基于香樟叶片的端粒长度测定树龄的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910988503.7 (22)申请日 2019.10.17 (71)申请人 江西省科学院生物资源研究所 地址 330096 江西省南昌市高新区昌东大 道7777号 (72)发明人 刘立盘钟永达杨爱红周华 陈彩慧余发新 (74)专利代理机构 北京汇知杰知识产权代理有 限公司 11587 代理人 柴春玲杨巍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6813(2018.01) (54)发明名称 一种基于香樟叶片的端粒长度测定树龄的 方法 。

2、(57)摘要 本发明通过提取香樟叶片的基因组DNA， 用 TaqI(5-TCGA-3)限制性内切酶进行酶切， 以 5-TTTAGGG-3寡核苷酸作为单链DNA探针， 进行 核酸杂交， 测定杂交产物的末端限制性片段长度 (TRF)， 表示叶片的端粒长度， 建立预测香樟树龄 的相关性曲线模型， 进而对香樟的树龄进行预 测。 结果表明， 利用本发明的相关性曲线模型预 测的香樟树龄与实际树龄比较一致， 说明该曲线 模型准确性较高， 可以有效且准确地测定香樟树 龄。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 110656197 A 2020.01.07 CN 110656197 A 1.一种测定香樟树。

3、龄的方法， 其中， 所述方法包括如下步骤： (1)提取香樟叶片的基因组DNA； (2)用Taq I限制性内切酶对提取的所述基因组DNA进行酶切， 得到酶切产物； (3)以5-TTTAGGG-3所示的寡核苷酸作为单链DNA探针， 对所述酶切产物进行核酸杂 交， 得到杂交产物； (4)对所述杂交产物的末端限制性片段长度(TRF)进行测定， 表示所述香樟叶片的端粒 长度； (5)通过式I所示的香樟树龄与端粒长度的相关性曲线模型来计算香樟树龄， 以所述端 粒长度值作为y值， 通过式 来计算x值， 即为所述香樟的树龄： y6E-05x2-0.065x+27.78 式 ， 其中， 式 中的x代表香樟的树龄。

4、， y代表端粒长度。 2.根据权利要求1所述的测定香樟树龄的方法， 其中， 所述香樟叶片为香樟当年生叶 片。 3.根据权利要求1所述的测定香樟树龄的方法， 其中， 用于酶切的所述基因组DNA的重 量为15 g， 浓度大于50ng/ L。 4.根据权利要求1所述的测定香樟树龄的方法， 其中， 所述基因组DNA的提取方法为改 良CTAB法。 5.根据权利要求1所述的测定香樟树龄的方法， 其中， 所述探针带有非放射性荧光标 记。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110656197 A 2 一种基于香樟叶片的端粒长度测定树龄的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体地， 涉及一种基于。

5、香樟叶片的端粒长度测定树龄 的方法。 背景技术 0002 香樟(Cinnamomum camphora(L.)Presl)为樟科、 樟属的常绿大乔木， 是我国长江 流域及其以南重要的珍贵乡土树种。 江西是香樟重要分布区， 古香樟(古樟)遍布全省各地， 甚至千年以上的古樟成为多地的重要景观， 更是研究香樟乃至当地自然地理变迁的宝贵种 质资源。 香樟树龄的准确测定是保护和保存樟树重要遗传资源的基础。 0003 近年来， 随着分子生物学的发展， 通过分子手段来检测植物的年限得到了一定程 度的发展。 端粒(telomere)是位于真核细胞线性染色体DNA末端， 由DNA重复序列与蛋白质 组成的特异复合。

6、体结构。 端粒序列第一次是在拟南芥中克隆成功的。 研究发现， 端粒长度的 变化可以表征植物年龄。 一般认为， 随着植物生理年龄的增加， 端粒长度逐步缩短， 直至缩 短到极限， 细胞分裂停止， 进入衰老状态。 端粒长度可以反映细胞的生理年龄和细胞复制能 力， 在一定程度上反映了植物无性繁殖能力。 端粒长度在不同树种、 树龄、 组织、 生理年龄、 同一植物不同的生长发育时期、 不同环境下的相同部位都会存在差异。 0004 由于香樟树龄极长， 还不知道樟树的树龄到底能达到多少年， 这种情况下端粒长 度能否表征香樟树龄， 如果表征香樟树龄， 能否用端粒长度推断香樟的寿命， 是需要解决的 问题。 发明内。

