰箱保存， 24h内备用。 0035 步骤二， 菌酶母液的制备： 步骤一得到的活菌数达到106109cfu/mL的植物乳杆 菌、 乳酸片球菌、 戊糖片球菌在46000rpm冷冻离心浓缩后， 植物乳杆菌： 乳酸片球菌： 戊糖 片球菌按菌泥体积比为100： (10100)： (10100)计， 将菌泥混合， 加入1000020000U/mL 无花果蛋白酶液体； 无花果蛋白酶的添加量为0.53.5mL/100g鱼肉， 记为菌酶母液。 0036 步骤三， 干燥方式可采用喷雾干燥、 真空冷冻干燥或微波。

35、干燥三种方式中的一种。 0037 进一步， 所述步骤一菌种制备前需进行菌种活化， 具体包括： 0038 (1)冷冻干燥管开管， 用沾有70酒精的棉花擦拭外管， 在火焰上加热外管的尖 端， 滴数滴无菌水于加热处， 使外管破裂， 再以硬棒敲破尖端， 取出隔热纤维纸和内管， 以灭 菌过的镊子取出内管的棉塞。 0039 (2)无菌吸管， 吸取0.3-0.5mL指定的液体培养基， 滴入管内， 并震荡， 直到均匀悬 浮。 0040 (3)取0.1-0.2mL的菌体悬浮液于指定平板培养基上， 做划线分离培养或做稀释， 说明书 4/13 页 8 CN 110643546 A 8 用无菌L型玻璃棒均匀涂抹， 检。

36、验菌种的纯度及活化情况； 剩余菌体全部移入指定液体培养 基内， 并依据指定温度培养。 0041 进一步， 步骤三中， 所述三种干燥方式具体包括： 0042 (1)喷雾干燥： 按质量比计向菌酶母液加15甘油、 48蔗糖、 15明胶作 为抗热保护剂， 另加26的可溶性淀粉、 26的脱脂奶粉作为填充料； 设定其喷雾干燥 条件为： 进料温度1020、 出料温度6080、 流速为120mL/h180mL/h即得到固态复合 发酵菌剂， 该复合发酵剂的内控质量标准为三种菌株的活菌总数达到107cfu/mL； 采用聚乙 烯包装袋密封包装上述固态复合发酵菌剂， 在4保存备用。 0043 (2)真空冷冻干燥： 按。

37、质量比向菌酶母液中添加保护剂13胶原小肽、 48海 藻糖、 14 -环糊精作为保护剂， 另加510的预糊化淀粉、 26的脱脂奶粉作 为填充料； 先在-20冰箱预冻12h， 随后放入真空冷冻干燥机； 冻干程序为： 以-20-45 冻结菌酶母液， 持续34h， 随后以2/h程序升温到室温20， 真空度保持在100mbar以 下； 冻干之后进行简单地粉碎处理并装入铝箔包装袋， 在4保存备用。 0044 (3)微波干燥： 按质量比计加0.52蔗糖、 0.11甘油、 0.52脱脂乳和 0.52海藻酸钠作为保护剂， 另加0.52淀粉和0.52麦芽糊精； 设定的微 波条件是： 采用脉冲微波或间歇微波， 微波。

38、剂量为0.53kW/kg， 总处理时间为260min， 其 中微波时间占总处理时间的3070， 使干燥结束时发酵剂的温度至70以下， 水分含量 至1520或以下。 0045 本发明的另一目的在于提供一种基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作 用固态发酵剂的发酵鲊鱼的发酵方法， 所述发酵鲊鱼的发酵方法包括以下步骤： 0046 步骤1， 接种发酵， 新鲜草鱼洗净， 去头、 去尾、 去内脏， 切成约1cm2cm2cm的小 块， 洗净并沥水； 鲜红辣椒洗净， 去籽后剁碎； 生姜洗净去皮， 切碎； 称取鱼肉100g、 米粉15 60g、 辣椒1030、 生姜210、 食盐15， 加水3050mL， 接。

39、入固态发酵剂， 按 鱼体重量计加入110， 装瓶、 压实并密封； 置于1535恒温培养箱， 保温发酵24 72h。 0047 步骤2， 终止发酵， 将发酵好的草鱼肉块取出， 按质量比计加入0.51.5的安 琪酵母抽提物(安琪酵母提取物产品性能见表1)FA02或FA28或KK02或FA31或KU012或 FIG12LS或FIG18LS或FA01或FIG00或F55或F58进行混匀后放入真空包装袋， 将其100蒸煮 20min40min终止发酵， 冷却至室温； 其中， 自然发酵作为空白对照组。 0048 所述自然发酵作为空白对照组的方法步骤包括： 0049 新鲜草鱼洗净， 去头、 去尾、 去内脏，。

