原核表达重组鸡血管生成素样蛋白4的方法与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910899778.3 (22)申请日 2019.09.23 (71)申请人 临沂大学 地址 276000 山东省临沂市双岭路中段 (72)发明人 赵旭黄华山苏闪闪 (74)专利代理机构 北京迎硕知识产权代理事务 所(普通合伙) 11512 代理人 钱扬保张群峰 (51)Int.Cl. C12N 15/70(2006.01) C07K 14/515(2006.01) C07K 19/00(2006.01) A61D 7/00(2006.01) C12R 1/19(2006.。

2、01) (54)发明名称 一种原核表达重组鸡血管生成素样蛋白4的 方法与应用 (57)摘要 本发明提供一种原核表达重组鸡ANGPTL4蛋 白的方法， 包括如下步骤： (1)人工合成重组鸡 ANGPTL4的基因序列， 将基因序列构建到原核表 达载体中， 构建重组原核表达载体； (2)将重组原 核表达载体转化大肠杆菌E.coli感受态细胞， 筛 选阳性菌落； (3)将重组阳性质粒单菌落扩大培 养， 加入诱导剂进行诱导表达； (4)采用稀释复性 方法进行包涵体复性； (5)将包涵体复性蛋白进 行纯化。 本发明通过构建重组鸡ANGPTL4的原核 表达载体， 使重组鸡ANGPTL4在大肠杆菌中高效 表达。

3、， 表达的重组蛋白以包涵体的形式存在， 经 包涵体复性和复性蛋白纯化， 促进了蛋白的正确 折叠， 提高融合蛋白表达量。 本发明的重组鸡 ANGPTL4蛋白可调节肉鸡的脂肪代谢， 为今后鸡 ANGPTL4功能研究的开展提供良好的试验材料。 权利要求书2页 说明书11页 序列表6页 附图4页 CN 110564756 A 2019.12.13 CN 110564756 A 1.一种原核表达重组鸡ANGPTL4蛋白的方法， 其特征在于， 所述方法包括如下步骤： (1)人工合成重组鸡ANGPTL4的基因序列， 将基因序列构建到原核表达载体中， 构建重 组原核表达载体； (2)将重组原核表达载体转化大肠。

4、杆菌E.coli感受态细胞， 筛选阳性菌落； (3)将重组阳性质粒单菌落扩大培养， 加入诱导剂进行诱导表达； (4)采用稀释复性方法进行包涵体复性； (5)将包涵体复性蛋白进行纯化。 2.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述重组鸡ANGPTL4基因序列包含His- SUMO基因序列和鸡ANGPTL4基因序列， 所述重组鸡ANGPTL4基因序列如SEQ ID NO.1所示或 如SEQ ID NO.2所示。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中： 所述的原核表达载体 为pET21a(+)， 构建的重组原核表达载体为pET21a-His-SUMO-ANGPTL。

5、4。 4.根据权利要求1-3任一项所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中， 所述诱导剂为异 丙基- -D-硫代半乳糖苷； 优选地， 所述异丙基- -D-硫代半乳糖苷浓度为0.1mmol/L- 1mmol/L， 诱导温度为16-37。 5.根据权利要求1-4任一项所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(4)的稀释复性方法具 体步骤为： (1)诱导目的蛋白表达后， 使用洗涤缓冲液充分洗涤包涵体， 离心取沉淀， 用增溶缓冲 液增溶， 离心取上清， 用于包涵体复性； 所述洗涤缓冲液为含NaCl、 EDTA、 TritonX-100的Tris-HCl缓冲液， pH为8.0， Tris-HCl 缓冲液。

6、的浓度为20mmol/L,NaCl浓度为50mmol/L,EDTA浓度为5mmol/L,Triton X-100体积 浓度为1； 所述增溶缓冲液为含Gua-HCl、 DTT的Tris-HCl缓冲液溶液， pH为8.0， Tris-HCl缓冲液 的浓度为50mmol/L， Gua-HCl的浓度为6mol/L， DTT的浓度为10mmol/L； (2)取包涵体增溶液逐滴加入到复性缓冲液中， 置于4复性24h； 优选地， 所述复性缓冲液为含NaCl、 KCl、 MgCl2、 CaCl2、 蔗糖、 精氨酸、 Triton X-100、 GSH、 GSSG的磷酸缓冲液， pH为6.5， 磷酸缓冲液的浓度。

