深加工植物油脂中转基因成分提取方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911018346.3 (22)申请日 2019.10.24 (71)申请人 九三集团哈尔滨惠康食品有限公司 地址 150000 黑龙江省哈尔滨市开发区哈 平路集中区哈平东路1号 申请人 黑龙江省质量监督检测研究院 (72)发明人 张理博鞠福龙罗淑年王雪 杨光夏雷赵平刘园园 (74)专利代理机构 哈尔滨龙科专利代理有限公 司 23206 代理人 高媛 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) (54)发明名称 一种深加工植物油脂中转基因成分提取方 法 。

2、(57)摘要 一种深加工植物油脂中转基因成分提取方 法， 属于植物油脂的转基因成分检测技术领域。 所述方法步骤如下： 向Eppendorf管加入250L 正己烷和250LDNA裂解液， 再加入500L转基 因食用油脂， 混合后裂解； 加入0.5mL预冷的三氯 甲烷和异戊醇的混合液， 混合后， 冷冻离心， 上清 液收集到一个Eppendorf管中； 重复上述步骤； 向 装有上清液的Eppendorf管中加预冷的异丙醇， 放置沉淀； 沉淀后冷冻离心， 弃去上清液， 再加入 乙醇进行洗涤， 冷冻离心， 弃去上清液， 沉淀物烘 干， 每10min观察一次直至完全晾干； 加入TE缓冲 液， 充分溶解DN。

3、A， 保存备用。 本发明解决了植物 油中DNA模板难提取的问题， 此操作方法简便， 快 捷， 灵敏度高， 可适用于大部分植物油中DNA的提 取， 提取时间短， 且纯度较高。 权利要求书1页 说明书3页 CN 110656107 A 2020.01.07 CN 110656107 A 1.一种深加工植物油脂中转基因成分提取方法， 其特征在于： 所述方法步骤如下： 步骤一： 准备一支2mL Eppendorf管， 加入250 L正己烷和250 LDNA裂解液， 再加入500 L转基因食用油脂， 充分混合后放入水浴锅中裂解1h； 步骤二： 裂解后向Eppendorf管中加入0.5mL预冷的三氯甲烷和。

4、异戊醇的混合液， 充分 混合后， 冷冻离心， 将上清液收集到一个新的2mL Eppendorf管中； 步骤三： 重复步骤二一次后执行步骤四； 步骤四： 向装有上清液的2mL Eppendorf管中加预冷的异丙醇， 放置沉淀； 步骤五： 沉淀后冷冻离心， 弃去上清液， 再加入乙醇进行洗涤， 冷冻离心， 弃去上清液， 沉淀物在35烘箱中加热1h， 如未完全晾干， 继续复烘， 每10min观察一次直至完全晾干； 步骤六： 晾干后向Eppendorf管中加入TE缓冲液， 充分溶解DNA， 保存备用。 2.根据权利要求1所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取方法， 其特征在于： 步 骤一中， 所述DN。

5、A裂解液的制备方法为： 称取4.00g8.00g CTAB， 16.00g18.00gNaCl， 4g 6g吐温-20， 3g5g Tris-HCl， 1g2g EDTA， 1g2g二硫苏糖醇， 5 g10 g蛋白酶K， 用 170mL180mL水溶解后， 调节pH为8.0， 最终加水定容至200mL， 在121温度、 15psi压力下 灭菌15min。 3.根据权利要求1所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取方法， 其特征在于： 步 骤一中， 所述水浴温度为6080。 4.根据权利要求1所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取方法， 其特征在于： 步 骤二中， 所述三氯甲烷和异戊醇的混合液。

6、提前08预冷， 三氯甲烷和异戊醇的体积比为 1530： 1。 5.根据权利要求1所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取方法， 其特征在于： 步 骤二中， 所述冷冻温度为08， 离心时间为1030min， 转速为1200016000r/min。 6.根据权利要求1所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取方法， 其特征在于： 步 骤四中， 所述异丙醇为-10-25预冷， 添加量为5001000 L。 7.根据权利要求1所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取方法， 其特征在于： 步 骤四中， 所述沉淀时间为1h， 温度为-15-24。 8.根据权利要求1所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取方。

