冰醋酸中细菌内毒素的检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910975968.9 (22)申请日 2019.10.15 (71)申请人 浙江华海药业股份有限公司 地址 317024 浙江省台州市临海市汛桥开 发区 (72)发明人 赵云蓝赵武群付强徐兴志 (51)Int.Cl. G01N 33/579(2006.01) (54)发明名称 一种冰醋酸中细菌内毒素的检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种冰醋酸中细菌内毒素的 检测方法， 采用凝胶法进行检测， 供试液采取挥 干后复溶的方法制备。 供试液的制备方法为： 首 先吸取适量体积冰。

2、醋酸溶液于除热原的蒸发皿 中， 在15-90条件下加热使其挥干， 然后用适 量细菌内毒素检查用水复溶， 涡旋2-10min使其 溶解， 最后得到适宜浓度的供试品溶液。 与现有 技术相比， 本发明提出的预处理方法有效解决了 内毒素检测的假阴性干扰问题， 操作简便可靠， 重现性强， 灵敏度高， 对保证制剂的安全性具有 重要的意义。 权利要求书1页 说明书5页 CN 110632319 A 2019.12.31 CN 110632319 A 1.一种冰醋酸中细菌内毒素的检测方法， 其特征在于： 采用凝胶法进行检测， 供试液采 取挥干后复溶的方法制备。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于：。

3、 所述采用凝胶法进行检测中使用的所 有玻璃器皿均以250烘干2h以上， 除去外源性内毒素干扰。 3.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于： 所述的供试液采取挥干后复溶的方法 制备， 方法如下： 首先吸取适量体积冰醋酸溶液于除热原的蒸发皿中， 在加热温度15-90条件下加 热使其挥干， 然后用适量细菌内毒素检查用水复溶， 涡旋2min-10min使其溶解， 最后得到适 宜浓度的供试品溶液。 4.根据权利要求3所述的检测方法， 其特征在于： 所述的加热温度选自30-90。 5.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于： 所述的加热温度选自32-42。 6.根据权利要求3-5之一所述的检测方。

4、法， 其特征在于： 所述的用水复溶的最大有效稀 释倍数不大于40倍。 7.一种冰醋酸中细菌内毒素的检测方法， 包括以下步骤： a)取适量冰醋酸溶液于15-90挥干后， 取5倍体积的细菌内毒素检查用水复溶制成 供试品储备液； b)以浓度为2 、 、 0.5 、 0.25 的细菌内毒素标准品进行鲎试剂灵敏度的复核， 记录结 果； c)将a)的供试品储备液分别与细菌内毒素标准品按比例混匀； 并用细菌内毒素检查用 水稀释至2 、 、 0.5 、 0.25 的最终浓度， 涡旋1min， 进行干扰实验， 记录结果； d)将a)的供试品储备液以细菌内毒素检查用水稀释至40倍制得供试品溶液， 供试品溶 液分别。

5、与鲎试剂反应， 进行供试品细菌内毒素检测， 记录结果。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于： 所述的供试品溶液分别与鲎试剂反应 的方法是在37试管恒温仪中培养60min2min， 培养结束后从试管恒温仪中轻轻取出， 避 免振动， 并缓缓倒转180 观察， 记录结果。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110632319 A 2 一种冰醋酸中细菌内毒素的检测方法 技术领域 0001 本发明属于微生物检验领域， 涉及一种检测冰醋酸辅料细菌内毒素的方法。 技术背景 0002 冰醋酸， 即无水乙酸， 是重要的有机酸之一， 冰醋酸无毒和无刺激性， 具有抗真菌、 防腐、 消毒及腐蚀作用。 常在。

6、注射剂中使用， 主要作用包括酸度调节剂、 酸化剂、 抗微生物剂 等。 0003 在注射剂产品开发中， 为了保证患者注射药物后不会导致发热等不良反应， 需对 原料中细菌内毒素含量进行严格的控制， 以保证产品安全性。 细菌内毒素是多种革兰氏阴 性菌的细胞壁中一种名为脂多糖的成分， 是热原的主要组分。 细菌内毒素大量进入血液就 会引发热反应， 导致发热、 白细胞反应、 内毒素休克及扩散性血管内凝血等。 当冰醋酸作为 注射剂辅料时， 对其细菌内毒素限度的控制是产品关键控制项目之一。 0004 凝胶法是2015版中国药典收录的细菌内毒素检查法之一， 该法具有容易操作、 准 确性好、 灵敏度高， 实用性强。

7、， 费用较低的特点。 凝胶法细菌内毒素检查时， 首先根据样品内 毒素控制限度和所选鲎试剂灵敏度计算样品最大有效稀释倍数(MVD)， 在最大有效稀释倍 数(MVD)以内对样品进行稀释后， 进行内毒素限度检测。 但研究发现， 冰醋酸稀释至最大稀 释倍数依然存在假阴性干扰， 导致供试品阳性对照组无法凝集， 选取不同灵敏度的鲎试剂 都不能解决问题， 故不能使用直接稀释的方法进行冰醋酸凝胶法内毒素限度检测。 0005 CN10171870A公开了一种细菌内毒素的检测方法， 该专利中样品溶液配制稀释至 2-8倍， 并分别加入磷酸盐标准缓冲液约10滴调节pH至6.8左右， 以消除假阴性干扰。 在研究 过程中。