7、为20mmol/L， NaCl的浓度为240mmol/ L,KCl浓度为10mmol/L、 MgCl2浓度为2mmol/L、 CaCl2浓度为2mmol/L、 蔗糖浓度为0.4mol/L、 精氨酸浓度为0.5mol/L、 Triton X-100体积浓度为0.05、 GSH浓度为1mmol/L、 GSSG浓度为 0.1mmol/L。 6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(5)的复性蛋白纯 化使用Chelating SFF亲和层析柱， 具体步骤为： 用平衡缓冲液平衡柱子， 用含咪唑的洗脱 缓冲液洗脱目的蛋白， 收集洗脱液； 所述平衡缓冲液为含NaCl的Tris-H。

8、Cl缓冲液， pH为8.0， Tris-HCl缓冲液的浓度为 20mmol/L,NaCl浓度为500mmol/L； 所述洗脱缓冲液为含NaCl、 咪唑的Tris-HCl缓冲液， pH为8.0， Tris-HCl缓冲液的浓度 为20mmol/L,NaCl浓度为500mmol/L， 咪唑的浓度为50-500mmol/L； 优选地， 所述咪唑的浓度 为500mmol/L； 优选地， 将收集的洗脱液组分透析到pH为8.5， 含NaCl、 glycerol、 DTT的Tris-HCl缓冲 权利要求书 1/2 页 2 CN 110564756 A 2 液中， 其中， Tris-HCl缓冲液的浓度为20mm。

9、ol/L， NaCl的浓度为500mmol/L， 丙三醇 (glycerol)的体积浓度为10， DTT的浓度为1mmol/L， 即获得的重组鸡ANGPTL4融合蛋白。 7.根据权利要求1-6任一项所述方法制备得到的包涵体或重组鸡ANGPTL4蛋白。 8.根据权利要求7所述的重组鸡ANGPTL4蛋白， 其特征在于， 所述重组鸡ANGPTL4蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.4所示。 9.权利要求7所述的重组鸡ANGPTL4蛋白在调节肉鸡脂肪代谢中的应用。 10.一种调节肉鸡脂肪代谢的方法， 其特征在于， 所述方法为向肉鸡静脉注射权利要求 8所述重组鸡ANGP。

10、TL4蛋白； 优选地， 所述重组ANGPTL4蛋白的剂量为20ng/kg-12500ng/kg。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110564756 A 3 一种原核表达重组鸡血管生成素样蛋白4的方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及一种原核表达重组鸡血管生成素样蛋白4的 方法与应用。 背景技术 0002 随着饲料添加剂的广泛使用以及饲料营养水平的不断提高， 肉鸡的脂肪沉积能力 日趋增加， 然而连接营养因素与肉鸡脂肪代谢的媒介及其作用机制目前却尚未明确。 血管 生成素样蛋白4(angiopoietin-like protein 4,ANGPTL4)又名PPAR血管。

11、生成素相关蛋白 和禁食诱导因子， 是一类具有高效生物活性的分泌蛋白， 微生物和禁食等因素均可影响其 分泌。 近年来研究发现， 将ANGPTL4存在差异的条件培养基用于培养人肝癌细胞系HepG2时， 其细胞中脂肪代谢相关基因表达会发生改变， 另外， 肉鸡血液中ANGPTL4含量会出现伴随肉 鸡脂肪代谢能力改变而发生变化的现象。 0003 因此， 猜测ANGPTL4具有改变肉鸡脂肪代谢的作用， 可作为连接营养因素与肉鸡脂 肪代谢的媒介。 在鼠和人上已有通过真核表达系统(HEK293)表达的重组ANGPTL4蛋白产品， 但是在鸡上ANGPTL4蛋白序列和其它物种同源性低， 发明人尝试使用真核表达系统。

12、 (HEK293)表达重组鸡ANGPTL4但并不成功， 目前也未见成功表达重组鸡ANGPTL4蛋白的报 道。 0004 本发明通过原核表达的方法获得重组鸡ANGPTL4蛋白， 获得的重组鸡ANGPTL4蛋白 可调节肉鸡的脂肪代谢： 增加肉鸡脂肪组织中的脂解、 促进肉鸡胸肌的脂肪分解、 提高肉鸡 肝脏FAS mRNA表达和酶活性、 降低肝脏MTTP mRNA表达， 为今后鸡ANGPTL4功能研究的开展 提供良好的试验材料， 同时也为鸡ANGPTL4在肉鸡脂肪代谢调控中作用机制的阐明提供理 论依据。 发明内容 0005 本发明提供一种原核表达重组鸡ANGPTL4蛋白的方法， 通过构建重组鸡ANGP。

