迷你联合佐剂纳米颗粒及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911012900.7 (22)申请日 2019.10.23 (71)申请人 中国医学科学院生物医学工程研究 所 地址 300192 天津市南开区白堤路236号 (72)发明人 刘兰霞刘丹刘佳乐冷希岗 (74)专利代理机构 北京酷爱智慧知识产权代理 有限公司 11514 代理人 袁克来 (51)Int.Cl. A61K 39/39(2006.01) A61P 37/04(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 31/06(2006.01) (54。

2、)发明名称 一种迷你联合佐剂纳米颗粒及其制备方法 和应用 (57)摘要 本发明公开了一种以两亲性单体分子为基 元通过自组装制备而成的联合佐剂纳米颗粒， 所 述两亲性单体分子为疏水性佐剂分子和亲水性 佐剂分子反应得到。 该联合佐剂纳米颗粒的刺激 作用相对于游离状态下联合应用亲水性佐剂和 疏水性佐剂产生的作用更强。 而且， 联合佐剂纳 米颗粒还可作为纳米载体递送抗原至抗原提呈 细胞， 促进抗原提呈细胞对抗原的摄取， 实现抗 原与佐剂的共递送， 产生协同性免疫应答， 能够 大大增强抗肿瘤、 结核等疫苗的免疫疗效。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 CN 110613844 A 201。

3、9.12.27 CN 110613844 A 1.一种联合佐剂纳米颗粒， 其特征在于， 所述联合佐剂纳米颗粒为两亲性单体分子通 过自组装制备而成， 所述两亲性单体分子为疏水性佐剂分子和亲水性佐剂分子反应得到。 2.根据权利要求1所述的联合佐剂纳米颗粒， 其特征在于， 所述联合佐剂纳米颗粒的直 径为100-200nm。 3.根据权利要求1所述的联合佐剂纳米颗粒， 其特征在于， 所述疏水性佐剂分子为单磷 脂酰脂质A或其类似物。 4.根据权利要求1所述的联合佐剂纳米颗粒， 其特征在于， 所述亲水性佐剂分子为寡聚 核苷酸或寡聚脱氧核苷酸。 5.根据权利要求4所述的联合佐剂纳米颗粒， 其特征在于， 所述。

4、亲水性佐剂分子为CPG- ODN。 6.一种联合佐剂纳米颗粒的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤： S1： 将单磷脂酰脂质A或其类似物进行叠氮化基团修饰， 透析、 冻干； S2： 将S1所得物质与寡聚脱氧核苷酸混合， 室温下搅拌12-18h， 然后透析、 冻干， 得到所 述联合佐剂纳米颗粒。 7.根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S1中， 加入叠氮磷酸二苯酯和1, 8-二氮杂双环5.4.0十一碳-7-烯进行叠氮化基团修饰， 20搅拌反应2448h后透析、 冻 干； 所述单磷脂酰脂质A的质量与叠氮磷酸二苯酯的体积、 1,8-二氮杂双环5.4.0十一碳- 7-烯的体积的比值(2。

5、.04.0)mg:(3.06.0) l： (2.04.0) l； 步骤S2中， S1所得物质的 质量与寡聚脱氧核苷酸的体积比为(1.02.0)mg:(100200) l。 8.权利要求1-5任意一项所述的联合佐剂纳米颗粒在制备负载药物、 抗原的复合物中 的应用。 9.一种免疫原性组合物， 其特征在于， 含有有效量抗原和权利要求1-5任意一项所述的 联合佐剂纳米颗粒。 10.权利要求9所述的免疫原性组合物在制备治疗或预防肿瘤、 结核的疫苗中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110613844 A 2 一种迷你联合佐剂纳米颗粒及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域。

6、， 具体涉及一种自组装制备而成的联合佐剂纳米颗粒及 其制备方法和应用。 背景技术 0002 佐剂是先于抗原或同时注射于动物体内， 能非特异性改变机体对抗原的特异性免 疫应答， 能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型， 而本身并无抗原性的物质。 佐剂 的主要作用是递呈抗原和增强免疫系统的刺激。 免疫增强剂直接(如细胞因子)或通过模式 识别受体(pattern recognition receptor,PRR) (如细菌组分)激活固有免疫， 而递送系 统浓缩抗原并展示抗原， 将疫苗抗原靶向抗原呈递细胞， 帮助抗原和免疫增强剂共定位。 目 前， 我国常用的佐剂有铝盐、 油乳、 蜂胶、 多糖、 微。