8、发现， 以不同浓度碳酸钠或其他商品化调节剂， 调节冰醋酸供试品溶液至pH约为6- 8， 供试品阳性对照组依然存在假阴性干扰， 表明添加调节剂也不能解决干扰问题。 0006 我们研究发现， 采用中国药典2015版细菌内毒素检查法-凝胶法进行冰醋酸辅料 细菌内毒素限度检测时， 将样品稀释至最大有效稀释倍数(MVD)后干扰仍不能消除， 之后加 入碳酸钠等调节剂进一步去除干扰， 但结果表明上述方法均不适用于冰醋酸辅料中细菌内 毒素限度控制， 因此需要新的方法以控制冰醋酸辅料中细菌内毒素限度。 发明内容 0007 为了克服现有技术冰醋酸辅料中内毒素检测方法存在的假阴性干扰技术问题， 本 发明提供一种新的。

9、检测方法， 避免了常规方法中假阴性干扰的问题， 该方法操作简便， 准确 性高， 重现性好， 对保证注射剂的安全性非常重要的意义。 0008 本发明所述的一种冰醋酸中内毒素检测方法， 采用凝胶法进行检测， 供试液采取 挥干后复溶的方法制备。 0009 本发明所述的一种冰醋酸中内毒素检测方法， 使用的所有玻璃器皿均烘干， 除去 外源性内毒素干扰， 优选烘干条件是在250烘干2h以上。 0010 本发明所述的一种冰醋酸中内毒素检测方法， 供试液制备方法如下： 吸取适量体 说明书 1/5 页 3 CN 110632319 A 3 积冰醋酸溶液于除热原的蒸发皿中， 在15-90条件下加热使其挥干， 用适。

10、量细菌内毒素 检查用水复溶， 涡旋2min-10min使其溶解， 得到适宜浓度的供试品溶液。 0011 本发明提供优选加热温度30-90， 进一步优选32-42。 0012 本发明所述的一种冰醋酸中内毒素检测方法， 冰醋酸辅料的细菌内毒素限值不高 于L2.5EU/mL， 则最大有效稀释倍数(MVD)L/ ， 根据鲎试剂标示灵敏度( 0.0625EU/ mL)， 计算出MVD不大于40倍， 即所述的用水复溶的最大有效稀释倍数不大于40倍。 0013 另外本发明还提供了一种冰醋酸中细菌内毒素检测方法， 包括以下步骤： 0014 a)取适量冰醋酸溶液于15-90挥干后， 取5倍体积的细菌内毒素检查用。

11、水复溶 制成供试品储备液； 0015 b)以浓度为2 、 、 0.5 、 0.25 的细菌内毒素标准品进行鲎试剂灵敏度的复核， 记 录结果。 0016 c)将a)的供试品储备液分别与细菌内毒素标准品按比例混匀； 并用细菌内毒素检 查用水稀释至2 、 、 0.5 、 0.25 的最终浓度， 涡旋1min， 进行干扰实验， 记录结果。 0017 d)将a)的供试品储备液以细菌内毒素检查用水稀释至40倍制得供试液， 供试品溶 液分别与鲎试剂反应， 进行供试品细菌内毒素检测， 记录结果。 0018 本发明所述的一种冰醋酸中内毒素检测方法， 鲎试剂反应在37试管恒温仪中培 养60min2min。 培养结。

12、束后从试管恒温仪中轻轻取出， 避免振动， 并缓缓倒转180 观察。 0019 本发明有益的技术效果是： 采用加热挥干法消除冰醋酸对凝胶细菌内内毒素限度 检测中的干扰， 避免了现有技术中假阴性干扰的问题， 检测结果准确可靠， 操作简便， 重现 性好， 对保证注射剂的安全性具有重要的意义。 具体实施方式 0020 为了更充分理解本发明， 特给出以下具体实施例， 但本发明不限定于以下实施例。 0021 1、 实验材料及仪器 0022 实验材料： 0023 鲎试剂： 湛江安度斯， 规格： 0.1mL/支， 灵敏度： 0.0625EU/mL； 细菌内毒素工作标准 品： 中国药品生物制品检定所， 效价： 。

13、80EU/支， 批号： 150601-201886； 细菌内毒素检查用水： 中国药品生物制品检定所， 批号： 1803090。 0024 仪器： 干热灭菌柜、 电热恒温水浴锅、 隔水式恒温培养箱、 旋涡混合器等。 0025 对比实施例1： 0026 操作步骤为： 称取碳酸钠0.2g溶于2mL内毒素检查用水， 配制成浓度为100mg/mL的 溶液作为pH调节剂。 取0.5mL冰醋酸溶液， 与2mL检查用水涡旋混匀， 制备供试品储备液。 取 供试品储备液0.15mL与0.15mL检查用水混匀， 加入0.3mL碳酸钠溶液静置2min， 涡旋6min即 得供试品溶液。 取供试品储备液0.15mL与0.。