13、TL4的 原核表达载体pET21a-His-SUMO-ANGPTL4， 实现重组鸡ANGPTL4在大肠杆菌E.coli中的高效 表达， 表达的重组蛋白以包涵体的形式存在， 经包涵体复性和复性蛋白纯化获得具有生物 活性的高浓度目的蛋白； 本发明获得的重组鸡ANGPTL4蛋白可调节肉鸡的脂肪代谢。 0006 本发明提供一种原核表达重组鸡ANGPTL4蛋白的方法， 所述方法包括如下步骤： 0007 (1)人工合成重组鸡ANGPTL4的基因序列， 将基因序列构建到原核表达载体中， 构 建重组原核表达载体； 0008 (2)将重组原核表达载体转化大肠杆菌E.coli感受态细胞， 筛选阳性菌落； 0009。

14、 (3)将重组阳性质粒单菌落扩大培养， 加入诱导剂进行诱导表达； 0010 (4)采用稀释复性方法进行包涵体复性； 0011 (5)将包涵体复性蛋白进行纯化。 0012 所述重组鸡ANGPTL4基因序列包含His-SUMO基因序列和鸡ANGPTL4基因序列， 所述 说明书 1/11 页 4 CN 110564756 A 4 重组鸡ANGPTL4基因序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示。 0013 在本发明实施例中， 所述重组鸡ANGPTL4蛋白的基因序列为： 0014 ATGGGTCATCATCACCATCATCATGGTAGCCTGCAGGATAGCGAAGTTAA。

15、TCAAGAAGCAAAACCGGA AGTTAAGCCGGAAGTGAAACCTGAAACACATATTAACCTGAAAGTGAGTGATGGCAGCAGCGAAATCTTCTTCAAA ATCAAAAAAACCACACCGCTGCGTCGTCTGATGGAAGCATTTGCAAAACGTCAGGGTAAAGAAATGGATAGCCTGC GTTTTCTGTATGATGGTATTCGTATTCAGGCAGATCAGGCACCGGAAGATCTGGATATGGAAGATAACGATATTAT CGAAGCACATCGTGAGCAGATTGGTGGTGCAGGTCCGGCACCTGGCACAG。

16、GTCGTGCAGGCACCGAACGTCGTACC GCAGCAGCCGGTGGTAAAGAACGTCGTGCACAGTTTGCAAGCTGGGATGAAGTTAATGTTATTGCACATGGTCTGC TGCAGTTAGGTCATGGTCTGAAAGAACATGTTGATCGTACCAAAGGTCAGATGCGTGAACTGGGTAGCCGTCTGAG CGCACATAATAGCAGCATGGGTCGTCTGCTGCGTCAGGCACGTGAAACCCAAGAACAGGGTGAACTGCTGCGTGCA AGCGTGCGCGAACTGGAAGGTCGTGGTCGTCAGCTGTTTAAT。

17、CTGAGCGAAGCACTGCGTCAGCGTCTGGAAGAAG TTGCAGCAGATAAAGCAGAAATTCAGGGTCGCCTGGAACAGCTGGAAGGCCGTGTTCGCCAGGCACTGCAGGCACG TCCGGCAGAAAATCAGAGCAGCAAAGATCTGGGTGCACTGCAGACCCTGATGGATGCACAGAATAGCCGTATTGAA GAACTGCTTCAGAAGATCAAACAGCAGCAGTATAAACTGGATAAACAGAACCTGCAGATTAAAAGCCTGCAGAGCA AAGTTAATCTGCTGATTCCGCTGCATCCGAAAGA。

18、TAACAAAACCCAGAGTCCGAAATGGAAAATCAACCCGAAAAA AAGCTTTAGCCATACCAATCAGAGCCATAATGTTAGCGTTGAACCGGCACTGCCGCATAAACTGCCGGAAGATTGT CAGCAGCTGTTTCTGGCAGGTCAGCAGAGCAGTGGTGTTTTTCAGGTTCAGCCGAGCGGTAGCCAGCCGTTTAAAG TTTATTGTGATATGACCGCAGAAGGTGGTTGGACCGTTATTCAGCGTCGCACCGATGGTAGCGTGGATTTTGATCA GCTGTGGGATGCCTATAAAAACGGTT。

