纳米探针及其制备方法与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910748706.9 (22)申请日 2019.08.14 (71)申请人 深圳大学 地址 518060 广东省深圳市南山区南海大 道3688号 (72)发明人 黄鹏袁燕燕贺婷林静 (74)专利代理机构 深圳市君胜知识产权代理事 务所(普通合伙) 44268 代理人 王永文刘文求 (51)Int.Cl. C07D 401/14(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称 一种纳米探针及其制备方法与应用。

2、 (57)摘要 本发明公开一种纳米探针及其制备方法与 应用， 所述纳米探针由花菁类有机物及包裹在花 菁类有机物上的两亲性物质构成， 所述花菁类有 机物的结构通式为 其中 ， R为CH3、 CH2CH3、 本发明利用具有大共轭体系的七 甲川菁染料结构和具有刚性平面体系的三联吡 啶结构的花菁类有机物与两亲性物质构成纳米 探针， 增强了纳米探针与白蛋白结合时产生的荧 光强度及光稳定性， 从而使得纳米探针对白蛋白 检测时， 具有检测范围宽、 灵敏高、 检测限低的特 点。 权利要求书2页 说明书7页 附图5页 CN 110642839 A 2020.01.03 CN 110642839 A 1.一种纳米。

3、探针， 其特征在于， 所述纳米探针由花菁类有机物及包裹在花菁类有机物 上的两亲性物质构成， 所述花菁类有机物的结构通式为 其中， R为CH3、 CH2CH3、 2.根据权利要求1所述的纳米探针， 其特征在于， 所述两亲性物质为两亲性PEG或卵磷 脂； 所述两亲性PEG选自PEG-PE、 DSPE-PEG5000、 DSPE-PEG2000和PS-b-PEG中的一种或多种。 3.根据权利要求1所述的纳米探针， 其特征在于， 所述纳米探针的粒径为50-100nm。 4.一种如权利要求1-3任一所述的纳米探针的制备方法， 其特征在于， 包括步骤： 将花 菁类有机物、 两亲性物质与第一有机溶剂混合， 。

4、超声， 加入超纯水， 再超声， 去除第一有机溶 剂， 过膜， 超滤离心分离， 得到纳米探针。 5.根据权利要求4所述的纳米探针的制备方法， 其特征在于， 所述第一有机溶剂为二氯 甲烷、 氯仿或四氢呋喃。 6.根据权利要求4所述的纳米探针的制备方法， 其特征在于， 所述花菁类有机物的制备 方法包括步骤： 七甲川菁染料与4-(氨基)苯基-2,2,6,2-三联吡啶在第二有机溶剂中进行 反应， 反应结束后将反应混合物倒入冰水中， 经萃取、 浓缩， 柱层析分离， 得花菁类有机物； 所述七甲川菁染料的结构通式为 权利要求书 1/2 页 2 CN 110642839 A 2 其中， R为CH3、 CH2CH。

5、3、 7.根据权利要求6所述的纳米探针的制备方法， 其特征在于， 所述第二有机溶剂为甲 醇、 DMF或NMP。 8.根据权利要求6所述的纳米探针的制备方法， 其特征在于， 所述反应的条件为： 25- 100， 15-72h。 9.一种如权利要求1-3任一所述的纳米探针在定量检测样品中的白蛋白中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述定量检测的方法为荧光分光光度法 或荧光成像法。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110642839 A 3 一种纳米探针及其制备方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及纳米探针技术领域， 尤其涉及一种纳米探针及其制备方法与应用。 背景技术 。

6、0002 在临床诊断中， 蛋白质及其生物标志物的定量检测对疾病的诊断非常重要。 在各 种蛋白质中， 白蛋白(albumin， ALB)是血液中含量最多的转运蛋白， 具有重要的生物学功 能， 包括促进各种药物， 脂肪酸和代谢物的运输、 维持血液渗透压等。 一般来说， 正常血清中 白蛋白的浓度为35-55gL-1。 血液中白蛋白的浓度可以反映出个体的健康状况。 例如， 血浆 中的白蛋白浓度较低， 称为低蛋白血症， 表明可能患有肝脏和肾脏疾病或低蛋白质饮食相 关的营养不良。 相反， 正常尿液中白蛋白的浓度为30mgL-1， 如果尿液中存在过量的白蛋 白， 则有可能是糖尿病、 心血管疾病和肾脏疾病的早。