7、容 0005 为了准确地测定香樟树龄， 本发明提出了一种基于叶片端粒长度(TRF值)测定香 樟树龄的方法。 0006 本发明提供了一种测定香樟树龄的方法， 其中， 所述方法包括如下步骤： 0007 (1)提取香樟叶片的基因组DNA； 0008 (2)用Taq I限制性内切酶对提取的所述基因组DNA进行酶切， 得到酶切产物； 0009 (3)以5-TTTAGGG-3所示的寡核苷酸作为单链DNA探针， 对所述酶切产物进行核 酸杂交， 得到杂交产物； 0010 (4)对所述杂交产物的末端限制性片段长度(TRF)进行测定， 表示所述香樟叶片的 端粒长度； 0011 (5)通过式I所示的香樟树龄与端粒长。

8、度的相关性曲线模型来计算香樟树龄， 以所 述端粒长度作为y值， 通过式 来计算x值， 即为所述香樟的树龄： 0012 y6E-05x2-0.065x+27.78 式 ， 0013 其中， 式 中的x代表香樟的树龄， y代表端粒长度。 0014 在上述方法中， 所述香樟叶片为香樟当年生叶片。 0015 在上述方法中， 用于酶切的所述基因组DNA的重量为15 g。 说明书 1/7 页 3 CN 110656197 A 3 0016 在上述方法中， 用于酶切的所述基因组DNA的浓度大于50ng/ L。 0017 在上述方法中， 所述基因组DNA的提取方法为改良CTAB法。 0018 在上述方法中， 。

9、所述探针带有非放射性荧光标记。 0019 在上述方法中， 所述荧光标记是地高辛。 0020 本发明通过提取香樟叶片的基因组DNA， 用Taq I(5-TCGA-3)限制性内切酶对提 取的所述基因组DNA进行酶切， 得到酶切产物， 以5-TTTAGGG-3所示的寡核苷酸作为单链 DNA探针， 对酶切产物进行核酸杂交， 测定杂交产物的末端限制性片段长度， 表示香樟叶片 的端粒长度， 从而建立预测香樟树龄的相关性曲线模型， 进而对香樟的树龄进行预测。 结果 表明， 利用本发明的相关性曲线模型预测的香樟树龄与实际树龄比较一致， 说明该曲线模 型准确性较高， 可以有效且准确地测定香樟树龄。 通过本发明，。

10、 证明了通过香樟叶片的端粒 长度可以对极长的香樟树龄进行预测， 并且仅采用少量的香樟叶片就可以进行相关预测， 可以避免对香樟造成损坏， 这对于香樟的保护具有十分重要的意义。 0021 此外， 通过本发明建立的香樟树龄与端粒长度的相关性曲线模型可以实现对树龄 极长的香樟准确预测其树龄， 并且从相关性曲线模型可以发现， 在香樟树龄前700年， 随着 香樟树龄的增长， 相应的端粒长度不断下降， 但是在香樟树龄460年到700年， 端粒长度的下 降趋势比较平缓， 因此， 本发明提供的相关性曲线模型可以对高达700年香樟的树龄进行准 确地预测， 即可以结合相应香樟的端粒长度准确地计算出其相应的树龄， 但。

11、是结合目前发 现的树龄长达几千年的香樟， 我们推测香樟树龄在700年之后， 端粒长度可能维持在稳定状 态， 这在一定程度上说明在香樟叶片的端粒长度到达最短长度后， 香樟还可以继续存活很 多年。 附图说明 0022 为了更清楚地说明本发明的实施例， 下面将对附图作简单地介绍。 显而易见地， 下 面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创 造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。 0023 图1是不同树龄香樟的年限挂牌标识。 0024 图2是根据本发明的实施方案的香樟叶片的基因组DNA的酶切图， 其中， 1、 2、 3、 4和 5分别代表树龄为。