7、生物氟氏(FA)佐剂、 -干扰素(IFN-)、 白细胞介素(Interleuki-ns,ILs)、 免疫刺激复合物(ISCOMs)、 糖苷及复方中药佐剂等， 新 型免疫佐剂有核酸、 CpG、 补体、 纳米、 脂质体(LIP)等。 发明内容 0003 针对现有技术中的缺陷， 本发明提供一种联合佐剂纳米颗粒。 0004 在一个方面， 本发明提供了一种联合佐剂纳米颗粒， 所述联合佐剂纳米颗粒为两 亲性单体分子通过自组装制备而成， 所述两亲性单体分子为疏水性佐剂分子和亲水性佐剂 分子反应得到。 0005 在一些实施方案中， 所述联合佐剂纳米颗粒的直径为100-200nm。 0006 在一些实施方案中，。

8、 所述疏水性佐剂分子为单磷脂酰脂质A或其类似物。 0007 在一些实施方案中， 所述亲水性佐剂分子为寡聚核苷酸或寡聚脱氧核苷酸。 优选 地， 所述亲水性佐剂分子为CPG-ODN。 0008 在另一个方面， 本发明提供了一种联合佐剂纳米颗粒的制备方法， 包括如下步骤： 0009 S1： 将单磷脂酰脂质A或其类似物进行叠氮化基团修饰， 透析、 冻干； 0010 S2： 将S1所得物质与寡聚脱氧核苷酸混合， 室温下搅拌12-18h， 然后透析、 冻干， 得 到所述联合佐剂纳米颗粒。 0011 在一些实施方案中， 加入叠氮磷酸二苯酯和1,8-二氮杂双环5.4.0十一碳 -7- 烯进行叠氮化基团修饰， 。

9、20搅拌反应2448h后透析、 冻干； 所述单磷脂酰脂质A的质量与 叠氮磷酸二苯酯的体积、 1,8-二氮杂双环5.4.0十一碳-7-烯的体积的比值(2.04.0) mg:(3.06.0) l： (2.04.0) l。 0012 在一些实施方案中， 步骤S2中， S1所得物质的质量与寡聚脱氧核苷酸的体积比为 (1.02.0)mg:(100200) l。 0013 具体地， 采用透析袋进行透析， 透析时收集分子量较大的物质。 0014 在一些实施方案中， 所述带负载物选自药物、 抗原。 优选为鸡卵清蛋白。 当然也可 以为其他抗原或药物 说明书 1/4 页 3 CN 110613844 A 3 00。

10、15 在又一个方面， 本发明提供了上述联合佐剂纳米颗粒在制备负载药物、 抗原的复 合物中的应用。 0016 在又一个方面， 本发明提供了一种免疫原性组合物， 其含有有效量抗原和上述的 联合佐剂纳米颗粒。 0017 在一些实施方案中， 将S2得到的物质与待负载物混合， 室温下搅拌反应 8-10h， 得 到免疫原性组合物纳米颗粒。 所述待负载物可以为鸡卵清蛋白或其它抗原或药物。 当所述 待负载物为鸡卵清蛋白时， 所述S2得到的物质与所述待负载物的质量比为1:1-2。 0018 本发明还提供了上述组合物在制备治疗或预防肿瘤、 结合的疫苗中的应用。 0019 本发明的有益效果体现在： 0020 本发明。

11、的联合佐剂纳米颗粒以亲水性佐剂分子和疏水性佐剂分子形成的两亲性 单体分子作为基元， 通过自组装制备而成； 该联合佐剂纳米颗粒的刺激作用相对于游离状 态下联合应用亲水性佐剂和疏水性佐剂产生的作用更强。 而且， 联合佐剂纳米颗粒还可作 为纳米载体递送抗原至抗原提呈细胞， 促进抗原提呈细胞对抗原的摄取， 实现抗原与佐剂 的共递送， 产生协同性免疫应答， 能够大大增强抗肿瘤、 结核等疫苗的免疫疗效。 附图说明 0021 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案， 下面将对具体 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。 在所有附图中， 类似的元件 或部分一般由类似的附图标记。