14、15mL不同浓度内毒素混匀， 加入0.3mL碳酸钠溶 液静置2min， 涡旋6min， 得到含2 、 、 0.5 、 0.25 内毒素的供试品溶液。 再将上述配制的供 试品溶液和含2 、 、 0.5 、 0.25 内毒素的供试品溶液分别与鲎试剂反应， 372试管恒 温仪中培养60min2min， 记录结果， 见下表1。 鲎试剂( 0.125EU/mL)： 批号1702101， 安度 斯。 0027 表1 说明书 2/5 页 4 CN 110632319 A 4 0028 0029 以上表1结果说明： 采用100mg/mL碳酸钠溶液作为pH调节剂， 进行冰醋酸细菌内毒 素方法考察时， 干扰实验存。

15、在假阴性干扰， 表明本法不适用于冰醋酸辅料中细菌内毒素限 度控制。 0030 对比实施例2： 0031 操作步骤为： 称取碳酸钠0.25g溶于4mL内毒素检查用水， 配制成浓度为62.5mg/mL 的溶液作为pH调节剂。 取0.5mL冰醋酸溶液， 与2mL检查用水涡旋混匀， 制备供试品储备液。 取供试品储备液0.1mL与0.1mL检查用水混匀， 加入0.2mL检查用水混合后再加入0.4mL碳酸 钠溶液静置2min， 涡旋6min即得供试品溶液。 取供试品储备液0.1mL与0.1mL不同浓度内毒 素混匀， 加入0.2mL检查用水混合后再加入0.4mL碳酸钠溶液静置2min， 涡旋6min， 得到。

16、含2 、 、 0.5 、 0.25 内毒素的供试品溶液。 将上述配制的供试品溶液和含2 、 、 0.5 、 0.25 内 毒素的供试品溶液分别与鲎试剂反应， 372试管恒温仪中培养60min2min， 记录结 果， 见下表2。 鲎试剂( 0.125EU/mL)： 批号1702101， 安度斯。 0032 表2 说明书 3/5 页 5 CN 110632319 A 5 0033 0034 以上表2结果说明： 采用62.5mg/mL碳酸钠溶液作为pH调节剂， 进行冰醋酸细菌内 毒素方法考察时， 干扰实验存在假阴性干扰， 表明通过调节碳酸钠的用量， 也不能实现冰醋 酸辅料中细菌内毒素限度控制。 00。

17、35 实施例1： 0036 操作步骤为： 吸取0.5mL冰醋酸溶液于除热原的蒸发皿中， 855加热使其挥 干， 用2.5mL细菌内毒素检查用水复溶， 涡旋5min使其溶解， 得到供试品储备液。 取此储备液 0.1mL与0.7mL检查用水混匀， 得到供试品溶液。 取供试品储备液0.1mL与0.1mL浓度为16 、 8 的内毒素标准液混匀， 再加入0.6mL检查用水混合， 得到含2 、 内毒素的供试品溶液。 将上 述配制的供试品溶液和含2 、 内毒素的供试品溶液分别与鲎试剂反应， 372试管恒 温仪中培养60min2min， 记录结果， 见下表3。 鲎试剂( 0.125EU/mL)： 批号1805。

18、071， 安度 斯。 0037 表3 0038 0039 以上表3结果说明： 采用855加热挥干的方法， 进行冰醋酸细菌内毒素方法 考察时， 干扰实验不存在干扰， 表明本法适用于冰醋酸辅料中细菌内毒素限度控制。 说明书 4/5 页 6 CN 110632319 A 6 0040 实施例2： 0041 操作步骤为： 吸取0.5mL冰醋酸溶液于除热原的蒸发皿中， 355加热使其挥 干， 用2.5mL细菌内毒素检查用水复溶， 涡旋5min使其溶解， 得到供试品储备液。 取此储备液 0.1mL与0.7mL检查用水混匀， 得到供试品溶液。 取供试品储备液0.1mL与0.1mL浓度为16 、 8 的内毒素。

19、标准液混匀， 再加入0.6mL检查用水混合， 得到含2 、 内毒素的供试品溶液。 将上 述配制的供试品溶液和含2 、 内毒素的供试品溶液分别与鲎试剂反应， 372试管恒 温仪中培养60min2min， 记录结果， 见下表4。 鲎试剂( 0.125EU/mL)： 批号1805071， 安度 斯。 0042 表4 0043 0044 0045 以上表4结果说明： 采用355加热挥干的方法， 进行冰醋酸细菌内毒素方法 考察时， 干扰实验通过， 表明本法适用于冰醋酸辅料中细菌内毒素限度控制。 0046 另外重复实施例2实验步骤， 在205或605加热使其挥干， 得到的实验 结果与实施例2结果相同， 因此证明本发明分析方法准确性高， 重现性好。 说明书 5/5 页 7 CN 110632319 A 7 。