伊文思蓝在制备药物中的用途及药物组合物.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911014475.5 (22)申请日 2019.10.23 (71)申请人 武汉威立得生物医药有限公司 地址 430075 湖北省武汉市东湖新技术开 发区高新大道666号光谷生物城B7 (72)发明人 陈绪林肖宇 (51)Int.Cl. A61K 31/655(2006.01) A61K 45/06(2006.01) A61P 31/20(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (54)发明名称 伊文思蓝在制备药物中的用途及药物组合 物 (57)摘要 本发。

2、明提出了伊文思蓝在制备治疗HBV病毒 感染药物中的应用及一种用于治疗或者预防乙 型肝炎病毒感染的药物组合物。 所述药物或药物 组合物可有效抑制乙型肝炎病毒的进入和病毒 颗粒的组装， 可有效用于治疗或者预防乙型肝炎 病毒感染引起的肝炎。 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 CN 110623968 A 2019.12.31 CN 110623968 A 1.伊文思蓝在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用。 2.一种用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染的药物组合物， 其特征在于， 包括： 伊文思蓝作为活性成分； 以及 第二药剂， 所述第二药剂不同于伊文思蓝并且用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染。。

3、 3.根据权利要求2所述的药物组合物， 其特征在于， 进一步包括药学上可接受的载体。 4.根据权利要求2所述的药物组合物， 其特征在于， 所述第二药剂包括选自下列的至少 一种： 干扰素、 聚乙二醇干扰素、 拉米夫定、 阿德福韦、 恩替卡韦、 替比夫定、 替诺福韦。 5.根据权利要求2所述的药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物呈片剂、 注射剂、 粉 剂、 酏剂、 胶囊、 混悬液、 糖浆、 药丸、 缓释制剂、 控释制剂或纳米制剂。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110623968 A 2 伊文思蓝在制备药物中的用途及药物组合物 技术领域 0001 本发明涉及生物医药领域， 具体地， 本发。

4、明涉及伊文思蓝在制备药物中的用途及 药物组合物， 更具体地， 本发明涉及伊文思蓝在制备药物中的用途及一种用于治疗或者预 防乙型肝炎病毒感染的药物组合物。 背景技术 0002 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染是世界上最为普遍的慢性病毒性感 染。 HBV主要通过血液传播、 性行为传播、 母婴传播等途径传播。 乙肝病毒感染是世界上很严 重的健康问题， 在全世界约有2.2亿HBV携带者， 导致每年有768000人死亡,是世界第十大致 死原因。 0003 而目前治疗乙肝病毒感染的药物应用于临床的只有两种干扰素， 分为干扰素 (IFN)和聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)两种形。

5、式， 先后于1990和2005年被FDA批准； 和五种核苷 类似物的病毒聚合酶抑制剂药物， 即拉米夫定(Lamivudine ,3TC或LMV)， 阿德福韦 (Adefovir,ADV)， 恩替卡韦(Entecavir,ETV)， 替比夫定(Telbivudine,LdT)和替诺福韦 (Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)。 但是干扰素具有人群耐受性， 且有较大的副作 用； 而聚合酶抑制剂不能清除cccDNA， 停药后病毒复制会迅速反弹， 并且长期服用还会使病 毒发生变异而产生抗药性。 0004 因此， 筛选新的抗乙型肝炎病毒感染的药物显的尤为迫切和重要。 00。

6、05 伊文思蓝(Evans blue)一直是作为一个常见的生物染料， 通常用于组织切片染 色， 血脑屏障(BBB)通透性检测和抗超敏递质实验。 同时有文献报道， 伊文思蓝还有具有抑 制HIV感染。 0006 然而， 伊文思蓝的用途还有待进一步开发。 发明内容 0007 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。 0008 本申请是基于发明人对以下事实的发现和认识而作出的： 0009 伊文思蓝可以明显抑制HBV的感染， 同时， 伊文思蓝还可以显著抑制HBV病毒颗粒 的组装。 这说明伊文思蓝具有抑制病毒侵入细胞和抑制病毒颗粒组装的双重抗HBV作用。 0010 为此， 本发明提出了伊文。