40、 切成约1cm2cm2cm的小块， 洗净并沥水； 鲜 红辣椒洗净， 去籽后剁碎； 生姜洗净去皮， 切碎； 称取鱼肉100g、 米粉1560g、 辣椒10 30、 生姜210、 食盐15， 加水3050mL， 混合均匀装瓶、 压实并密封； 置于15 35恒温培养箱， 保温发酵2472h后， 将发酵好的草鱼肉块取出放入真空包装袋， 将其100 蒸煮20min40min终止发酵， 冷却至室温。 0050 进一步， 步骤1、 步骤2中， 所述发酵温度2535。 0051 表1安琪酵母提取物产品性能 说明书 5/13 页 9 CN 110643546 A 9 0052 0053 本发明的另一目的在于提供。

41、一种基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作 用固态发酵剂的发酵臭鳜鱼的发酵方法， 所述发酵臭鳜鱼的发酵方法包括以下步骤： 0054 步骤I， 接种发酵， 新鲜鳜鱼去头、 去尾、 去内脏， 洗净并沥水； 鲜红辣椒洗净， 去籽 后剁碎； 生姜洗净去皮， 切碎； 称取鱼肉100g、 辣椒1030、 生姜210， 食盐1 5， 加水3050mL， 接入固态发酵剂， 按鱼体重量计加入110， 装瓶、 压实并密封； 置 于1025恒温培养箱， 保温发酵2d10d。 0055 步骤II， 终止发酵， 将发酵好的鳜鱼肉取出， 按质量比计加入0.51.5的酵母 抽提物FA02或FA28或KK02或FA31或K。

42、U012或FIG12LS或FIG18LS或FA01或FIG00或F55或F58 进行混匀后放入真空包装袋中， 将其100蒸煮2040min终止发酵， 冷却至室温； 其中， 自 然发酵作为空白对照组。 0056 所述自然发酵作为空白对照组的方法步骤包括： 0057 新鲜鳜鱼去头、 去尾、 去内脏， 洗净并沥水； 鲜红辣椒洗净， 去籽后剁碎； 生姜洗净 去皮， 切碎； 称取鱼肉100g、 辣椒1030、 生姜210， 食盐15， 加水30 50mL， 混合均匀装瓶、 压实并密封； 置于1025恒温培养箱， 保温发酵210d后取出鳜鱼， 放入真空包装袋中， 将其100蒸煮2040min终止发酵， 冷。

43、却至室温。 0058 进一步， 步骤I、 步骤II中， 所述发酵温度1025。 0059 综上所述， 本发明的优点及积极效果为： 0060 本发明采用优良的固态复配发酵菌剂进行接种发酵， 能够明显缩短发酵鱼肉的周 期， 在一定程度上避免杂菌的污染， 提升产品的安全性， 降低生产成本， 还可以改善产品的 营养、 品质和风味， 有助于使传统发酵鱼制品实现工业化、 标准化和规模化的生产。 0061 本发明将发酵菌液制成固态发酵剂， 在产品上产上具有设备投资少、 操作简便等 说明书 6/13 页 10 CN 110643546 A 10 优点， 利于工业化生产。 0062 本发明采用菌酶结合协同发酵的。

44、方法对鱼肉进行快速发酵， 无花果蛋白酶为蛋白 酶的一种， 是一种巯基肽链内切酶， 其活性部位含半胱氨酸残基， 优先水解酪氨酸及苯丙氨 酸残基， 使其在发酵过程中蛋白质水解成更多的分子小肽， 在短时间内释放出更多的游离 氨基酸， 有利于发酵鲊鱼制品在一个短期发酵周期中释放出更多的风味物质。 另外， 无花果 蛋白酶可以水解肌肉蛋白质和胶原蛋白， 使鱼肉制品嫩化， 使得鲊鱼制品的营养特性、 感官 品质得到更好地提升。 0063 本发明按质量比计加入一定量的酵母抽提物， 酵母抽提物(YE)主要成分为多肽、 氨基酸、 呈味核苷酸、 B族维生素和微量元素， 其中谷氨酸含量达到8左右， 呈味核苷酸 (IMP。