7、期征兆。 0003 现有的白蛋白的常用检测方法中， 液相色谱， 电泳分析等方法的灵敏度和便捷性 不甚理想。 虽然荧光检测法具有灵敏度高， 检测限低， 检测方法简单等优势， 逐渐成为研究 的热点， 但是目前已有的荧光探针分子激发波长较短， 容易产生背景干扰。 0004 因此， 现有技术还有待于改进和发展。 发明内容 0005 鉴于上述现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种纳米探针及其制备方法与 应用， 旨在解决现有荧光探针分子激发波长较短， 容易产生背景干扰， 不易准确检测白蛋白 含量的问题。 0006 本发明的技术方案如下： 0007 一种纳米探针， 其中， 所述纳米探针由花菁类有机物及包。

8、裹在花菁类有机物上的 两亲性物质构成， 所述花菁类有机物的结构通式为 说明书 1/7 页 4 CN 110642839 A 4 其 中 ， R 为 C H3、 C H2C H3、 0008 所述的纳米探针， 其中， 所述两亲性物质为两亲性PEG或卵磷脂； 所述两亲性PEG选 自PEG-PE、 DSPE-PEG5000、 DSPE-PEG2000和PS-b-PEG中的一种或多种。 0009 所述的纳米探针， 其中， 所述纳米探针的粒径为50-100nm。 0010 一种如上述的基于纳米探针的制备方法， 其中， 包括步骤： 将花菁类有机物、 两性 物质与第一有机溶剂混合， 超声， 加入超纯水， 再。

9、超声， 去除第一有机溶剂， 过膜， 超滤离心 分离， 得到纳米探针。 0011 所述的纳米探针的制备方法， 其中， 所述第一有机溶剂为二氯甲烷、 氯仿或四氢呋 喃。 0012 所述的纳米探针的制备方法， 其中， 所述花菁类有机物的制备方法包括步骤： 七甲 川菁染料与4-(氨基)苯基-2,2,6,2-三联吡啶在第二有机溶剂中进行反应， 反应结束后将 反应混合物倒入冰水中， 经萃取、 浓缩， 柱层析分离， 得花菁类有机物； 所述七甲川菁染料的 结构通式为 其 中 ， R 为 C H3、 C H2C H3、 0013 所述的纳米探针的制备方法， 其中， 所述第二有机溶剂为甲醇、 DMF或NMP。 0。

10、014 所述的纳米探针的制备方法， 其中， 所述反应的条件为： 25-100， 15-72h。 0015 一种如上所述的纳米探针在定量检测样品中的白蛋白中的应用。 0016 所述的应用， 其中， 所述定量检测的方法为荧光分光光度法或荧光成像法。 说明书 2/7 页 5 CN 110642839 A 5 0017 有益效果： 本发明利用具有大共轭体系的七甲川菁染料结构和具有刚性平面体系 的三联吡啶结构的花菁类有机物与两亲性物质构成纳米探针， 增强了纳米探针与白蛋白结 合时产生的荧光强度及光稳定性， 从而使得纳米探针对白蛋白检测时， 具有检测范围宽、 灵 敏高、 检测限低的特点。 附图说明 001。

11、8 图1为本发明实施例1制得的纳米探针(PNC)的TEM图。 0019 图2为在胎牛血清(FBS)存在时， 本发明实施例1制得的纳米探针(PNC)的TEM图。 0020 图3为本发明实施例1制得的纳米探针(PNC)的水合粒径分布图。 0021 图4为在FBS存在时， 本发明实施例1制得的纳米探针(PNC)水合粒径分布图。 0022 图5为本发明实施例2中PNC溶液随牛血清白蛋白(BSA)的浓度变化的荧光光谱图。 0023 图6为本发明实施例2中PNC溶液的荧光波长为610nm处的荧光强度与BSA的浓度的 变化关系图。 0024 图7为本发明实施例3中加入相同浓度的不同生物样品时， PNC溶液的。

12、荧光强度对 比图。 0025 图8为本发明实施例4中加入不同浓度的牛血清白蛋白、 胎牛血清、 老鼠血液时， PNC溶液的荧光成像图。 0026 图9为本发明实施例5中加入不同浓度牛血清白蛋白、 奶粉时， PNC溶液的荧光成像 图。 0027 图10为本发明实施例6中加入不同待测物(不同肾毒性老鼠的尿液)时， PNC溶液的 荧光强度随待测物浓度的变化对比图。 具体实施方式 0028 本发明提供一种纳米探针及其制备方法与应用， 为使本发明的目的、 技术方案及 效果更加清楚、 明确， 以下对本发明进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例 仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。 0029。

