铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910747144.6 (22)申请日 2019.08.14 (71)申请人 浙江万寿康药业有限公司 地址 321000 浙江省金华市武义县王宅镇 马府下村柴岗山 (72)发明人 陈喜良金美艳 (74)专利代理机构 合肥方舟知识产权代理事务 所(普通合伙) 34158 代理人 刘跃 (51)Int.Cl. C08B 37/00(2006.01) C12N 5/0775(2010.01) (54)发明名称 铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取及其 应用 (57)摘要 本发明公开。

2、了一种铁皮石斛O-乙酰葡萄甘 露聚糖的提取方法及其应用， 以铁皮石斛叶和茎 为原料， 经清水洗净后干燥并粉碎、 固定化、 萃取 和分离处理工序制备获得， 所述的铁皮石斛O-乙 酰葡萄甘露聚糖具有促进乳牙间充质干细胞增 值的作用， 从而为乳牙间充质干细胞体外培养扩 增带来新的培养扩增方法； 且本发明中的铁皮石 斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的制备方法， 工艺简单稳 定高效， 适合工业化生产， 成本低。 权利要求书2页 说明书8页 CN 110642956 A 2020.01.03 CN 110642956 A 1.一种铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取方法， 其特征在于： 提取制备方法如下： 一、 采摘。

3、无病害的铁皮石斛的叶子和茎， 用水清冲洗干净， 然后在30100条件下 干燥至叶子和茎中水分的质量百分含量低于3， 再将干燥后的叶子和茎粉碎至粒径为20 120目， 得兰科石斛属植物叶子粉体； 二、 将步骤一得到的兰科石斛属植物叶子粉体和固定化酶混合得萃取料， 其中兰科石 斛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为0.1100 1， 固定化酶中采用的酶为纤维素酶、 木聚糖酶、 果胶酶、 半纤维素酶和蜗牛酶中的一种或其中的几种； 三、 将步骤二的萃取料装入萃取釜， 进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物， 其中萃取 条件如下： 萃取压力为15MPa50MPa， 萃取温度3075， 超临界二氧化碳流量为5 。

4、45kg/h， 萃取时间为0.5h3h； 四、 将步骤三得到的萃取混合物通过减压分离釜， 进行二级分离， 其中一级减压分离压 力为510MPa， 温度为4050， 二级减压分离压力为56MPa， 温度为3550， 获得铁皮 石斛多糖提取物， 即完成铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取。 2.根据权利要求1所述的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取方法， 其特征在于： 步骤 三中在进行超临界二氧化碳萃取过程中， 还添加了夹带剂， 夹带剂与萃取料的质量比为1 1.420。 3.根据权利要求2所述的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取方法， 其特征在于： 所述 夹带剂为甲醇、 乙醇和丙酮中的一种或者其中几。

5、种的的混合物。 4.根据权利要求2所述的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取方法， 其特征在于： 夹带 剂还可以为由有机溶剂溶解于pH值为47的缓冲液中配制的体积百分浓度为5090 的有机溶剂溶液， 有机溶剂为甲醇、 乙醇和丙酮中的一种或者其中几种的混合物。 5.根据权利要求2所述的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取方法， 其特征在于： 夹带 剂还可以是由有机溶剂溶解于水中配制的体积百分浓度为5090的有机溶剂水溶液， 有机溶剂为甲醇、 乙醇和丙酮中的一种或者其中几种的混合物。 6.根据权利要求1所述的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取方法， 其特征在于： 所述 兰科石斛属植物叶子粉体和固定化酶。

6、的质量比为1050 1。 7.一种铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取方法， 其特征在于： 提取制备方法如下： 一、 采摘无病害的铁皮石斛的叶子和茎5kg， 用水清冲洗干净， 然后在45条件下干燥 至叶子和茎中水分的质量百分含量低于3， 再将干燥后的叶子和茎粉碎至粒径为6080 目， 得兰科石斛属植物叶子粉体； 二、 将步骤一得到的兰科石斛属植物叶子粉体和固定化酶混合得萃取料， 其中兰科石 斛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为30 1， 固定化酶中采用的酶为纤维素酶、 木聚糖 酶、 果胶酶、 半纤维素酶几种； 三、 将步骤二的萃取料装入萃取釜， 进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物， 其中萃取 条。