45、， GMP)最高达到20以上， YE是将MSG和IMP、 GMP三种鲜味物质居于一身的鲜味物质， 具 有很好的增鲜特性。 关于酵母提取物用于改善发酵鱼制品风味， 提高鱼肉的鲜度研究报道 还鲜有报道。 附图说明 0064 图1是本发明实施例提供的基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协同作用固态 发酵剂的制备方法流程图。 0065 图2是本发明实施例提供的发酵鲊鱼的发酵方法流程图。 0066 图3是本发明实施例提供的发酵臭鳜鱼的发酵方法流程图。 0067 图4是本发明实施例提供的发酵鱼肉制品的总酸含量和pH值示意图。 0068 图5是本发明实施例提供的发酵鱼肉制品的挥发性盐基氮含量和硫代巴比妥酸含 。

46、量示意图。 0069 图6是本发明实施例提供的发酵鱼肉制品的滋味特征雷达图。 具体实施方式 0070 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明 进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于 限定本发明。 0071 发酵鱼制品大多是利用自然界的微生物在适宜的温湿条件下发酵而成的， 这种传 统自然发酵方式的加工环境和发酵条件随机性强且因原料的不同， 使得每种发酵制品的风 味差异大， 产品品质难以控制， 安全性难以保证， 发酵周期较长， 从而导致这类发酵鱼制品 缺乏统一的生产质量标准， 难以实现工业化和规模化生产。 液态。

47、发酵是以液体为培养基， 进 行微生物的生产繁殖并将其菌液进行接种， 此法存在菌体生长量低， 占用空间大， 不易保存 等缺点。 在发酵过程中， 鱼体自身含有大量的内源酶会使蛋白质降解， 释放出游离氨基酸， 为微生物提供了可利用的底物。 然而， 由于快速发酵的周期时间短， 从而导致内源酶的释放 需要较长的时间， 对风味的增加起到的作用比较慢。 发酵鱼肉制品通常会随着发酵过程中 水分的产生以及其他环境因素的影响， 从而导致鱼肉鲜香味不足。 0072 针对现有技术存在的问题， 本发明提供了一种基于复合菌种结合无花果蛋白酶的 菌酶协同作用固态发酵剂， 下面结合附图对本发明作详细的描述。 0073 如图1。

48、所示， 本发明实施例提供的一种基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协 说明书 7/13 页 11 CN 110643546 A 11 同作用固态发酵剂的制备方法包括以下步骤： 0074 S101： 菌种的制备： 植物乳杆菌、 乳酸片球菌、 戊糖片球菌均采用MRS琼脂培养基活 化2次， 30培养分别培养至48h； 接种至200m L MRS液体培养基分别培养1115h、 712h、 516h， 使菌体活菌数均达到106109cfu/mL； 46000rpm冷冻离心， 菌体沉淀用无菌生理 盐水清洗两次， 重新悬浮于无菌生理盐水， 4冰箱保存， 24h内备用。 0075 S102： 菌酶母液的制备： 。

49、S101得到的活菌数达到106109cfu/mL的植物乳杆菌、 乳 酸片球菌、 戊糖片球菌在46000rpm离心后， 植物乳杆菌： 乳酸片球菌： 戊糖片球菌按菌泥 体积比为100： (10100)： (10100)计， 将菌泥混合， 加入1000020000U/mL无花果蛋白酶 液体； 无花果蛋白酶的添加量为0.53.5mL/100g鱼肉， 记为菌酶母液。 0076 S103： 采用喷雾干燥、 真空冷冻干燥或微波干燥方式中的一种进行干燥。 0077 如图2所示， 本发明实施例提供的一种基于复合菌种结合无花果蛋白酶的菌酶协 同作用固态发酵剂的发酵鲊鱼的发酵方法包括以下步骤： 0078 S201：。

50、 接种发酵， 新鲜草鱼洗净， 去头、 去尾、 去内脏， 切成约1cm2cm2cm的小 块， 洗净并沥水； 鲜红辣椒洗净， 去籽后剁碎； 生姜洗净去皮， 切碎； 称取鱼肉100g、 米粉15 60g、 辣椒1030、 生姜210、 食盐15， 加水3050mL， 接入固态发酵剂， 按 鱼体重量计加入110， 装瓶、 压实并密封； 置于1535恒温培养箱， 保温发酵24 72h。 0079 S202： 终止发酵， 将发酵好的草鱼肉块取出， 按质量比计加入0.51.5的安琪 酵母抽提物(安琪酵母提取物产品性能见表1)FA02或FA28或KK02或FA31或KU012或FIG12LS 或FIG18LS。