7、思蓝在制备以HBV病毒侵入和病毒颗粒的组装为靶标的、 抗乙型肝炎病毒感染的药物中的新用途。 0011 在本发明的第一方面， 本发明提出了伊文思蓝在制备药物中的用途。 根据本发明 的实施例， 所述药物用于抑制乙型肝炎病毒进入细胞； 或治疗或者预防乙型肝炎病毒感染。 根据本发明的实施例， 伊文思蓝还可显著抑制HBV的核衣壳组装和肝细胞内HBV病毒衣壳总 DNA， 因此， 本发明所提出的伊文思蓝在制备药物中的用途， 所述药物可显著抑制乙型肝炎 病毒颗粒组装； 或显著治疗或者预防乙型肝炎病毒感染。 0012 根据本发明的实施例， 上述伊文思蓝在制备药物中的用途还可以进一步包括下列 说明书 1/7 页 。

8、3 CN 110623968 A 3 附加技术特征至少之一： 0013 根据本发明的实施例， 所述药物用于治疗或者预防人类乙型肝炎病毒感染。 在本 发明的一些实施例中， 发明人发现， 伊文思蓝可显著抑制HBV对人肝癌细胞系Huh7DhNTCP， 人 肝原代细胞(PHH)和稳定表达人源NTCP蛋白的猪原代肝细胞(hNTCP-PPH)的感染。 同时， 伊 文思蓝还能明显抑制人肝癌细胞系HepAD38细胞中HBV核衣壳的组装和核衣壳DNA的水平。 因此， 本发明所提出的伊文思蓝在制备药物中的用途， 所述药物用于治疗或者预防人类乙 型肝炎病毒感染的效果能进一步提高。 0014 根据本发明的实施例， 上。

9、述药物组合物还可以进一步包括药学上可接受的载体。 根据本发明的实施例， 药学上可接受的载体可提高所述药物组合物的稳定性和有效成分的 可利用度， 从而进一步提高了所述药物组合物对乙型肝炎病毒感染的治疗或者预防。 0015 根据本发明的实施例， 所述药物组合物进一步包括第二药剂， 所述第二药剂不同 于伊文思蓝并且用于治疗或者预防乙型肝炎病毒感染。 根据本发明的实施例， 所述第二药 剂与伊文思蓝联用进一步提高了所述药物组合物对乙型肝炎病毒感染的治疗或者预防。 0016 根据本发明的实施例， 所述第二药剂包括选自下列的至少一种： 干扰素(IFN)、 聚 乙二醇干扰素(PEG-IFN)、 拉米夫定(La。

10、mivudine,3TC或LMV)、 阿德福韦(Adefovir,ADV)、 恩 替卡韦(Entecavir,ETV)、 替比夫定(Telbivudine,LdT)、 替诺福韦(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)。 拉米夫定、 阿德福韦、 恩替卡韦、 替比夫定、 替诺福韦是HBV病毒聚合酶抑制 剂药物。 伊文思蓝抑制HBV病毒感染的靶点不同于上述第二药剂， 伊文思蓝以HBV侵入和核 衣壳组装为靶点， 不存在使病毒产生抗药性突变的风险， 能持续有效地达到清除乙型肝炎 病毒的目的。 根据本发明的实施例， 上述第二药剂的至少之一与伊文思蓝联用， 所述药物组 合物的对。

11、乙型肝炎病毒感染的治疗或者预防的效果更加显著。 0017 根据本发明的实施例， 所述药物组合物呈片剂、 注射剂、 粉剂、 酏剂、 胶囊、 混悬液、 糖浆、 药丸、 缓释制剂、 控释制剂或纳米制剂。 各种剂型的药物组合物以可以预期的给药方 式给药， 抑制HBV侵入和病毒颗粒的组装， 从而进一步有效治疗或者预防乙型肝炎病毒感 染。 0018 根据本发明的一些实施例， 以伊文思蓝为活性成分的药物组合物可以包括药物上 可接受的载体， 且药物组合物的剂型和给药方式不受特别限制。 对于口服给药， 该药物上可 接受的载体可以包括粘合剂， 润滑剂， 崩解剂， 赋形剂， 增溶剂， 分散剂， 稳定剂， 悬浮剂， 。