7、件如下： 萃取压力为25MPa， 萃取温度35， 超临界二氧化碳流量为10kg/h， 萃取时间为 1.5h； 四、 将步骤三得到的萃取混合物通过减压分离釜， 进行二级分离， 其中一级减压分离压 力为8MPa， 温度为40， 二级减压分离压力为5MPa， 温度为35， 获得铁皮石斛多糖提取物， 即完成铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取。 权利要求书 1/2 页 2 CN 110642956 A 2 8.一种铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的应用， 其特征在于： O-乙酰葡萄甘露聚糖的应 用是O-乙酰葡萄甘露聚糖在乳牙间充质干细胞培养中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110642956 A。

8、 3 铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取及其应用 技术领域 0001 本发明属于天然产物提取技术领域， 具体涉及一种铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖 的提取及其应用。 背景技术 0002 铁皮石斛又被称为铁皮枫斗、 黑节草。 该药为兰科石斛属的多年生草本植物， 是一 种名贵的中草药。 该药的入药部位主要为新鲜或干燥的根茎。 铁皮石斛可入胃经、 肾经， 其 味甘、 性微寒。 铁皮石斛中含有多种活性成分， 其药用价值在 本草纲目 、神农本草经 等 医学典籍中均有记载。 0003 铁皮石斛的成分主要有多糖、 联苄类化合物和菲类化合物、 生物碱、 氨基酸、 微量 元素等。 铁皮石斛中水溶性多糖的含量高达2。

9、3。 水溶性多糖是铁皮石斛最重要的活性物 质之一。 有资料显示， 将铁皮石斛进行分离纯化， 可得到三种结构的多糖。 这三种结构的多 糖均为O-乙酰葡萄甘露聚糖。 有资料显示， O-乙酰葡萄甘露聚糖具有增强T细胞、 B细胞及巨 噬细胞功能的作用。 临床上对铁皮石斛的有效成分进行提取， 可分离出联苄类、 倍半萜类、 鼓槌菲、 毛兰素及香豆素等化学成分。 这些化学成分均具有抗炎、 抗肿瘤、 增强巨噬细胞的 吞噬能力、 促进淋巴细胞合成移动抑制因子等药理作用。 所有的石斛中基本都含有生物碱。 生物碱的主要药理作用为退热、 止痛、 提高胃肠道及心血管的功能。 游离氨基酸是铁皮石斛 中的主要活性成分之一。。

10、 有研究资料显示， 铁皮石斛中含有全部人体必需的氨基酸。 有研究 资料显示， 铁皮石斛中含有丰富的铜、 锌、 铁、 锰、 钙、 镁及钾等人体必需的微量元素， 且其微 量元素的含量普遍高于其他中草药。 0004 铁皮石斛含有众多有效成分， 因此铁皮石斛发挥着众多的生理功能， 免疫调节作 用、 抗肿瘤作用、 降血糖作用、 抗氧化、 抗衰老作用、 抗肝损伤作用， 有研究资料显示， 铁皮石 斛具有抗疲劳的作用。 可降低小鼠运动后的血乳酸及血清尿素氮的水平， 延长其负重游泳 的时间， 增加其运动的耐力和抗疲劳的能力。 其他动物实验证实， 铁皮石斛具有益胃生津的 作用,可促进大鼠唾液和胃液的分泌， 提高其。