19、TTGGTGATCTGCATGGCGATTTTTGGCTGGGCTTAGAAAAAATTCATCAT CTGGTTCAAGAGGGTCGTTATGACCTGCTGATTGAGCTGGAAGATTGGGAAGGTAATAGCCAAGAAATCCAGTTTG AATTTAGCTTAGGTGGTGAAAGCACCGCATATACCCTGAATCTGCTGGGTCCTCTGAGCGGTGAACTGGAAAATGC AATTGGTGATTTTCGCCAGCTGCCGTTTAGCACCCGTGATCGTGATCATGACCTGAAAGCAGATACCAATTGTGCA AAACATCTGAGTGGTGGT。

20、TGGTGGTTTAGTACCTGTGGTCATGCAAATCTGAACGGTAAATACTTTCGTAGCATTC CGCGTCAGCGCCATGAACGTAAACAGGGTATTTTTTGGAAAACCTGGAAAGGTCGTTACTATCCGCTGAAAAGTAC CACCATGAAAATTCAGCCTGCAGCACTGGAAGCAGAACCGTAA(SEQ ID NO.1) 0015 或， 0016 ATGGGTCATCATCACCATCATCATGGTAGCCTGCAGGATAGCGAAGTTAATCAAGAAGCAAAACCGGA AGTTAAGCCGGAAGTGAAACCTGAA。

21、ACACATATTAACCTGAAAGTGAGTGATGGCAGCAGCGAAATCTTCTTCAAA ATCAAAAAAACCACACCGCTGCGTCGTCTGATGGAAGCATTTGCAAAACGTCAGGGTAAAGAAATGGATAGCCTGC GTTTTCTGTATGATGGTATTCGTATTCAGGCAGATCAGGCACCGGAAGATCTGGATATGGAAGATAACGATATTAT CGAAGCACATCGTGAGCAGATTGGTGGTGGTAGCGCAGGTCCGGCACCTGGCACAGGTCGTGCAGGCACCGAACGT CGTACCGCAGCAGCCGG。

22、TGGTAAAGAACGTCGTGCACAGTTTGCAAGCTGGGATGAAGTTAATGTTATTGCACATG GTCTGCTGCAGTTAGGTCATGGTCTGAAAGAACATGTTGATCGTACCAAAGGTCAGATGCGTGAACTGGGTAGCCG TCTGAGCGCACATAATAGCAGCATGGGTCGTCTGCTGCGTCAGGCACGTGAAACCCAAGAACAGGGTGAACTGCTG CGTGCAAGCGTGCGCGAACTGGAAGGTCGTGGTCGTCAGCTGTTTAATCTGAGCGAAGCACTGCGTCAGCGTCTGG AAGAAGTTG。

23、CAGCAGATAAAGCAGAAATTCAGGGTCGCCTGGAACAGCTGGAAGGCCGTGTTCGCCAGGCACTGCA GGCACGTCCGGCAGAAAATCAGAGCAGCAAAGATCTGGGTGCACTGCAGACCCTGATGGATGCACAGAATAGCCGT ATTGAAGAACTGCTTCAGAAGATCAAACAGCAGCAGTATAAACTGGATAAACAGAACCTGCAGATTAAAAGCCTGC AGAGCAAAGTTAATCTGCTGATTCCGCTGCATCCGAAAGATAACAAAACCCAGAGTCCGAAATGGAAAATCAACCC 说。

24、明书 2/11 页 5 CN 110564756 A 5 GAAAAAAAGCTTTAGCCATACCAATCAGAGCCATAATGTTAGCGTTGAACCGGCACTGCCGCATAAACTGCCGGAA GATTGTCAGCAGCTGTTTCTGGCAGGTCAGCAGAGCAGTGGTGTTTTTCAGGTTCAGCCGAGCGGTAGCCAGCCGT TTAAAGTTTATTGTGATATGACCGCAGAAGGTGGTTGGACCGTTATTCAGCGTCGCACCGATGGTAGCGTGGATTT TGATCAGCTGTGGGATGCCTATAAAAACGGTTTTGGTGAT。

25、CTGCATGGCGATTTTTGGCTGGGCTTAGAAAAAATT CATCATCTGGTTCAAGAGGGTCGTTATGACCTGCTGATTGAGCTGGAAGATTGGGAAGGTAATAGCCAAGAAATCC AGTTTGAATTTAGCTTAGGTGGTGAAAGCACCGCATATACCCTGAATCTGCTGGGTCCTCTGAGCGGTGAACTGGA AAATGCAATTGGTGATTTTCGCCAGCTGCCGTTTAGCACCCGTGATCGTGATCATGACCTGAAAGCAGATACCAAT TGTGCAAAACATCTGAGTGGTGGTTGGTGGTT。