12、着 色剂和芳香剂。 对于注射制剂， 药物上可接受的载体可以包括缓冲剂， 防腐剂， 止痛剂， 增溶 剂， 等渗压剂(isotonic agent)和稳定剂。 对于局部给药的制剂， 药物上可接受的载体可以 包括碱， 赋形剂， 润滑剂和防腐剂。 本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体 结合被制备成各种剂型。 例如， 对于口服给药， 药物组合物可以被制备成小片， 片剂， 胶囊， 酏剂， 混悬液或糖浆。 对于注射制剂， 药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿 或例如多剂量容器的单元型剂型。 药物组合物还可以被制备成溶液， 悬浮液， 药片， 药丸， 胶 囊、 长效制剂、 缓释制剂、 控释。

13、制剂或纳米制剂。 0019 根据本发明的实施例， 本发明的以伊文思蓝为活性成分的药物组合物在无细胞毒 性的浓度下， 能显著地抑制乙型肝炎病毒侵入和病毒颗粒的组装， 从而可以在治疗或预防 乙型肝炎病毒感染时被给药。 0020 在本文中所使用的术语 “给药” 指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。 说明书 2/7 页 4 CN 110623968 A 4 本发明的药物或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药， 只要它可以到达预期的组 织。 给药的各种方式是可以预期的， 包括腹膜， 静脉， 肌肉， 皮下， 皮层， 口服， 局部， 鼻腔， 肺 部和直肠， 但是本发明不限于这些已举例的给药方式。 。

14、然而， 由于口服给药时， 口服给药的 组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解。 优选地， 本发明的组合物 可以注射制剂被给药。 此外， 本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特 定器械来给药。 0021 本发明药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定， 该因素包括 要被治疗的疾病类型， 给药途径， 病人年龄， 性别， 体重和疾病的严重程度以及作为活性成 分的药物类型。 根据本发明的一些实施例， 日剂量可分为适宜形式的1剂、 2剂或多剂， 以在 整个时间段内以1次、 2次或多次给药， 只要达到治疗有效量即可。 0022 术语 “治疗有效量” 是指化合物足以。

15、显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量， 也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。 例如， 在乙型肝炎病毒感染治疗中， 减少、 预防、 延缓、 抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。 治疗有 效量的药物组合物或化合物不需要治愈疾病或病症， 但将为疾病或病症提供治疗， 使得个 体的疾病或病症的发作被延缓、 阻止或预防， 或者疾病或病症的症状得以缓解， 或者疾病或 病症的期限被改变， 或者例如疾病或病症变得不严重， 或者加速康复。 0023 术语 “治疗” 用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。 所述效果就完全或部分 预防疾病或其症状而言可以是预防性的， 和/或就部分或。

16、完全治愈疾病和/或疾病导致的不 良作用而言可以是治疗性的。 本文使用的 “治疗” 涵盖哺乳动物、 特别是人的疾病(主要指乙 型肝炎病毒感染)的治疗， 包括： (a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如 预防乙型肝炎病毒感染)或病症发生； (b)抑制疾病， 例如阻滞疾病发展； 或(c)缓解疾病， 例 如减轻与疾病相关的症状。 本文使用的 “治疗” 涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、 治愈、 缓解、 改善、 减轻或抑制个体的疾病的任何用药， 包括但不限于将含本文所述以伊文思蓝为 活性成分的药物组合物给予有需要的个体。 附图说明 0024 图1是根据本发明实施例1的伊文思蓝(Evans 。

17、blue)抗HBV活性检测结果图， 0025 其中， 图1A是伊文思蓝的结构图， 0026 图1B是伊文思蓝对Huh7DhNTCP的细胞毒性和上清中HBeAg的抑制率， 0027 图1C是伊文思蓝可以剂量依赖的抑制细胞中的HBV总DNA的实时定量PCR结果图， 0028 图1D是伊文思蓝可以剂量依赖的抑制myr-preS1-FITC结合到Huh7DhNTCP细胞上， 0029 图1E是伊文思蓝可以剂量依赖的抑制HBV感染人原代肝细胞结果图， 0030 图1F是伊文思蓝可以剂量依赖的抑制HBV感染稳定表达人源NTCP蛋白的猪原代肝 细胞结果图； 0031 图2是根据本发明实施例2的伊文思蓝影响H。