11、肠胃的运动功能及排粪的功能， 维护其消化系 统正常的功能。 除此之外， 铁皮石斛的鲜汁还具有一定的镇痛作用， 可提高小鼠的痛阈值。 0005 铁皮石斛具有增强免疫力、 抗肿瘤、 抗氧化、 抗肝损伤、 降血糖等多种药理作用。 该 药具有巨大的药用价值。 野生铁皮石斛的资源较匮乏， 但随着人工栽培铁皮石斛技术和铁 皮石斛有效成份提取技术的发展， 该药的药用价值和保健功效将被得到更进一步的开发和 利用。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取及其应用。 0007 其中所述的O-乙酰葡萄甘露聚糖的应用是O-乙酰葡萄甘露聚糖在乳牙间充质干 细胞培养中的应用， O-乙酰。

12、葡萄甘露聚糖具有促进乳牙间充质干细胞增值的作用。 0008 作为本发明的一种实施方式， 本发明中的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖优选通过 说明书 1/8 页 4 CN 110642956 A 4 以下方法制备获得： 以铁皮石斛叶和茎为原料， 经清水洗净后干燥并粉碎、 固定化、 萃取和 分离处理工序制备获得， 所述的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖具有促进乳牙间充质干细胞 增值的作用， 从而为乳牙间充质干细胞体外培养扩增带来新的培养扩增方法。 0009 作为本发明的一种优选的实施方式， 本发明所述的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖 具体通过以下方法制备获得： 0010 一种铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提。

13、取方法， 其特征在于： 铁皮石斛 O-乙酰葡 萄甘露聚糖的提取方法是通过以下步骤实现的： 0011 一、 采摘无病害的铁皮石斛的叶子和茎， 用水清冲洗干净， 然后在30 100条 件下干燥至叶子和茎中水分的质量百分含量低于3， 再将干燥后的叶子和茎粉碎至粒径 为20120目， 得兰科石斛属植物叶子粉体； 0012 二、 将步骤一得到的兰科石斛属植物叶子粉体和固定化酶混合得萃取料， 其中兰 科石斛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为0.1100 1， 固定化酶中采用的酶为纤维素 酶、 木聚糖酶、 果胶酶、 半纤维素酶和蜗牛酶中的一种或其中的几种； 0013 三、 将步骤二的萃取料装入萃取釜， 进行。

14、超临界二氧化碳萃取得萃取混合物， 其中 萃取条件如下： 萃取压力为15MPa50MPa， 萃取温度3075， 超临界二氧化碳流量为5 45kg/h， 萃取时间为0.5h3h； 0014 四、 将步骤三得到的萃取混合物通过减压分离釜， 进行二级分离， 其中一级减压分 离压力为510MPa， 温度为4050， 二级减压分离压力为5 6MPa， 温度为3550， 获 得铁皮石斛多糖提取物， 即完成铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取。 0015 本发明的步骤三中在进行超临界二氧化碳萃取过程中， 还添加了夹带剂， 夹带剂 与萃取料的质量比为1 1.420， 夹带剂为甲醇、 乙醇和丙酮中的一种或者其中几种。

15、的的混 合物。 其中夹带剂还可以为由有机溶剂溶解于pH值为 47的缓冲液中配制的体积百分浓 度为5090的有机溶剂溶液， 有机溶剂为甲醇、 乙醇和丙酮中的一种或者其中几种的 混合物。 夹带剂还可以是由有机溶剂溶解于水中配制的体积百分浓度为5090的有机 溶剂水溶液。 夹带剂的加入， 提高了本发明提取方法的收率。 0016 本发明的提取方法中， 从萃取后的剩余物料中筛分出固定化酶， 加以回收利用。 0017 本发明步骤二中采用的固定化酶采用现有公开技术制备即可。 0018 本发明的提取方法具有以下优点： 与目前应用广泛的溶剂提取技术相比， 本发明 采用固定化酶酶解与超临界二氧化碳萃取技术相结合提。

16、取铁皮石斛多糖类物质， 有机溶剂 残留低， 固定化酶可回收利用， 提取时间短且提取效率高， 铁皮石斛多糖收率达0.55 4.82， 可以除去较多杂质， 对铁皮石斛多糖可以起到浓缩富集的作用， 具有较强的应用前 景。 0019 与现有技术相比， 本发明具有如下优点： 0020 (1)本发明中的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖， 其纯度高， 具有促进乳牙间充质干 细胞增值的作用； 0021 (2)本发明中的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的制备方法， 工艺简单稳定高效， 适 合工业化生产， 成本低； 0022 (3)本发明中的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖， 可作为培养细胞扩增生长的细胞 培养基中促细胞生长。