13、 本发明实施例提供一种纳米探针， 其中， 所述纳米探针由花菁类有机物及包裹在 花菁类有机物上的两亲性物质构成， 所述花菁类有机物的结构式为 说明书 3/7 页 6 CN 110642839 A 6 其中， R为CH3、 CH2CH3、 0030 本实施例利用具有大共轭体系的七甲川菁染料结构和具有刚性平面体系的三联 吡啶结构的花菁类有机物与两亲性物质构成纳米探针， 增强了纳米探针与白蛋白结合时产 生的荧光强度及光稳定性， 从而使得纳米探针对白蛋白检测时， 具有检测范围宽、 灵敏高、 检测限低的特点。 0031 在一种实施方式中， 所述两亲性物质可为但不限于两亲性PEG(polyethylene，。

14、 聚 乙二醇)或卵磷脂； 所述两亲性PEG选自但不限于PEG-PE(polyethylene-phosphatidyl e t ha n o la m i n e ， 聚乙 二 醇 磷 脂 酰乙 醇 胺) 、 D S P E - P E G 5 0 0 0 (Di s tea r o y l phosphoethanolamine-PEG5000， 甲氧基聚乙二醇磷脂， Mw为5000)、 DSPE-PEG2000 (Distearoyl phosphoethanolamine-PEG2000， 甲氧基聚乙二醇磷脂， Mw为2000)和PS-b- PEG(poly(styrene)-block。

15、-poly(ethylene glycol)， 聚苯乙烯-b-聚乙二醇)中的一种或 多种； 优选地， 所述两亲性物质为DSPE-PEG2000。 所述纳米探针为纳米颗粒， 所述纳米探针 的粒径为50-100nm。 0032 本实施例的纳米探针中的花菁类有机物疏水性较强， 包裹两亲性物质自组装后引 起荧光猝灭， 但其吲哚结构可通过非共价作用力与白蛋白特异性结合， 同时可恢复荧光。 0033 本发明实施例还提供一种如上所述的基于纳米探针的制备方法， 其中， 包括步骤： 将花菁类有机物、 两亲性物质与第一有机溶剂混合， 超声， 加入超纯水， 再超声， 去除第一有 机溶剂， 过膜， 超滤离心分离， 得。

16、到纳米探针。 0034 在一种实施方式中， 所述第一有机溶剂可为但不限于二氯甲烷、 氯仿或四氢呋喃。 0035 在一种实施方式中， 所述花菁类有机物与两亲性物质的质量比为1:5-10； 优选地， 所述所述花菁类有机物与两亲性物质的质量比为1:10。 0036 在一种实施方式中， 所述超声的时间为20-35秒， 所述再超声的时间为3分钟。 0037 在一种实施方式中， 所述过膜是指通过孔径为220 m的PES(Polyethersulfone resin， 聚醚砜树脂)滤膜； 所述超滤离心分离采用的是30KD的超滤管。 0038 在一种实施方式中， 所述的纳米探针的制备方法， 其中， 所述花菁类。

17、有机物的制备 方法包括步骤： 七甲川菁染料与4-(氨基)苯基-2,2,6,2-三联吡啶在第二有机溶剂中进行 反应， 反应结束后将反应混合物倒入冰水中， 经萃取、 浓缩， 柱层析分离， 得花菁类有机物； 说明书 4/7 页 7 CN 110642839 A 7 所述七甲川菁染料的结构通式为 其 中 ， R 为CH3、 CH2CH3、 0039 七甲川菁染料为大共轭结构， 具有较高的荧光量子产率， 采用三联吡啶修饰制备 成花菁类有机物， 增加其共轭长度的同时引入刚性平面结构， 增强了其荧光强度及光稳定 性。 0040 在一种实施方式中， 所述七甲川菁染料与4-(氨基)苯基-2,2,6,2-三联吡啶。

18、的摩 尔比为1： 1-7； 优选摩尔比为1:4。 0041 在一种实施方式中， 所述第二有机溶剂可为但不限于甲醇、 DMF(N,N-二甲基甲酰 胺)或NMP(N-甲基吡咯烷酮)； 优选地， 所述第二有机溶剂为DMF。 0042 在一种实施方式中， 所述反应的条件为： 25-100， 15-72h。 0043 本实施例所述纳米探针的制备过程简单， 利于进行大量生产。 0044 本发明实施例还提供一种如上所述的纳米探针在定量检测样品中的白蛋白中的 应用。 0045 本实施例的纳米探针中的七甲川菁染料为大共轭结构， 具有较高的荧光量子产 率， 经三联吡啶修饰形成花菁类有机物， 增加其共轭长度的同时引。