18、BV病毒颗粒组装的结果图； 0032 其中， 图2A显示了伊文思蓝处理4天对HepAD38细胞的细胞毒性和抗原水平， 0033 图2B显示了伊文思蓝对胞内的HBV总DNA的影响， 0034 图2C显示了伊文思蓝对胞内HBV核衣壳(HBV capsid)和核衣壳总DNA的影响； 0035 图2D显示了伊文思蓝对HBV core蛋白表达水平的影响。 说明书 3/7 页 5 CN 110623968 A 5 具体实施方式 0036 下面将结合具体实施例详细描述本发明的实施例， 下面的实施例仅用于说明本发 明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体技术或条件的， 按照本领域内的文 献所描述。

19、的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译的 分子克隆实验指南 ， 第三版， 科学出版社)或者按照产品说明书进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为 可以通过市购获得的常规产品。 0037 实施例1伊文思蓝抗HBV活性的评价 0038 1.实验材料 0039 1.1细胞和药物 0040 HepAD38细胞系： 人肝癌稳定转染细胞系， 其染色体中整合有HBV基因组， 可支持 HBV DNA合成和蛋白表达， 可产生感染性病毒粒子。 在这个细胞系中病毒的复制是由四环素 调控的CMV启动子控制的。 0041 Huh7DhNTCP细胞系： 稳定转染人NTCP蛋白的人肝癌细胞系， 可支持。

20、HBV的感染。 0042 人原代肝细胞(PHH)： 购买自上海瑞德肝脏， 用于HBV感染。 0043 猪原代肝细胞(PPH)和humanNTCP慢病毒表达载体： 购买自立沃生物科技。 0044 伊文思蓝， 恩替卡韦购自Sigma公司。 0045 1.2试剂 0046 DMEM/F12培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司； HBV表面抗原(S抗原)和e抗原 检测试剂盒购于上海科华生物科技有限公司；试剂购自Invitrogen公司； iTaq Universal SYBR Green supermix试剂购自Bio-rad公司； DIG High Prime DNA Labeling an。

21、d Detection Starter Kit II购自Roche公司。 0047 2.实验方法与结果 0048 2.1伊文思蓝(Evans blue)的细胞毒性检测 0049 1)将HepAD38和Huh7DhNTCP细胞按8000细胞/孔(100 L)接种于96孔细胞培养板中， 37细胞培养箱中培养， 细胞贴壁后备用。 0050 2)加药处理细胞： 用细胞培养液将药物以2倍梯度稀释6-10个梯度， 每梯度3个复 孔。 将200 L含有药物的细胞培养液加入到步骤(1)中的细胞中， 37细胞培养箱中继续培 养72h后以备检测。 00513)弃去含有药物的细胞培养物上清， 每孔加入含10试剂的培。

22、养液 100 L， 37培养箱中孵育0.5h-1h后， 用全波段酶标仪检测540nm波长处吸光值， 校正波长 为620nm， 并计算各浓度细胞存活率， 或检测荧光值(激发光波长： 540nm。 发射光波长： 595nm)用以计算细胞存活率。 0052 结果如图1B， 2A所示。 0053 图1B结果显示： 伊文思蓝处理3天对Huh7DhNTCP细胞的CC50(半数细胞毒性浓度)大 于1000微摩尔/升。 0054 图2A结果显示： 伊文思蓝处理4天对HepAD38细胞的CC50(半数细胞毒性浓度)为 351.8微摩尔/升。 0055 2.2伊文思蓝(Evans blue)抑制HBV感染实验 0。

23、056 1)将Huh7DhNTCP/PHH、 PPH-hNTCP细胞按8000细胞/孔(100 L)接种于96孔细胞培养 说明书 4/7 页 6 CN 110623968 A 6 板中， 37细胞培养箱中培养， 细胞贴壁后备用。 0057 2)加药和病毒处理细胞： 用细胞培养液将药物以2倍梯度稀释， 每梯度3个复孔， 将 200 L含有药物的细胞培养液加入到步骤(1)中的细胞中， 同时加入HBV病毒颗粒感染细胞， 37细胞培养箱中继续培养5天以备检测。 0058 3)分别收集细胞上清和细胞， 用ELISA检测试剂盒检测细胞上清中的HBeAg(分泌 型e抗原)和HBsAg(表面抗原)的含量。 0。