12、5年、 100年、 210年、 460年及700年的香樟， M为1Kb DNA Ladder(Trans)。 0025 图3是根据本发明的实施方案的香樟叶片的Southern Blot杂交图， 其中， 1、 2、 3、 4 和5分别代表树龄为5年、 100年、 210年、 460年及700年的香樟， M为DNA Molecular-Weight Marker III(DIG-labeled,Roche)。 0026 图4是根据本发明的实施方案的香樟树龄与香樟叶片的端粒长度的相关性曲线模 型。 0027 图5是根据本发明的实施方案的香樟叶片的Southern Blot杂交图， 其中， 1和2分 。

13、别代表树龄为500和80年的香樟， M为DNA Molecular-Weight Marker III(DIG-labeled, Roche)。 具体实施方式 0028 下面将结合本发明的实施方案以及说明书附图， 对本发明的技术方案进行清楚、 说明书 2/7 页 4 CN 110656197 A 4 完整地描述， 显然， 所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案， 而不是全部的实施 方案。 基于本发明中的实施方案， 本领域普通技术人员能够获得的所有其他实施方案， 都属 于本发明保护的范围。 0029 如无特别说明， 本发明的实施方案中所使用的实验仪器、 实验试剂和实验药品均 可通过商业途径。

14、获得。 0030 实验仪器： 超微量紫外分光光度计： NanoDrop2000， Thermo公司； 梯度PCR仪： TP600 型， Takara公司； 离心机： Sigma 1-14型， Sartorius公司； 电泳仪： TY2795型， BIO-RAD公司； 电泳槽： Sub-Cell GT Cell， BIO-RAD公司； 凝胶成像分析系统： GelDocXR型， BIO-RAD公司； 移液枪： 2.5 L/10 L/100 L/200 L/1000 L， Eppendorf公司。 0031 实验试剂： PCR DIG Probe Synthesis Kit： Roche公司； 地高。

15、辛杂交检测试剂盒II (化学发光法)： Roche公司； Hyb-100： Roche公司； Anti-DIG-AP： Roche公司； Taq I限制性内 切酶： Takara公司； 1Kb DNA Ladder， Trans公司； TE buffer， Solarbio； HyBond N+正电荷尼 龙膜： Amersham公司； CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒， TaKaRa公司； DNA Molecular- Weight Marker， DIG-labeled： Roche公司。 0032 实验药品如下所示： 0033 CTAB裂解液： 100mmol/L Tris-HC1(。

16、pH 8.0)， 1.4mol/L NaCl， 25mmol/L EDTA， 2 CTAB， 4PVP， 1巯基乙醇。 0034 脱嘌呤液： 称量20.8mL 12mol/L HCl用ddH2O定容至1L， 保存在常温。 0035 变性液： 称取20g NaOH和87.6g NaCl用ddH2O溶解并定容至1L， 保存在常温。 0036 中和液： 称取87.6g NaCl溶解在500ml 1mol/L Tris(pH 8.0)， 加ddH2O定容至1L， 保存在常温。 0037 20SSC： 称取175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠溶解在800mL ddH2O中， 加入数滴 10mol/。

17、L NaOH调pH至7.0， 加ddH2O定容至1L， 高压灭菌。 再用ddH2O分别稀释得到2SSC和1 SSC。 0038 预杂交液： 称量12 .5mL 20SSC， 0 .5mL 10(w/vol)十二烷基肌氨酸钠 (Sarkosyl)和100 L 20十二烷基硫酸钠(SDS)溶解在37mL ddH2O中保存在-20。 0039 洗涤缓冲液1： 称量100mL 20SSC和5mL 20SDS用ddH2O定容至1L， 保存在常温。 0040 10马来酸缓冲液： 称取116.1g马来酸和87.66g NaCl用ddH2O溶解并定容至1L， 保存在4。 0041 洗涤缓冲液2： 称量200m。

18、L 10马来酸缓冲液和6mL Tween 20用ddH2O定容至2L， 保存在常温。 0042 封闭液： 称取1g封闭剂(blocking reagent,Roche)加入到100mL 1马来酸缓冲 液， 加热到70溶解， 冷切至常温保存待用。 0043 实验材料： 取自江西安福县(100年， 210年， 460年及700年)和课题组南昌县香樟基 地(5年)两个地方5个不同树龄的香樟叶片， 每个年龄段共取3棵树。 0044 实施例1香樟叶片基因组DNA的提取 0045 取香樟当年生的幼嫩叶片1g， 液氮下迅速研磨成粉末(加入的样品量不能超过离 心管一半)加入到2mL离心管中， 加入750 L预。