19、入刚性平面结构， 增强了 的荧光强度及光稳定性。 花菁类有机物疏水性较强， 包裹PEG自组装后引起荧光猝灭， 但其 吲哚结构可通过非共价作用力与白蛋白特异性结合， 同时可恢复荧光。 本实施例的纳米探 针检测范围宽， 检测限低， 信号灵敏， 可以大量生产， 能够特异性检测白蛋白， 可以应用于如 刑侦案件血迹的检测， 肾毒性患者的尿液微量白蛋白的检测， 奶粉中蛋白质的含量检测等 领域。 0046 在一种实施方式中， 所述定量检测的方法为荧光分光光度法或荧光成像法。 0047 下面通过实施例对本发明进行详细说明。 0048 实施例1 0049(1)七甲川菁染料为时， 说明书 5/7 页 8 CN 1。

20、10642839 A 8 按照反应式 0050 制备花菁类有机物； 具体制备步骤为： 将七甲川菁染料(100mg， 0.14mmol)和4-(氨 基)苯基2,2,6,2-三联吡啶(100mg， 0.31mmol)在无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(4mL)中于90 搅拌24小时,冷却至室温， 旋干去除溶剂， 以二氯甲烷/甲醇(体积比为25:1)为洗脱剂， 经 硅胶柱层析分离， 得到花菁类有机物。 该花菁类有机物的结构表征数据为： 1H NMR(600MHz, CDCl3) 8.32(d,J14.1Hz,2H),8.09(d,J8.5Hz,2H),7.85(dd,J19.1,8.2Hz,4H)。

21、, 7.56(t,J7.6Hz,2H) ,7.43(s,2H) ,7.34(d,J8.8Hz,2H) ,7.28(m,9H) ,7.08(d,J 7.5Hz,1H),6.77(s,1H),6.24(d,J14.1Hz,1H),5.58(s,2H),5.24(s,1H),2.52(s,4H), 2.00(s,9H) ,1.65(s,2H) ,1.19(s,2H)； 飞行质谱测得的分子量为1023.5080， 理论值为 1024.35。 0051 (2)基于步骤(1)制得的花菁类有机物， 制备纳米探针； 具体制备步骤为： 将花菁类 有机物(1mg， 0.98 mol)溶于1mL二氯甲烷中， 加入1。

22、0mg的DSPE-PEG2000， 超声30s， 快速加入 5mL超纯水， 再超声3min， 用氮气鼓出二氯甲烷， 过220 m的PES滤膜， 转移至30kD的超滤管 中， 在4条件下离心(转速为3500转/分钟)15分钟， 得到纳米探针(PNC)， 为蓝绿色的纳米 颗粒， 将纳米探针避光保存备用。 该纳米探针(PNC)的透射电镜(TEM)测试结果如图1所示， 可知该纳米探针的形貌为球形， 尺寸均匀， 粒径约为50nm； 将该纳米探针(PNC)加入胎牛血 清(FBS)， 并用透射电镜(TEM)对其进行测试， 测试结果如图2所示， 可知纳米探针出现明显 的解体现象， 表明FBS可与纳米探针作用从。

23、而导致纳米探针的结构被破坏。 0052 用马尔文粒径仪对该纳米探针(PNC)测得的水合粒径分布情况如图3所示， 可知该 纳米探针(PNC)的粒径分布集中， 尺寸均匀， 其水合粒径约为180nm； 将该纳米探针(PNC)加 入胎牛血清(FBS)， 并用马尔文粒径仪对其进行测试， 测得的水合粒径分布情况如图4所示， 可知加入FBS之后纳米探针粒径分布比较分散， 进一步表明FBS可与纳米探针作用从而导致 纳米探针的结构被破坏。 0053 实施例2 0054 对实施例1制得的纳米探针(PNC)的灵敏度进行表征： 制备3mL实施例1制得的纳米 探针(PNC)(15 M)的水溶液； 将牛血清白蛋白(BSA。

24、)溶于去离子水制备待测样品溶液(55mg/ mL)， 然后向纳米探针水溶液中按0.1的体积浓度间隔依次加入0-1.0的牛血清白蛋白， 通过荧光分光光度计测量荧光强度， 纳米探针随BSA的浓度变化的荧光光谱变化情况如图5 所示， 表明纳米探针溶液的荧光强度与BSA的浓度增大而增强。 实施例1制得的纳米探针 (PNC)在荧光波长为610nm时的荧光强度与随BSA的浓度的变化关系如图6所示， 可知两者呈 线性变化关系， 计算得出实施例1制得的纳米探针对BSA的检测限为4.8 g/mL。 0055 实施例3 0056 对实施例1制得的纳米探针(PNC)的特异性进行表征： 制备3mL纳米探针(15 M)。