26、TAGTACCTGTGGTCATGCAAATCTGAACGGTAAATACTTTCGTA GCATTCCGCGTCAGCGCCATGAACGTAAACAGGGTATTTTTTGGAAAACCTGGAAAGGTCGTTACTATCCGCTGAA AAGTACCACCATGAAAATTCAGCCTGCAGCACTGGAAGCAGAACCGTAA(SEQ ID NO.2) 0017 所述步骤(1)中： 所述的原核表达载体为pET21a(+)， 构建的重组原核表达载体为 pET21a-His-SUMO-ANGPTL4。 0018 所述步骤(3)中， 所述诱导剂为异丙基- -D-硫代半乳糖苷； 优选地，。

27、 所述异丙基- -D-硫代半乳糖苷浓度为0.1mmol/L-1mmol/L， 诱导温度为16-37。 0019 所述步骤(4)的稀释复性方法具体步骤为： 0020 (1)诱导目的蛋白表达后， 使用洗涤缓冲液充分洗涤包涵体， 离心取沉淀， 用增溶 缓冲液增溶， 离心取上清， 用于包涵体复性； 0021 所述洗涤缓冲液为含NaCl、 EDTA、 TritonA-100的Tris-HCl缓冲液， pH为8.0， Tris- HCl缓冲液的浓度为20mmol/L,NaCl浓度为50mmol/L,EDTA浓度为5mmol/L,Triton X-100体 积浓度为1； 0022 所述增溶缓冲液为含Gua-。

28、HCl、 DTT的Tris-HCl缓冲液， pH为8.0， Tris-HCl缓冲液 的浓度为50mmol/L， Gua-HCl的浓度为6mol/L， DTT的浓度为10mmol/L； 0023 (2)取包涵体增溶液逐滴加入到复性缓冲液中， 置于4复性24h； 0024 优选地， 所述复性缓冲液为含NaCl、 KCl、 MgCl2、 CaCl2、 蔗糖、 精氨酸、 Triton X- 100、 GSH、 GSSG的磷酸缓冲液， pH为6.5， 磷酸缓冲液的浓度为20mmol/L， NaCl的浓度为 240mmol/L,KCl浓度为10mmol/L、 MgCl2浓度为2mmol/L、 CaCl2浓。

29、度为2mmol/L、 蔗糖浓度为 0.4mol/L、 精氨酸浓度为0.5mol/L、 Triton X-100体积浓度为0.05、 GSH浓度为1mmol/L、 GSSG浓度为0.1mmol/L。 0025 所述步骤(5)的复性蛋白纯化使用Chelating SFF亲和层析柱， 具体步骤为： 用平 衡缓冲液平衡柱子， 用含咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白， 收集洗脱液； 0026 所述平衡缓冲液为含NaCl的Tris-HCl缓冲液， pH为8.0， Tris-HCl缓冲液的浓度为 20mmol/L,NaCl浓度为500mmol/L； 0027 所述洗脱缓冲液为含NaCl、 咪唑的Tris-HCl缓。

30、冲液， pH为8.0， Tris-HCl缓冲液的 浓度为20mmol/L,NaCl浓度为500mmol/L， 咪唑的浓度为50-500mmol/L； 优选地， 所述咪唑的 浓度为500mmol/L； 0028 优选地， 将收集的洗脱液组分透析到pH为8.5， 含NaCl、 glycerol、 DTT的Tris-HCl 缓冲液中， 其中， Tris-HCl缓冲液的浓度为20mmol/L， NaCl的浓度为500mmol/L， 丙三醇 (glycerol)的体积浓度为10， DTT的浓度为1mmol/L， 即获得的重组鸡ANGPTL4融合蛋白。 0029 本发明还提供依据本发明上述方法制备得到的包。

31、涵体或重组鸡ANGPTL4蛋白。 说明书 3/11 页 6 CN 110564756 A 6 0030 所述重组鸡ANGPTL4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示或如SEQ ID NO.4所 示。 0031 在本发明实施例中， 重组鸡ANGPTL4蛋白的氨基酸序列为： 0032 MGHHHHHHGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGK EMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGAGPAPGTGRAGTERRTAAAGGKERRAQFASWDEVNV IAHGLLQLG。