24、059 4)另外分别提取步骤(3)中收集的细胞上清和细胞内的HBV总DNA， 用实时定量PCR 的方法检测细胞上清和细胞内的HBV总DNA。 0060 实时定量PCR所用引物如SEQ ID NO： 14所示： 0061 引物(HBV S144-正向引物):5 -TCACCAACCTCTTGTCCT-3 (SEQ ID NO： 1)。 0062 引物(HBV S144-反向引物):5 -GACAAACGGGCAACATACCT-3 (SEQ ID NO： 2)。 0063 引物(GAPDH正向引物)： 5 -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 (SEQ ID NO： 3)。 0064 引。

25、物(GAPDH反向引物)： 5 -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 (SEQ ID NO： 4)。 0065 结果如图1B1F所示。 其中， 图中的PreS1表示加入myr-preS1药物组， Ctrl为空白 对照组， 即未病毒感染组。 结果显示： 伊文思蓝可以剂量依赖的抑制HBV感染Huh7DhNTCP细胞 的上清HBeAg水平和细胞内总HBV DNA， 其EC50(半数效应浓度)分别约为2.1微摩尔/升和 6.25微摩尔/升(如图1C所示)； 同时伊文思蓝也能剂量依赖的抑制HBV对PHH的感染， 在较高 浓度50微摩尔/升时能抑制80的HBV总DNA和cccDNA(如图1E所示。

26、)； 在PPH-hNTCP细胞细胞 感染中， 伊文思蓝也能剂量依赖的抑制HBV感染(如图F所示)。 0066 2.3伊文思蓝抑制myr-preS1-FITC结合到Huh7DhNTCP细胞 0067 1)将Huh7DhNTCP细胞按8000细胞/孔(100 L)接种于96孔细胞培养板中， 37细胞培 养箱中培养， 细胞贴壁后备用。 0068 2)将梯度稀释的伊文思蓝加入步骤1的细胞孔中， 同时每孔加入0.1微摩尔/升的 myr-preS1-FITC， 0.1微摩尔/升的myr-preS1作为阳性对照。 0069 3)37孵育1小时后， 吸去培养基并用PBS洗3次， 用4多聚甲醛固定后加入DAPI。

27、 染细胞核， 在PerkinElmer Operetta CLS高内涵成像分析系统上分析结果。 0070 结果如图1D所示。 0071 伊文思蓝在50微摩尔/升时能抑制99的myr-preS1-FITC结合到Huh7DhNTCP上， 该 实验室体外模拟HBV病毒的LHBs与细胞的结合， 说明伊文思蓝能抑制HBV病毒结合到细胞表 面。 0072 实施例2伊文思蓝(Evans blue)直接作用于HBV核衣壳组装而发挥抗病毒作用 0073 1.实验材料 0074 1.1细胞、 质粒和药物 0075 HepAD38细胞系： 人肝癌稳定转染细胞系， 其染色体中整合有HBV基因组， 可支持 HBV DN。

28、A合成， 蛋白表达， 可产生感染性病毒粒子。 在这个细胞系中病毒的复制是四环素调 控的CMV启动子控制的。 0076 伊文思蓝， 奥昔卡因和恩替卡韦购自Sigma公司。 0077 1.2试剂 0078DMEM/F12培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；试剂购自 说明书 5/7 页 7 CN 110623968 A 7 Invitrogen公司； iTaq Universal SYBR Green supermix试剂购自Bio-rad公司； 抗HBV core蛋白的兔源多抗， 抗GAPDH的鼠源单抗分别购自Dako公司和碧云天公司； HBV表面抗原 (S抗原)和e抗原检测试剂盒购于上。

29、海科华生物科技有限公司。 0079 2.实验方法与结果 0080 2.1伊文思蓝(Evans blue)对HepAD38细胞中乙型肝炎病毒的抗原水平的研究 0081 1)将HepAD38细胞按8000细胞/孔接种于96孔细胞培养板中， 37细胞培养箱中培 养24h。 0082 2)加入梯度稀释的伊文思蓝处理步骤1中细胞4天。 0083 3)收集细胞上清， 通过Elisa Kit检测上清中病毒HBeAg和HBsAg水平。 0084 结果如图2A所示。 图2A结果显示， 伊文思蓝剂量依赖的抑制HepAD38细胞分泌的 HBeAg和HBsAg水平。 0085 2.2伊文思蓝(Evans blue)对。