17、因子。 说明书 2/8 页 5 CN 110642956 A 5 具体实施方式 0023 下面结合实施例对本发明做进一步说明， 但不以任何形式限制本发明。 0024 以下实施例中采用的各原料， 如无特殊说明， 均为市售产品。 0025 实施例1 0026 本发明所述的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖具体通过以下方法制备获得： 0027 一、 采摘无病害的铁皮石斛的叶子和茎5kg， 用水清冲洗干净， 然后在 45条件下 干燥至叶子和茎中水分的质量百分含量低于3， 再将干燥后的叶子和茎粉碎至粒径为60 80目， 得兰科石斛属植物叶子粉体； 0028 二、 将步骤一得到的兰科石斛属植物叶子粉体和固定化酶。

18、混合得萃取料， 其中兰 科石斛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为30 1， 固定化酶中采用的酶为纤维素酶、 木 聚糖酶、 果胶酶、 半纤维素酶几种； 0029 三、 将步骤二的萃取料装入萃取釜， 进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物， 其中 萃取条件如下： 萃取压力为25MPa， 萃取温度35， 超临界二氧化碳流量为10kg/h， 萃取时间 为1.5h； 0030 四、 将步骤三得到的萃取混合物通过减压分离釜， 进行二级分离， 其中一级减压分 离压力为8MPa， 温度为40， 二级减压分离压力为5MPa， 温度为 35， 获得铁皮石斛多糖提 取物， 即完成铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取。 0。

19、031 本实施例步骤三中在进行超临界二氧化碳萃取过程中， 还添加了夹带剂， 夹带剂 与萃取料的质量比为1 2， 夹带剂为乙醇。 夹带剂的加入， 提高了本发明提取方法的收率。 0032 本实施例的提取方法中， 从萃取后的剩余物料中筛分出固定化酶， 加以回收利用。 0033 本实施方式对制备得到的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖提取物进行多糖类物质 鉴定： 步骤四得的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖提取物进行鉴定反应。 0034 试剂： 0035 (1)浓硫酸:分析纯， 95.5； 0036 (2)80苯酚:80克苯酚(分析纯重蒸馏试剂)加20克水使之溶解， 可置冰箱中避光 长期储存； 0037 (3)6。

20、苯酚:临用前以80苯酚配制。 (每次测定均需现配)； 0038 (4)标准葡聚糖(Dextran,瑞典Pharmacia),或分析纯葡萄糖。 0039 (5)15三氯乙酸(15TCA):15克TCA加85克水使之溶解， 可置冰箱中长期储存。 0040 (6)5三氯乙酸(5TCA):25克TCA加475克水使之溶解， 可置冰箱中长期储存。 0041 (7)6mol/L氢氧化钠:120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。 0042 (8)6mol/L盐酸。 0043 实验方法： 0044 1.制作标准曲线:准确称取标准葡聚糖20mg于500ml容量瓶中， 加水至刻度， 分别 吸取0.4、 0.6、 。

21、0.8、 1.0、 1.2、 1.4、 1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml， 然后加入6苯酚 1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却， 沸水浴显色 15min以后于490nm测光密度， 以2.0ml水按同 样显色操作为空白， 横坐标为多糖微克数， 纵坐标为光密度值， 得标准曲线； 0045 2.样品含量测定: 0046 取样品1克(湿样)加1ml 15TCA溶液研磨， 再加少许5TCA溶液研磨， 倒上清 说明书 3/8 页 6 CN 110642956 A 6 液于10毫升离心管中， 再加少许5TCA溶液研磨， 倒上清液， 重复3 次。 最后一次将残渣一 起到入离心管。 注意:总的溶。