12、标识。 附图中， 各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。 0022 图1为联合佐剂纳米颗粒动态光散射粒径检测结果图； 0023 图2为联合佐剂纳米颗粒透射电子显微镜图； 0024 图3为纳米颗粒作用于DC后的细胞活力检测图； 0025 图4为DC细胞摄取纳米颗粒共聚焦成像结果图； 0026 图5为纳米颗粒对DC细胞的促成熟情况图； 0027 图6为DC细胞与纳米颗粒孵育后细胞因子的分泌情况图。 具体实施方式 0028 下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。 以下实施例仅用于 更加清楚地说明本发明的技术方案， 因此只作为示例， 而不能以此来限制本发明的保护范 围。 0029 需。

13、要注意的是， 除非另有说明， 本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发 明所属领域技术人员所理解的通常意义。 0030 下面的实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的 试验材料， 如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 数据为三次重复实验的平均值或平均值标准差。 0031 本发明提供一种联合佐剂纳米颗粒， 其采用两亲性单体分子作为自组装基元通过 自组装制备而成， 该两亲性单体分子为疏水佐剂分子和亲水性佐剂分子反应得到。 0032 作为本发明的一个实施例， 亲水性佐剂分子为寡聚脱氧核苷酸CPG-ODN。 。

14、0033 作为本发明的一个实施例， 疏水性佐剂分子为单磷脂酰脂质A(MPLA) 或其类似 说明书 2/4 页 4 CN 110613844 A 4 物。 0034 作为本发明的一个实施例， 亲水性佐剂分子为寡聚脱氧核糖核苷酸 CPG-ODN。 优 选为C型2395， CPG-ODN的序列(SEQ ID NO.1)为： 5 -TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG-3 ， 购自生 工生物工程(上海)股份有限公司。 0035 作为本发明的一个实施例， 疏水性佐剂分子与叠氮磷酸二苯酯(DPPA) 和1,8-二 氮杂双环5.4.0十一碳-7-烯(DBU)反应以对疏水性佐剂分子进行叠氮化基团修饰。。

15、 0036 疏水性佐剂分子为单磷脂酰脂质A时， 单磷脂酰脂质A(MPLA)的质量与DPPA、 DBU的 体积比为： (2.04.0)mg:(3.06.0) l： (2.04.0) l。 单磷脂酰脂质A叠氮化的物质的质 量与CPG-ODN的体积比为(1.02.0)mg:(100200) l。 0037 实施例1 0038 如图1所示， 为本发明一个实施例的单磷脂酰脂质A(MPLA)与CPG-ODN (序列为SEQ ID NO.1)的合成结构路线。 0039 0040其中， 0041 联合佐剂纳米颗粒制备的具体步骤包括： 0042 S1： 将4.0mg单磷脂酰脂质A(MPLA)、 6.0 l叠氮磷。

16、酸二苯酯(DPPA) 和4.0 l 1,8- 二氮杂双环5.4.0十一碳-7-烯(DBU)混合， 20下搅拌反应 48h， 对所得产物用透析袋进 行透析， 收集分子量大于1000kD的物质， 冻干； 0043 S2： 将2.0mg冻干后的物质与200 l功能性寡聚脱氧核苷酸CPG-ODN 混合， 室温下 搅拌过夜， 然后透析袋进行透析， 收集分子量大于2000kD的物质， 冻干， 得到MPLA-CPG联合 佐剂纳米颗粒。 0044 图1为实施例1制备得到的联合佐剂纳米颗粒动态光散射粒径检测结果图， 图2为 该联合佐剂纳米颗粒投射电子显微镜图。 0045 得到的联合佐剂纳米颗粒的直径为136.9。

17、-138.6nm。 联合佐剂纳米颗粒的分散度 指数为0.11-0.16。 0046 实施例2 0047 将1.0mg MPLA-CPG纳米颗粒与1.0mg鸡卵清蛋白合(OVA)， 室温下搅拌反应10h， 得 到MPLA-CPG-OVA纳米颗粒。 0048 实施例3 0049 1、 细胞活力实验 0050 取68周龄的C57BL/6小鼠骨髓来源树突状细胞(Bone Marrow Derived Dendritic Cell,BMDC)， 置于5CO2的37培养箱中进行培养， 第七天， 轻柔吹打培养液， 收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞， 接种于96孔板中， 培养箱中过夜， 每孔加入浓度分别 为0。