19、热的CTAB裂解液60水浴20min， 每间隔5min 左右摇匀一次， 取出离心管冷却至室温。 通风橱下加入1mL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)， 轻轻 说明书 3/7 页 5 CN 110656197 A 5 摇匀10min。 在常温下12 000rpm离心15min， 取上清液至2mL离心管中。 加入RNase A 5 L在 37下水浴30min， 每隔10min摇匀一次(酶的体积根据上清液的体积可以调整， 加酶的时候 上下翻转15次)， 再重复加入1mL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)摇匀10min， 在常温下12 000rpm 离心15min， 取上清液至2mL离心管中。 加入两。

20、倍体积-20预冷的异丙醇， 轻轻混匀， 静置 20min后， 室温下钩出乳白色絮状DNA至1.5mL离心管， 用75的无水乙醇洗涤两次， 每次 10min。 在通风橱下37晾干10min， 溶解于DEPC处理的灭菌ddH2O离心管中， 将提取的基因 组DNA保存在-80超低温冰箱。 0046 在本发明中， 采用改良的CTAB法提取香樟叶片DNA， 由于香樟叶片中含有较多的多 糖和酚类， 因此在CTAB裂解液中加入4PVP， 以及加入酚/氯仿/异戊醇， 作用是能有效地去 除多糖和酚类等杂质。 在本发明中， 使用RNase A酶去除组织中的RNA。 0047 实施例2香樟叶片基因组DNA的酶切 0。

21、048 利用限制性内切酶Taq I(Takara公司)对香樟当年生叶片基因组DNA进行酶切， 酶 切体系如下表1所示： 0049 表1基因组DNA的酶切体系 0050 0051 取基因组DNA样品15 g， 加入上述酶切体系， 温和搅拌， 65消化过夜(16h)， 得到 酶切产物， 即酶切后的基因组DNA。 0052 取上述酶切后的基因组DNA各5 L， 进行1琼脂糖凝胶电泳， 结果如图2所示， 其 中， 1、 2、 3、 4和5分别代表树龄为5年、 以及图1中的挂牌年限为100年、 210年、 460年及700年 的香樟， M为1kb DNA Ladder(Trans)。 由图2中示出的酶切。

22、电泳图可以看出条带成弥散状， 因此基因组DNA酶切充分。 0053 实施例3凝胶电泳及转膜 0054 电泳： 用等体积酚： 氯仿抽提酶切后的基因组DNA， 12 000rpm离心10min， 去上清液 加入-20预冷的异丙醇20min， 取沉淀物产物溶于50 L去离子水。 将制备好的样品进行1 的琼脂糖凝胶电泳， 25V恒压、 4、 过夜。 0055 为了便于下一步DNA的转膜， 将凝胶置于凝胶体积3倍体积的脱嘌呤液中室温震荡 30min， 用蒸馏水冲洗1次。 0056 转膜： 将脱嘌呤后的琼脂糖凝胶进行如下转膜操作： 0057 (1)碱变性： 将上述电泳步骤中的琼脂糖凝胶置于平皿， 用蒸馏水。

23、冲洗1次后， 加入 说明书 4/7 页 6 CN 110656197 A 6 凝胶体积3倍体积变性液室温振荡30min， 用蒸馏水冲洗2次， 以去除变性液； 0058 (2)中和： 加入凝胶体积3倍体积中和液， 室温振荡30min， 用蒸馏水冲洗2次， 以去 除中和液； 0059 (3)转移： 将尼龙膜和凝胶浸泡在20SSC溶液1h， 。 0060 (4)固定： 取下膜作好标记， 在常温下干燥15min， 以固定基因组DNA。 0061 实施例4杂交 0062 预杂交： 将转膜步骤中的尼龙膜放入杂交管中， 加入10mL预杂交液， 在65下杂交 2h。 0063 探针变性： DNA探针在PCR仪。

24、中100变性10min， 立即放冰水浴中冷却5min。 0064 杂交： 排尽预杂交液， 加入10mL Hyb-100杂交液(Roche)和20 L变性探针， 混匀， 37 杂交过夜。 0065 实施例5洗膜与检测 0066 (1)室温下， 在50mL(2SSC、 0.1SDS)洗液中洗膜2次， 每次15min。 0067 (2)在65下， 在50mL(1SSC、 0.1SDS)洗液中洗膜2次， 每次15min。 0068 (3)再将膜置于50mL洗涤缓冲液1中平衡5min。 0069 (4)将膜在50mL封闭液中封闭30min(在摇床上轻轻摇动)。 0070 (5)将Anti-DIG-AP抗。