32、HGLKEHVDRTKGQMRELGSRLSAHNSSMGRLLRQARETQEQGELLRASVRELEGRGRQLFNLSEALR QRLEEVAADKAEIQGRLEQLEGRVRQALQARPAENQSSKDLGALQTLMDAQNSRIEELLQKIKQQQYKLDKQNLQI KSLQSKVNLLIPLHPKDNKTQSPKWKINPKKSFSHTNQSHNVSVEPALPHKLPEDCQQLFLAGQQSSGVFQVQPSG SQPFKVYCDMTAEGGWTVIQRRTDGSVDFDQLWDAYKNGFGDLHGDFWLGLEKIHHLVQEGRYDLLIELEDWEGNS Q。

33、EIQFEFSLGGESTAYTLNLLGPLSGELENAIGDFRQLPFSTRDRDHDLKADTNCAKHLSGGWWFSTCGHANLNGK YFRSIPRQRHERKQGIFWKTWKGRYYPLKSTTMKIQPAALEAEP(SEQ ID NO.3) 0033 或， 0034 MGHHHHHHGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGK EMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGGSAGPAPGTGRAGTERRTAAAGGKERRAQFASWDEV NVIAHGL。

34、LQLGHGLKEHVDRTKGQMRELGSRLSAHNSSMGRLLRQARETQEQGELLRASVRELEGRGRQLFNLSEA LRQRLEEVAADKAEIQGRLEQLEGRVRQALQARPAENQSSKDLGALQTLMDAQNSRIEELLQKIKQQQYKLDKQNL QIKSLQSKVNLLIPLHPKDNKTQSPKWKINPKKSFSHTNQSHNVSVEPALPHKLPEDCQQLFLAGQQSSGVFQVQP SGSQPFKVYCDMTAEGGWTVIQRRTDGSVDFDQLWDAYKNGFGDLHGDFWLGLEKIHHLVQEGRYDLLIELEDWEG。

35、 NSQEIQFEFSLGGESTAYTLNLLGPLSGELENAIGDFRQLPFSTRDRDHDLKADTNCAKHLSGGWWFSTCGHANLN GKYFRSIPRQRHERKQGIFWKTWKGRYYPLKSTTMKIQPAALEAEP(SEQ ID NO.4) 0035 本发明还提供了所述的重组鸡ANGPTL4蛋白在调节肉鸡脂肪代谢中的应用。 0036 本发明还提供一种调节肉鸡脂肪代谢的方法， 所述方法为向肉鸡静脉注射所述重 组鸡ANGPTL4蛋白； 优选地， 所述重组ANGPTL4蛋白的剂量为20ng/kg-12500ng/kg。 0037 本发明将鸡ANGPTL4蛋白与His。

36、-SUMO标签融合， 通过构建重组鸡ANGPTL4的原核表 达载体pET21a-His-SUMO-ANGPTL4， 实现重组鸡ANGPTL4在大肠杆菌E.coli中的高效表达， 表达的重组蛋白以包涵体的形式存在， 经包涵体复性和复性蛋白纯化获得具有生物活性的 目的蛋白， 浓度高达0.1mg/mL。 0038 本发明获得的重组鸡ANGPTL4蛋白可调节肉鸡的脂肪代谢， 促进肉鸡胸肌的脂肪 分解： 0039 1、 本发明的重组蛋白可以增加禁食状态下肉鸡脂肪组织中的脂解， 可显著提高肉 鸡血清中VLDL、 TG、 NEFA的含量， 随着重组鸡ANGPTL4蛋白注射浓度增加， 血液TG、 VLDL和 。

37、NEFA含量均呈现一次线性和二次曲线增加的效应； 0040 2、 本发明的重组蛋白显著提高肉鸡血清NEFA含量， 具有提高肉鸡胸肌ATGL mRNA 表达和降低胸肌LPL mRNA表达的作用， 促进肉鸡胸肌的脂肪分解。 0041 3、 本发明的鸡ANGPTL4重组蛋白具有提高肉鸡肝脏FAS mRNA表达和酶活性， 降低 肝脏ME和ACC mRNA表达的作用： 随着重组鸡ANGPTL4蛋白注射浓度增加， 肝脏FAS mRNA表达 呈现一次线性和二次曲线增加的效应， 肝脏ACC mRNA表达呈现一次线性和二次曲线降低的 效应； 0042 本发明的重组ANGPTL4蛋白显著提高肉鸡肝脏FAS酶活性，。