22、液不要超出10毫升。 0047 离心， 转速3000转/分钟， 共三次。 第一次15分钟， 取上清液。 后两次各5分钟取上 清液到25毫升锥形比色管中。 最后滤液保持18毫升左右。 0048 水浴， 在向比色管中加入2毫升6mol/L盐酸之后摇匀， 在96水浴锅中水浴2小 时。 0049 定容取样。 水浴后， 用流水冷却后加入2毫升6mol/L氢氧化钠摇匀。 定容至25毫 升的容量瓶中。 吸取0.2ml的样品液， 以蒸馏补至2.0ml， 然后加入6苯酚1.0ml及浓硫酸 5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm 测光密度。 每次测定取双样对照。 以标准曲 线计算多糖含量。 0050。

23、 由上述试验检测， 本实施例提取的多糖显色为深棕色， 空白对照显色为淡淡红棕 色。 由此说明本实施例中提取为铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖。 并通过标准曲线制定及检 测， 计算出铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖含量为 80mg/ml， 铁皮石斛多糖收率达4.12。 0051 与目前应用广泛的溶剂提取技术相比， 本实施方式采用固定化酶酶解与超临界二 氧化碳萃取技术相结合提取铁皮石斛糖类化合物， 有机溶剂残留低， 固定化酶可回收利用， 提取时间短且提取效率高， 铁皮石斛糖类收率达 4.12， 并除去较多杂质， 对铁皮石斛糖 类可以起到浓缩富集的作用， 具有较强的应用前景。 0052 实施例2 0053 。

24、铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取方法是通过以下步骤实现的： 0054 一、 采摘无病害的铁皮石斛的叶子和茎2kg， 用水清冲洗干净， 然后在 30条件下 干燥至叶子和茎中水分的质量百分含量低于3， 再将干燥后的叶子和茎粉碎至粒径为20 40目， 得兰科石斛属植物叶子粉体； 0055 二、 将步骤一得到的兰科石斛属植物叶子粉体和固定化酶混合得萃取料， 其中兰 科石斛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为0.1 1， 固定化酶中采用的酶为纤维素酶、 木 聚糖酶、 果胶酶、 半纤维素酶和蜗牛酶几种； 0056 三、 将步骤二的萃取料装入萃取釜， 进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物， 其中 萃取条件如下。

25、： 萃取压力为15MPa， 萃取温度30， 超临界二氧化碳流量为5kg/h， 萃取时间 为0.5h； 0057 四、 将步骤三得到的萃取混合物通过减压分离釜， 进行二级分离， 其中一级减压分 离压力为5MPa， 温度为40， 二级减压分离压力为5MPa， 温度为 35， 获得铁皮石斛多糖提 取物， 即完成铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取。 0058 本实施例步骤三中在进行超临界二氧化碳萃取过程中， 还添加了夹带剂， 夹带剂 与萃取料的质量比为1 1.4， 夹带剂为甲醇、 乙醇混合物。 夹带剂的加入， 提高了本发明提取 方法的收率。 0059 本发明的提取方法中， 从萃取后的剩余物料中筛分出固。

26、定化酶， 加以回收利用。 0060 本实施例制备得到的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖提取物进行多糖类物质鉴定： 步骤四得的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖提取物进行鉴定反应。 0061 本实施例提取多糖鉴定按照实施例1中多糖鉴定检测方法。 0062 由鉴定试验检测， 本实施例提取的多糖显色为深棕色， 空白对照显色为淡淡红棕 说明书 4/8 页 7 CN 110642956 A 7 色。 由此说明本实施例中提取为铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖。 并通过标准曲线制定及检 测， 计算出铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖含量为 43mg/ml， 铁皮石斛多糖收率达2.82。 0063 实施例3 0064 铁皮石斛O。