25、体在10 000rpm/min下离心5min， 加入4.0 L Anti-DIG-AP抗 体到40ml封闭液中混匀。 加入混合液浸泡尼龙膜静置30min。 0071 (6)用洗涤缓冲液2洗膜2次， 每次15分钟。 0072 (7)在膜的正面(核酸面)滴加1mL的CDP-Star， 常温下密封静置5min， 去除多余的 液体， 37孵育10min。 0073 (8)置于X-射线胶片上进行曝光显影并记录实验结果。 0074 实施例6结果分析 0075 香樟当年生叶片的Southern Blot杂交结果如图3所示。 0076 通过TeloTool软件对香樟当年生叶片的Southern Blot杂交结。

26、果进行数据分析后 得到各个树龄的香樟当年生叶片的末端限制性片段长度， 代表端粒长度。 每个叶片重复3 次。 香樟的树龄和根据上述杂交结果得到的相应端粒长度的实验数据如下表2所示。 0077 表2不同树龄香樟叶片的端粒长度 说明书 5/7 页 7 CN 110656197 A 7 0078 0079 根据表2中的数据对得到的香樟叶片的端粒长度和相应香樟的树龄进行相关性预 测。 如图4所示， 以香樟树龄为横坐标(x)， 相应的端粒长度为纵坐标(y)， 得到预测香樟树龄 的相关性曲线模型如下式 所示： 0080 y6E-05x2-0.065x+27.78 式 0081 其中， x代表香樟树龄， y代。

27、表端粒长度。 0082 从图4中曲线的整体趋势可以看出， 随着香樟的树龄不断增大， 相应的端粒长度不 断缩短。 根据图4中曲线的延伸结果， 预测香樟在200年左右时处于壮年， 在400年左右时处 于中年， 在700年时进入老年， 香樟的极限端粒长度在6kb左右。 据报道在江西省吉安市安福 县严田乡严田村发现了树龄在2000多年的香樟树， 被评为2019年 “江西树王” ， 说明染色体 端粒在到达最短长度后， 香樟还可以活好多年。 0083 实施例7基于香樟叶片的端粒长度测定香樟树龄的应用 0084 为了确保对香樟树龄的准确预测， 增加本发明提供的预测模型的可靠性， 发明人 对实施例6所得到的相。

28、关性曲线模型的准确性进行了进一步的验证。 0085 基于上述目的， 发明人采集了2个树龄已知且跨度较大的香樟叶片， 首先， 测定这 两个树龄的香樟叶片的端粒长度， 然后利用上述模型得到预测的香樟树龄， 并与相应香樟 的实际树龄进行比较， 以验证上述相关性曲线模型的准确性。 0086 结果如图5和表3所示， 图5所示实际树龄为80年和500年的香樟当年生叶片的 Southern Blot杂交结果， 通过对图5的杂交结果进行分析计算， 端粒长度(y值)代入实施例 6中的相关性模型式 ， 得到香樟树龄的预测结果， 如下表3所示。 0087 表3香樟树龄的预测结果 0088 说明书 6/7 页 8 C。

29、N 110656197 A 8 0089 由表3可以看出， 利用本发明的相关性曲线模型预测的香樟树龄与实际树龄比较 一致， 说明该曲线模型准确性较高， 可以应用在香樟树龄的预测和研究中。 0090 目前， 没有人对香樟， 特别是古樟的端粒长度进行研究， 不知道在香樟的细胞分裂 过程中， 染色体端粒长度的变化规律。 本发明首次给出了预测香樟树龄的数学模型， 香樟树 龄和端粒长度并不是简单的线性关系那么简单。 0091 以上仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和 原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 7/7 页 9 CN 110656197 A 9 图1 图2 说明书附图 1/3 页 10 CN 110656197 A 10 图3 图4 说明书附图 2/3 页 11 CN 110656197 A 11 图5 说明书附图 3/3 页 12 CN 110656197 A 12 。