7、法， 其特征在于： 步 骤五中， 所述冷冻离心条件为离心温度为08， 离心时间为1030min， 转速为15000r/ min。 9.根据权利要求1所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取方法， 其特征在于： 步 骤五中， 所述乙醇浓度为5090vol.， 添加量为400600 L。 10.根据权利要求1所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取方法， 其特征在于： 步骤六中， TE缓冲液添加量为1560 L， 溶解后DNA保存温度为08。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110656107 A 2 一种深加工植物油脂中转基因成分提取方法 技术领域 0001 本发明属于植物油脂的转基因成分检测。

8、技术领域， 具体涉及一种深加工植物油脂 中转基因成分提取方法。 背景技术 0002 目前， 食用植物油一般是经过原材料压榨， 获得初级毛油， 毛油经过滤、 脱胶、 脱 酸、 脱色、 脱臭等加工环节精炼而成， 在加工环节需要经过240高温、 高压、 蒸汽、 强碱等处 理， DNA严重降解且破坏成小分子。 由于食用植物油经各种工艺加工后， 蛋白质分子变性且 被分离， 其转基因成分主要集中在DNA水平的检测。 利用PCR方法检测加工食品中的转基因 成分， 主要依赖于分离DNA质量、 纯度和总量。 因此， 能否从食用植物油中分离符合质量的 DNA， 是成功检测转基因成分的关键技术环节。 0003 国内。

9、外关于植物油DNA提取的报道， 大多数采用试剂盒法提取， 但是因为精炼植物 油中DNA含量少且完整度低， 所以目前采用的试剂盒法提取精炼油的效果并不理想， 还有报 道用传统的EDTA法提取， 也是存在提取时间长， 步骤复杂， 而且得到的DNA纯度不够， 即使用 实时荧光定量PCR法也无法扩增出相应的內源基因。 发明内容 0004 本发明的目的是为了解决植物油DNA提取存在的纯度低、 时间长等问题， 提供一种 深加工植物油脂中转基因成分提取方法。 0005 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案如下： 0006 一种深加工植物油脂中转基因成分提取方法， 所述方法步骤如下： 0007 步骤一： 准。

10、备一支2mL Eppendorf管， 加入250 L正己烷和250 L DNA裂解液， 再加 入500 L转基因食用油脂， 充分混合后放入水浴锅中裂解1h； 0008 步骤二： 裂解后向Eppendorf管中加入0.5mL预冷的三氯甲烷和异戊醇的混合液， 充分混合后， 冷冻离心， 将上清液收集到一个新的2mL Eppendorf管中； 0009 步骤三： 重复步骤二一次后执行步骤四； 0010 步骤四： 向装有上清液的2mL Eppendorf管中加预冷的异丙醇， 放置沉淀； 0011 步骤五： 沉淀后冷冻离心， 弃去上清液， 再加入乙醇进行洗涤， 冷冻离心， 弃去上清 液， 沉淀物在35烘箱。

11、中加热1h， 如未完全晾干， 继续复烘， 每10min观察一次直至完全晾 干； 0012 步骤六： 晾干后向Eppendorf管中加入TE缓冲液， 充分溶解DNA， 保存备用。 0013 本发明相对于现有技术的有益效果为： 本发明解决了植物油中DNA模板难提取的 问题， 此操作方法简便， 快捷， 灵敏度高， 可适用于大部分植物油中DNA的提取， 提取时间短， 且纯度较高。 说明书 1/3 页 3 CN 110656107 A 3 具体实施方式 0014 下面对本发明的技术方案作进一步的说明， 但并不局限于此， 凡是对本发明技术 方案进行修正或等同替换， 而不脱离本发明技术方案的精神范围， 均应。

12、涵盖在本发明的保 护范围之中。 0015 本发明在提取过程中， 使用的仪器设备主要有： 高速冷冻离心机， 台式小型离心 机， Mini个人离心机(上机前处理仪器)； 漩涡振荡器； 电热鼓风干燥箱； 实时荧光定量PCR (上机仪器)； 化学PCR反应管； 高压灭菌锅； 生物安全柜； 冷冻冷藏冰箱； 移液器： 2.5 L、 10 L、 20 L(上机前处理仪器)、 100 L、 200 L、 1000 L； 0016 主要试剂有： 三氯甲烷； 95vol.乙醇； 正己烷； 异戊醇； 三氯甲烷； 乙二胺四乙酸 二钠盐(Na2EDTA)； 吐温-20； 异丙醇； 蛋白酶K(可选)， 冷冻状态下约20I。