18、、 1、 5、 10、 20、 30 g/ml负载OVA(鸡卵清蛋白)的MPLA-CPG纳米颗粒， 继续培养24小时， 每 说明书 3/4 页 5 CN 110613844 A 5 孔加入10 l CCK-8 检测液， 培养箱中继续培养14h， 利用多功能全波长酶标仪(Thermo Varioskan Flash3001)测定450nm处吸光度。 用同浓度的游离OVA和OVA+MPLA+CPG 三者的 混合物作对照。 纳米颗粒作用于DC细胞后所得结果如图3所示。 0051 2、 细胞摄取实验 0052 为了观察BMDCs对于纳米颗粒的摄取情况， OVA用FITC进行标记， 将细胞铺于共聚 焦皿。

19、中， BMDCs与负载FITC-OVA的MPLA-CPG纳米颗粒共孵育6h后(按照OVA的浓度10 g/ml计 算给药量)， PBS进行洗涤， 固定液进行固定， 用Lyso-Tracker Red染溶酶体， DAPI染细胞核， 利用激光共聚焦显微镜(Leica,TCS SP5)观察负载FITC-OVA的MPLA-CPG纳米颗粒在 BMDCs 中分布状况， 全程避光操作。 用同浓度的游离FITC-OVA作对照， DC 细胞摄取纳米颗粒共聚 焦成像结果如图4所示。 结果显示， BMDCs对 MPLA-CPG-OVA纳米颗粒的摄入量显著。 0053 3、 纳米颗粒对BMDCs成熟的影响 0054 采。

20、用流式细胞术检测纳米颗粒对于BMDCs细胞促成熟情况， BMDC与负载OVA的 MPLA-CPG纳米颗粒共孵育8小时(按照OVA的浓度10 g/ml 计算给药量)， 收集细胞， 标记 CD11C、 CD40及CD80等流式抗体， 用流式细胞仪进行检测。 用PBS、 同浓度的游离OVA和OVA+ MPLA+CPG三者的混合物作对照。 纳米颗粒对DC细胞的促成熟结果如图5所示， 其中Free OVA 用Free O表示， Free MPLA+CPG+OVA用Free MCO表示， MPLA-CPG-OVA NPs用MCO NPs表示。 0055 采用ELISA法测定纳米颗粒对BMDCs细胞因子分泌。

21、的影响： 收集 BMDCs， 接种于96 孔板中。 BMDC与负载OVA的MPLA-CPG纳米颗粒共孵育8小时(按照OVA的浓度10 g/ml计算给 药量)后， 离心弃上清培养基， 更换新培养基， 继续培养24h， 按照ELISA试剂盒说明书方法对 BMDCs上清液进行细胞因子IFN-(Interferon-， 干扰素-)和TNF- (Tumor Necrosis Factor- ， 肿瘤坏死因子- )的含量测定。 使用酶标仪测定450nm处的吸光度OD值， 根据标准 品吸光度与浓度绘制标准曲线， 计算样品浓度。 用PBS、 同浓度的游离OVA和OVA+MPLA+CPG三 者的混合物作对照， 。

22、DC 细胞与纳米颗粒孵育后细胞因子的分泌情况如图6所示。 结果显示， MPLA-CPG-OVA纳米颗粒可显著促进BMDCs细胞因子分泌， 具有促进抗原提呈细胞活化的作 用。 0056 从图3至图6的结果可知， 该纳米颗粒的亲水性佐剂分子和疏水性佐剂分子游离状 态下联用也具有协同刺激作用， 但将二者连接制备成联合佐剂纳米颗粒后， 比游离状态下 联合应用产生的协同作用的程度大大增强。 0057 最后应说明的是： 以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制； 尽 管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解： 其依 然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修。

23、改， 或者对其中部分或者全部技术特征进 行等同替换； 而这些修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术 方案的范围， 其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。 说明书 4/4 页 6 CN 110613844 A 6 SEQUENCE LISTING 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种迷你联合佐剂纳米颗粒及其制备方法和应用 2019.10.23 1 PatentIn version 3.3 1 22 DNA 人工合成 1 tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22 序列表 1/1 页 7 CN 110613844 A 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/3 页 8 CN 110613844 A 8 图4 图5 说明书附图 2/3 页 9 CN 110613844 A 9 图6 说明书附图 3/3 页 10 CN 110613844 A 10 。