25、的 说明书 6/7 页 9 CN 110642839 A 9 水溶液， 分别将淀粉、 酯酶、 胰酶、 铁转蛋白、 谷胱甘肽、 球蛋白、 胆固醇、 牛血清白蛋白、 人血 清白蛋白生物样品分别溶于去离子水制备待测样品溶液(1.0mM)， 随后将上述5的各待测 液加入纳米探针溶液中， 以未加待测液的纳米探针(15 M)的水溶液为空白对照实验， 采用 荧光分光光度计测量荧光， 含有不同生物样品的PNC溶液的荧光强度对比情况如图7所示， 可知只有牛血清白蛋白与人血清白蛋白两组溶液与纳米探针作用产生显著的荧光， 表明白 蛋白可以特异性结合纳米探针产生荧光。 0057 实施例4 0058 荧光成像检测血液的。

26、白蛋白， 在96孔板的板孔中分别加入200 L 15 M的实施例1 制得的纳米探针(PNC)， 分别然后按照0.4的体积浓度间隔依次加入不同浓度的待测物： 牛血清白蛋白、 胎牛血清及老鼠血液， 用小动物荧光成像系统检测其荧光强度,加入不同浓 度的牛血清白蛋白、 胎牛血清及老鼠血液的PNC溶液的荧光成像结果如图8所示， 可知， 荧光 强度均随待测物浓度增强而增强， 表明纳米探针(PNC)可以检测血液中的白蛋白。 0059 实施例5 0060 荧光成像检测奶粉中的白蛋白： 在96孔板的板孔中分别加入200 L15 M的实施例1 制得的纳米探针(PNC)， 分别然后按照0.2的质量浓度间隔分别依次加。

27、入不同浓度的牛血 清白蛋白、 奶粉， 用小动物荧光成像系统检测其荧光强度； 加入不同浓度牛血清白蛋白、 奶 粉的PNC的荧光成像结果如图9所示， 可知， 荧光强度随待测物浓度增强而增强， 表明纳米探 针可以检测奶粉中的白蛋白。 0061 实施例6 0062 肾毒性老鼠的尿液中白蛋白的检测： 所有的实验操作均按照临床中心动物保健和 使用委员会通过的动物使用和保健制度。 取两只雌性裸鼠(六周,16-20g)， 一只不做处理， 48小时后收集其尿液作为对照组待测液； 另外一只在裸鼠后腿皮下注射100 L体积浓度为 50的甘油， 每隔24小时注射一次， 连续注射2次建立急性肾炎性老鼠模型， 第二次注射。

28、24 小时后取收集其尿液作为肾毒性组待测液。 向两组15 M的实施例1制得的纳米探针(PNC)水 溶液中， 按照体积浓度为0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0的顺序分别加入对照组待测液、 实验组待测液， 采用荧光分光光度计检测其荧光强度； 含有不同待测液的PNC溶液的荧光强 度随浓度的变化情况如图10所示， 可知肾毒性组小鼠尿液中含有一定量的白蛋白， 对照组 小鼠尿液几乎不含白蛋白， 表明纳米探针可用于检测尿液中的白蛋白。 0063 综上所述， 本发明利用具有大共轭体系的七甲川菁染料结构和具有刚性平面体系 的三联吡啶结构的花菁类有机物与两亲性物质构成纳米探针， 增强了纳米探针与白蛋白。

29、结 合时产生的荧光强度及光稳定性， 从而使得纳米探针对白蛋白检测时， 具有检测范围宽、 灵 敏高、 检测限低的特点。 本发明的纳米探针制备过程简单， 可大量生产， 能够特异性检测白 蛋白， 可应用于如刑侦案件血迹的检测， 肾毒性患者的尿液微量白蛋白的检测， 奶粉中蛋白 质的含量检测等领域。 0064 应当理解的是， 本发明的应用不限于上述的举例， 对本领域普通技术人员来说， 可 以根据上述说明加以改进或变换， 所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保 护范围。 说明书 7/7 页 10 CN 110642839 A 10 图1 图2 说明书附图 1/5 页 11 CN 110642839 A 11 图3 图4 说明书附图 2/5 页 12 CN 110642839 A 12 图5 图6 说明书附图 3/5 页 13 CN 110642839 A 13 图7 图8 说明书附图 4/5 页 14 CN 110642839 A 14 图9 图10 说明书附图 5/5 页 15 CN 110642839 A 15 。