38、 随着重组鸡ANGPTL4蛋 说明书 4/11 页 7 CN 110564756 A 7 白注射浓度增加， 肝脏FAS酶活性呈现一次线性和二次曲线增加的效应。 0043 4、 本发明的鸡ANGPTL4重组蛋白具有降低肝脏MTTP mRNA表达的作用。 附图说明 0044 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以 根据这些附图获得其他的附图。 0045 图1.重组质粒pET21a-His-SUM。

39、O-ANGPTL4的双酶切鉴定。 0046 图2.重组鸡ANGPTL4蛋白37诱导3小时表达的SDS-PAGE结果图， Lane A:未诱导 全菌； Lane B:诱导全菌(B1,B2,B3为3个不同的阳性克隆)； Lane C:裂解上清； Lane D:裂解 沉淀； MK:蛋白分子量marker。 0047 图3.重组鸡ANGPTL4蛋白16诱导过夜表达的SDS-PAGE结果图， Lane A:未诱导全 菌； Lane B:诱导全菌(B1,B2,B3为3个不同的阳性克隆)； Lane C:裂解上清； Lane D:裂解沉 淀； MK:蛋白分子量marker。 0048 图4.Ni柱纯化结果(。

40、SDS-PAGE)， Lane A:上样； Lane B:流穿； Lane C:20mmol/L咪 唑洗脱； Lane D， E:50mmol/L咪唑洗脱； Lane F,G,H:500mmol/L咪唑洗脱； MK:蛋白分子量 marker。 0049 图5.重组鸡ANGPTL4蛋白对血清中NEFA含量的影响。 0050 图6.重组鸡ANGPTL4蛋白对肉鸡胸肌脂肪代谢相关基因表达的影响。 0051 图7.重组鸡ANGPTL4蛋白对肉鸡胸肌HSL酶活性的影响。 0052 图8.重组鸡ANGPTL4蛋白对肉鸡肝脏脂肪代谢相关基因表达的影响。 0053 图9.重组鸡ANGPTL4蛋白对肉鸡肝脏脂肪。

41、代谢相关酶活性的影响。 具体实施方式 0054 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完 整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于 本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例， 都属于本发明保护的范围。 0055 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 下述实 施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为本领域的常规方法。 0056 原核表达载体pET21a(+)、 大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自上海近岸科技有限公 司； 限。

42、制性内切酶Nde I和Xho I、 质粒提取试剂盒购自TaKaRa公司。 0057 实施例1、 重组鸡ANGPTL4蛋白的制备 0058 通过UniProt查找鸡ANGPTL4的氨基酸序列(系列号为F1NUQ4)和信号肽部分(1-18 个氨基酸)， 去除信号肽并在N端加His-SUMO标签后， 对比大肠杆菌偏好密码子， 依据密码子 的兼并性， 在不改变氨基酸组成和排列顺序的基础上， 对编码His-SUMO-ANGPTL4的基因序 列进行改造， 替换为大肠杆菌喜好的密码子， 得到新的编码His-SUMO-ANGPTL4的基因序列 (SEQ ID NO.2)， 其蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO。

43、.4， 送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行 说明书 5/11 页 8 CN 110564756 A 8 全基因合成， 并以Nde I和Xho I酶切位点构建到pET21a(+)表达载体中。 0059 2、 表达菌株的转化 0060 将重组原核表达质粒pET21a-His-SUMO-ANGPTL4转化至大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)感受态细胞， 在含50 g/mL氨苄霉素的LB固体培养基上37倒置培养过夜。 挑长势较 好的单菌落接种于LB液体培养基中， 于37摇床上振荡培养， 抽提重组质粒， Nde I和Xho I 双酶切鉴定(图1)， 酶切鉴定正确的克隆提交英潍捷基(上海)贸易有限。

44、公司测序， 测序结果 与设计的His-SUMO-ANGPTL4基因序列完全一致。 0061 3、 阳性重组菌的诱导表达 0062 挑取含有重组阳性质粒的单菌落接种于1mL的LB培养液(Amp 50 g/ml)中， 37， 180rpm过夜培养， 次日按1(v/v)的量扩大培养， 37， 180rpm培养至OD600nm0.6-0.8， 加 入不同浓度的异丙基- -D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。 诱导条件设置为： IPTG浓度 1mmol/L， 诱导温度37， 诱导时间3h； IPTG浓度0.1mmol/L， 诱导温度16， 诱导过夜。 0063 按上述条件诱导蛋白表达后， 将收集的菌体。