13、U/mg； Hexadecyl- trimethyl-ammonium-bromide(CTAB)； 氯化钠； 二硫苏糖醇， 纯度97； 三羟甲基氨基甲 烷盐酸盐(Tris-HCl)； 70vol.乙醇溶液； TE缓冲溶液(pH8.0)， Tris-HCl0.01mol/L， Na2EDTA0.001mol/L， 用盐酸或者氢氧化钠调节pH； DNA裂解液(pH8.0)。 0017 具体实施方式一： 本实施方式记载的是一种深加工植物油脂中转基因成分提取方 法， 所述方法步骤如下： 0018 步骤一： 准备一支2mL Eppendorf管， 加入250 L正己烷和250 L DNA裂解液， 再加。

14、 入500 L转基因食用油脂， 充分混合后放入水浴锅中裂解1h， 期间混匀数次； 本发明采用小 剂量是为了油脂与溶剂接触、 反应更充分； 0019 步骤二： 裂解后向Eppendorf管中加入0.5mL预冷的三氯甲烷和异戊醇的混合液， 充分混合后， 冷冻离心， 将上清液收集到一个新的2mL Eppendorf管中； 0020 步骤三： 重复步骤二一次后执行步骤四； 0021 步骤四： 向装有上清液的2mL Eppendorf管中加预冷的异丙醇， 放置沉淀； 0022 步骤五： 沉淀后冷冻离心， 弃去上清液， 再加入乙醇进行洗涤， 冷冻离心， 弃去上清 液， 沉淀物在35烘箱中加热1h， 如未完。

15、全晾干， 继续复烘， 每10min观察一次直至完全晾 干； 0023 步骤六： 晾干后向Eppendorf管中加入TE缓冲液， 充分溶解DNA， 保存备用。 0024 具体实施方式二： 具体实施方式一所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取 方法， 步骤一中， 所述DNA裂解液的制备方法为： 称取4.00g8.00g CTAB， 16.00g18.00g NaCl， 4g6g吐温-20， 3g5g Tris-HCl， 1g2g EDTA， 1g2g二硫苏糖醇， 5 g10 g蛋白 酶K， 用170mL180mL水溶解后， 调节pH为8.0， 最终加水定容至200mL， 在121温度、 15ps。

16、i 压力下灭菌15min。 0025 具体实施方式三： 具体实施方式一所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取 方法， 步骤一中， 所述水浴温度为6080。 0026 具体实施方式四： 具体实施方式一所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取 方法， 步骤二中， 所述三氯甲烷和异戊醇的混合液提前08预冷， 三氯甲烷和异戊醇的体 积比为1530： 1。 0027 具体实施方式五： 具体实施方式一所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取 方法， 步骤二中， 所述冷冻温度为08， 离心时间为1030min， 转速为1200016000r/ min。 说明书 2/3 页 4 CN 110656107 A。

17、 4 0028 具体实施方式六： 具体实施方式一所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取 方法， 步骤四中， 所述异丙醇为-10-25预冷， 添加量为5001000 L。 0029 具体实施方式七： 具体实施方式一所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取 方法， 步骤四中， 所述沉淀时间为1h， 温度为-15-24。 0030 具体实施方式八： 具体实施方式一所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取 方法， 步骤五中， 所述冷冻离心条件为离心温度为08， 离心时间为1030min， 转速为 1200016000r/min。 0031 具体实施方式九： 具体实施方式一所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取 方法， 步骤五中， 所述乙醇浓度为5090vol.， 添加量为400600 L。 0032 具体实施方式十： 具体实施方式一所述的一种深加工植物油脂中转基因成分提取 方法， 步骤六中， TE缓冲液添加量为1560 L， 溶解后DNA保存温度为08。 说明书 3/3 页 5 CN 110656107 A 5 。