30、HBV总DNA的影响 0086 1)在HepAD38细胞中， 四环素诱导病毒复制起始后， 撤掉四环素， 细胞中整合的HBV 基因组开始复制， 产生HBV dsDNA， rcDNA， ssDNA和cccDNA。 0087 2)将上述诱导后的HepAD38细胞按8000细胞/孔接种于96孔细胞培养板中， 37细 胞培养箱中培养24h。 0088 3)加药处理细胞： 用DMEM/F12培养基将伊文思蓝稀释成各种浓度， 每组3个重复， 将不同剂量药物加入到细胞培养板中培养细胞， 加药处理4天。 0089 4)收集细胞， 分别提取胞内的总的HBV DNA得到的总的HBV DNA， 用定量PCR的方法 分。

31、析研究药物抗病毒活性。 0090 实时定量PCR所用引物如SEQ ID NO： 0091 引物(HBV S144-正向引物)： 5 -ACTCACCAACCTCTTGTCCT-3 (SEQ ID NO： 1)。 0092 引物(HBV S144-反向引物)： 5 -GACAAACGGGCAACATACCT-3 (SEQ ID NO： 2)。 0093 引物(GAPDH正向引物)： 5 -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 (SEQ ID NO： 3)。 0094 引物(GAPDH反向引物)： 5 -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 (SEQ ID NO： 4)。 0095 。

32、结果如图2B所示。 与未加药处理对照组相比伊文思蓝处理组对于胞内HBV总DNA有 显著的剂量依赖的抑制效果， 31.3微摩尔/升的药物能抑制50的HBV总DNA。 0096 2.3伊文思蓝(Evans blue)对乙型肝炎病毒核衣壳组装的作用的研究： 0097 伊文思蓝被报道是BK通路的抑制剂， 能降低细胞内钙离子浓度， 而相关研究表面 HBV核衣壳的组装与细胞内钙离子的浓度有关。 因此发明人探讨了伊文思蓝对HBV核衣壳组 装的作用。 实验过程如下： 0098 1)将HepAD38细胞按2105细胞/孔接种于6孔细胞培养板板中， 37细胞培养箱 中培养过夜。 0099 2)加药处理细胞72小时。

33、。 0100 3)加入300微升温和细胞裂解液， 室温裂解30min后收集裂解液到EP管中， 并离心 去除细胞碎片。 裂解液样品用1的琼脂糖凝胶电泳分成各种成分， 随后用毛细管转移法转 移到尼龙滤膜上， 转膜缓冲液使用10SSC， 检测滤膜上的HBV核衣壳用抗HBV core的抗体 (Dako)检测。 检测完的滤膜用碱变性处理释放核衣壳内的病毒DNA， 用Southern blot方法 检测核衣壳内病毒DNA的水平。 说明书 6/7 页 8 CN 110623968 A 8 0101 另外用western blot的方法检测HBV核心蛋白(core protein， 组成核衣壳外壳的 蛋白)，。

34、 检测的抗体抗HBV core的抗体(Dako)检测。 0102 结果显示如图2C和2D所示。 伊文思蓝对HBV的核衣壳组装和核衣壳内的HBV DNA均 有显著的剂量依赖的抑制效果， 且该抑制不是通过影响HBV core蛋白水平发挥作用的。 0103 在本说明书的描述中， 参考术语 “一个实施例” 、“一些实施例” 、“示例” 、“具体示 例” 、 或 “一些示例” 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、 结构、 材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。 在本说明书中， 对上述术语的示意性表述不 必须针对的是相同的实施例或示例。 而且， 描述的具体特征、 结构、 材料或者特。

35、点可以在任 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。 此外， 在不相互矛盾的情况下， 本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。 0104 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例， 可以理解的是， 上述实施例是示例 性的， 不能理解为对本发明的限制， 本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、 修改、 替换和变型。 说明书 7/7 页 9 CN 110623968 A 9 图1 说明书附图 1/2 页 10 CN 110623968 A 10 图2 说明书附图 2/2 页 11 CN 110623968 A 11 。