27、-乙酰葡萄甘露聚糖的提取方法是通过以下步骤实现的： 0065 一、 采摘无病害的铁皮石斛的叶子和茎3kg， 用水清冲洗干净， 然后在 100条件 下干燥至叶子和茎中水分的质量百分含量低于3， 再将干燥后的叶子和茎粉碎至粒径为 100120目， 得兰科石斛属植物叶子粉体； 0066 二、 将步骤一得到的兰科石斛属植物叶子粉体和固定化酶混合得萃取料， 其中兰 科石斛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为100 1， 固定化酶中采用的酶为纤维素酶、 木 聚糖酶、 果胶酶几种； 0067 三、 将步骤二的萃取料装入萃取釜， 进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物， 其中 萃取条件如下： 萃取压力为50MPa，。

28、 萃取温度75， 超临界二氧化碳流量为45kg/h， 萃取时间 为3h； 0068 四、 将步骤三得到的萃取混合物通过减压分离釜， 进行二级分离， 其中一级减压分 离压力为10MPa， 温度为50， 二级减压分离压力为6MPa， 温度为50， 获得铁皮石斛多糖提 取物， 即完成铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取。 0069 本实施例制备得到的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖提取物进行多糖类物质鉴定： 步骤四得的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖提取物进行鉴定反应。 0070 本实施例提取多糖鉴定按照实施例1中多糖鉴定检测方法。 0071 由鉴定试验检测， 本实施例提取的多糖显色为深棕色， 空白对照显色为。

29、淡淡红棕 色。 由此说明本实施例中提取为铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖。 并通过标准曲线制定及检 测， 计算出铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖含量为 67mg/ml， 铁皮石斛多糖收率达3.82。 0072 实施例4铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取方法是通过以下步骤实现的： 0073 一、 采摘无病害的铁皮石斛的叶子和茎2kg， 用水清冲洗干净， 然后在 60条件下 干燥至叶子和茎中水分的质量百分含量低于3， 再将干燥后的叶子和茎粉碎至粒径为40 60目， 得兰科石斛属植物叶子粉体； 0074 二、 将步骤一得到的兰科石斛属植物叶子粉体和固定化酶混合得萃取料， 其中兰 科石斛属植物叶子粉体和固定化。

30、酶的质量比为50 1， 固定化酶中采用的酶为纤维素酶、 木 聚糖酶、 果胶酶、 半纤维素酶和蜗牛酶几种； 0075 三、 将步骤二的萃取料装入萃取釜， 进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物， 其中 萃取条件如下： 萃取压力为25MPa， 萃取温度50， 超临界二氧化碳流量为25kg/h， 萃取时间 为2h； 0076 四、 将步骤三得到的萃取混合物通过减压分离釜， 进行二级分离， 其中一级减压分 离压力为7MPa， 温度为45， 二级减压分离压力为5.5MPa， 温度为46， 获得铁皮石斛多糖 提取物， 即完成铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖的提取。 0077 本实施例步骤三中在进行超临界二氧化碳萃。

31、取过程中， 还添加了夹带剂， 夹带剂 与萃取料的质量比为1 10， 夹带剂由有机溶剂溶解于pH值为47的缓冲液中配制的体积百 分浓度为65的有机溶剂溶液， 有机溶剂为乙醇和丙酮中的的混合物， 乙醇和丙酮的比例 为1:1。 说明书 5/8 页 8 CN 110642956 A 8 0078 本发明的提取方法中， 从萃取后的剩余物料中筛分出固定化酶， 加以回收利用。 0079 本发明步骤二中采用的固定化酶采用现有公开技术制备即可。 0080 本实施例制备得到的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖提取物进行多糖类物质鉴定： 步骤四得的铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖提取物进行鉴定反应。 0081 本实施例提取多。

32、糖鉴定按照实施例1中多糖鉴定检测方法。 0082 由鉴定试验检测， 本实施例提取的多糖显色为深棕色， 空白对照显色为淡淡红棕 色。 由此说明本实施例中提取为铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖。 并通过标准曲线制定及检 测， 计算出铁皮石斛O-乙酰葡萄甘露聚糖含量为 71mg/ml， 铁皮石斛多糖收率达4.06。 0083 实施例5乳牙牙髓间充质干细胞无血清培养(常规培养方法) 0084 无血清完全培养基I： 含DMEM基础培养基， 2mM/L L-谷氨酰胺， 2 Ultroser G溶 液， 充分混匀， 4冰箱保存。 0085 无血清完全培养基:含DMEM基础培养基， 2mM/L L-谷氨酰胺， 1。