45、悬浮于缓冲液PBS中， 4进行超声破 碎， 直至溶液透明。 12000rpm离心20min， 分离上清和沉淀， 进行SDS-PAGE分析。 用考马斯亮 蓝染色液染色1h后， 置于脱色液中脱色数小时， 直至蓝色背景消失。 0064 SDS-PAGE结果显示(图2和图3)， 诱导后与诱导前的菌体蛋白相比， 有1条明显的蛋 白条带。 将诱导后的菌液经超声破碎后， 分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析， 可见大部分 重组蛋白在沉淀中， 表明目的蛋白主要以包涵体形式表达。 0065 4、 包涵体复性 0066 诱导目的蛋白表达后， 使用洗涤缓冲液充分洗涤包涵体， 离心取沉淀， 用增溶缓冲 液增溶， 。

46、离心取上清， 用于包涵体复性。 0067 洗涤缓冲液为含NaCl、 EDTA(乙二胺四乙酸)、 TritonX-100的Tris-HCl缓冲液， pH 为8.0， Tris-HCl缓冲液的浓度为20mmol/L,NaCl浓度为50mmol/L,EDTA浓度为5mmol/L, Triton X-100体积浓度为1； 0068 增溶缓冲液为含Gua-HCl(盐酸胍)、 DTT(二硫苏糖醇)的Tris-HCl缓冲液， pH为 8.0， Tris-HCl缓冲液的浓度为50mmol/L， Gua-HCl的浓度为6mol/L， DTT的浓度为10mmol/L。 0069 包涵体复性选用稀释复性方法： 取2。

47、mL包涵体增溶液逐滴加入到100mL复性缓冲液 中， 置于4复性24h。 0070 复性缓冲液为含NaCl、 KCl、 MgCl2、 CaCl2、 蔗糖、 精氨酸、 Triton X-100、 GSH(谷胱甘 肽)、 GSSG(氧化型谷胱甘肽)的磷酸缓冲液， pH为6.5， 磷酸缓冲液的浓度为20mmol/L， NaCl 的浓度为240mmol/L,KCl浓度为10mmol/L、 MgCl2浓度为2mmol/L、 CaCl2浓度为2mmol/L、 蔗糖 浓度为0.4mol/L、 精氨酸浓度为0.5mol/L、 Triton X-100体积浓度为0.05、 GSH浓度为 1mmol/L、 GSS。

48、G浓度为0.1mmol/L。 0071 5、 复性蛋白的纯化 0072 将复性后蛋白(缓冲液pH调节至8.0)用Chelating SFF(Ni)亲和层析柱进行纯化， 用平衡缓冲液平衡柱子， 分别以梯度咪唑浓度的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白， 收集洗脱液， 进 行SDS-PAGE检测。 0073 平衡缓冲液为含NaCl的Tris-HCl缓冲液， pH为8.0， Tris-HCl缓冲液的浓度为 20mmol/L,NaCl浓度为500mmol/L； 说明书 6/11 页 9 CN 110564756 A 9 0074 洗脱缓冲液为含NaCl、 咪唑的Tris-HCl缓冲液， pH为8.0， Tris-H。

49、Cl缓冲液的浓度 为20mmol/L,NaCl浓度为500mmol/L， 咪唑的浓度为20/50/500mmol/L。 0075 SDS-PAGE结果显示， 用50和500mmol/L咪唑洗脱可获得与预期蛋白(65kDa)相符的 蛋白条带， 但500mmol/L咪唑洗脱所得的蛋白量多于50mmol/L咪唑(图4)， 因此， 采用 500mmol/L咪唑洗脱目的蛋白。 0076 将500mmol/L咪唑洗脱组分透析到pH为8.5、 含NaCl、 glycerol、 DTT的Tris-HCl缓 冲液中， 其中， Tris-HCl缓冲液的浓度为20mmol/L， NaCl的浓度为500mmol/L，。

50、 丙三醇 (glycerol)的体积浓度为10， DTT的浓度为1mmol/L， 即获得的重组鸡ANGPTL4融合蛋白， 采用Bradford法测定蛋白浓度为0.1mg/mL。 最终收获目的蛋白0.1mg/mL*4ml0.4mg。 0077 实施例2、 不同浓度重组鸡ANGPTL4蛋白对肉鸡血液生化指标的影响 0078 1、 试验设计 0079 试验选用35日龄体重相近的健康禁食状态下(空腹12h)AA肉公鸡36只， 随机分为6 个处理， 每个处理6个重复， 每个重复1只鸡。 处理各组按照肉鸡体重分别静脉注射重组鸡 ANGPTL4蛋白0,20,100,500,2500和12500ng/kg， 。