33、0 knockout SR 血清替代物， 10ng/ml EGF， 10ng/ml bFGF。 0086 培养方法： 0087 1)新鲜剥落的乳牙采用Masako Miura等的分离办法， 用I型胶原酶消化后， 过滤离 心获得间充质干细胞进行原代培养， 原代培养采用无血清完全培养基I与无血清培养基完 全等体积混后的培养基培养， 培养周期7-14天； 0088 2)将培养有P0代乳牙间充质干细胞的T75方瓶中的细胞原始培养基吸弃， 加入 7.5ml DPBS洗涤一次； 0089 3)加入0.8ml 0.25的胰蛋白酶消化4分钟， 消化结束后用无血清完全培养基I重 悬细胞； 0090 4)将细胞悬。

34、液转移至无菌离心管中， 400G， 20， 离心5分钟； 0091 5)离心后去上清， 用无血清完全培养基I以4104cells/ml接种于新的 T25方瓶 中， 共5ml； 0092 6)将方瓶放置于二氧化碳培养箱中， 在37， 5二氧化碳浓度中培养6 小时； 0093 7)将方瓶从二氧化碳培养箱转移至生物安全柜中， 无菌移除培养瓶中的无血清完 全培养基1， 加入与之等量的完全培养基， 继续培养直至细胞汇合度达80-90； 0094 8)进行新一轮的传代培养。 0095 依据上述方式培养3代后与使用10FBS的DMEM培养基培养原代细胞后传代培养3 个代次的乳牙间充质干细胞进行形态及表型标志。

35、表达方面的检测。 0096 结果分析： 0097 (1)在用培养基I培养6小时后， 乳牙间充质干细胞全部贴壁， 但贴壁后细胞形态并 非标准的纺锤状， 而是伸出了许多触角， 这充分显示出细胞与方瓶底部存在许多锚定位点， 这与Ultroser G十分有利于细胞粘附有关。 0098 (2)培养3代后， 细胞呈现出标准的纺锤状， 且排列方式呈现出干细胞特有的旋涡 状， 在细胞形态、 汇合度上表现为正常乳牙牙髓间充质干细胞生长状态。 0099 实施例6铁皮石斛多糖对乳牙间充质干细胞增值的作用 0100 无血清完全培养基I： 含DMEM基础培养基， 2mM/L L-谷氨酰胺， 2O- 乙酰葡萄甘 露聚糖溶。

36、液， 充分混匀， 4冰箱保存。 说明书 6/8 页 9 CN 110642956 A 9 0101 无血清完全培养基:含DMEM基础培养基， 2mM/L L-谷氨酰胺， 10 knockout SR 血清替代物， 2O-乙酰葡萄甘露聚糖溶液。 0102 培养方法： 0103 1)新鲜剥落的乳牙采用Masako Miura等的分离办法， 用I型胶原酶消化后， 过滤离 心获得间充质干细胞进行原代培养， 原代培养采用无血清完全培养基I与无血清培养基完 全等体积混后的培养基培养， 培养周期7-14天； 0104 2)将培养有P0代乳牙间充质干细胞的T75方瓶中的细胞原始培养基吸弃， 加入 7.5ml 。

37、DPBS洗涤一次； 0105 3)加入0.8ml 0.25的胰蛋白酶消化4分钟， 消化结束后用无血清完全培养基I重 悬细胞； 0106 4)将细胞悬液转移至无菌离心管中， 400G， 20， 离心5分钟； 0107 5)离心后去上清， 用无血清完全培养基I以4104cells/ml接种于新的 T25方瓶 中， 共5ml； 0108 6)将方瓶放置于二氧化碳培养箱中， 在37， 5二氧化碳浓度中培养6 小时； 0109 7)将方瓶从二氧化碳培养箱转移至生物安全柜中， 无菌移除培养瓶中的无血清完 全培养基1， 加入与之等量的完全培养基， 继续培养直至细胞汇合度达80-90； 0110 8)进行新一。

38、轮的传代培养。 0111 依据上述方式培养3代后与使用实施例5培养原代细胞后传代培养3个代次的乳牙 间充质干细胞进行形态及表型标志表达方面的检测。 0112 结果分析： 0113 (1)在用培养基I培养6-8小时后， 乳牙间充质干细胞全部贴壁， 部分乳牙间充质干 细胞伸出了触角， 这充分显示出细胞与方瓶底部存在许多锚定位点， 可见铁皮石斛多糖在 培养基中也发挥着十分有利于细胞粘附。 0114 (2)培养3代后， 细胞呈现出标准的纺锤状， 且排列方式呈现出干细胞特有的旋涡 状， 在细胞形态、 汇合度上表现为正常乳牙牙髓间充质干细胞生长状态， 并且同实施例5中 培养方法培养出的乳牙牙髓间充质干细胞。

39、差异性很小。 0115 实施例7乳牙间充质干细胞培养 0116 无血清完全培养基I： 含DMEM基础培养基， 2mM/L L-谷氨酰胺， 充分混匀， 4冰箱 保存。 0117 无血清完全培养基:含DMEM基础培养基， 2mM/L L-谷氨酰胺， 10 knockout SR 血清替代物。 0118 培养方法： 0119 1)新鲜剥落的乳牙采用Masako Miura等的分离办法， 用I型胶原酶消化后， 过滤离 心获得间充质干细胞进行原代培养， 原代培养采用无血清完全培养基I与无血清培养基完 全等体积混后的培养基培养， 培养周期7-14天； 0120 2)将培养有P0代乳牙间充质干细胞的T75方。

40、瓶中的细胞原始培养基吸弃， 加入 7.5ml DPBS洗涤一次； 0121 3)加入0.8ml 0.25的胰蛋白酶消化4分钟， 消化结束后用无血清完全培养基I重 悬细胞； 说明书 7/8 页 10 CN 110642956 A 10 0122 4)将细胞悬液转移至无菌离心管中， 400G， 20， 离心5分钟； 0123 5)离心后去上清， 用无血清完全培养基I以4104cells/ml接种于新的 T25方瓶 中， 共5ml； 0124 6)将方瓶放置于二氧化碳培养箱中， 在37， 5二氧化碳浓度中培养6 小时； 0125 7)将方瓶从二氧化碳培养箱转移至生物安全柜中， 无菌移除培养瓶中的无血。

41、清完 全培养基1， 加入与之等量的完全培养基， 继续培养直至细胞汇合度达80-90； 0126 8)进行新一轮的传代培养。 0127 依据上述方式培养3代后与实施例5和实施例6培养原代细胞后传代培养3个代次 的乳牙间充质干细胞进行形态及表型标志表达方面的检测。 0128 结果分析： 0129 (1)此实施例中乳牙间充质干细胞在加入完全培养基培养后， 继续培养细胞， 汇 合度达不到80-90， 在此培养过程中汇合度达到60-70 0130 (2)在用培养基I培养6-8小时后， 乳牙间充质干细胞部分贴壁， 很少乳牙间充质干 细胞伸出触角， 这充分显示出细胞与方瓶底部锚定位点不足， 可见在此培养基中缺少利于 细胞粘附的因子。 0131 (3)培养3代后， 细胞生长状态不佳， 细胞呈现出缩短状、 梭型细胞， 且排列方式没 有规律、 不规则， 在细胞形态、 汇合度上不是正常乳牙牙髓间充质干细胞生长状态。 0132 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制； 尽管参照前述实施例 对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解： 其依然可以对前述各实施 例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换； 而这些修改或者 替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。 说明书 8/8 页 11 CN 110642956 A 11 。