丝胶蛋白/纳米羟基磷灰石组织工程骨移植物及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910621701.X (22)申请日 2019.07.10 (71)申请人 赣南医学院第一附属医院 地址 341000 江西省赣州市赣南医学院第 一附属医院 申请人 深圳贝安基因生物科技有限公司 (72)发明人 何春耒张立兵张业顺 (74)专利代理机构 北京嘉科知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 11687 代理人 刘力 (51)Int.Cl. A61L 27/12(2006.01) A61L 27/22(2006.01) A61L 27/50(2006.01) A61。

2、L 27/56(2006.01) A61L 27/58(2006.01) A61F 2/28(2006.01) (54)发明名称 丝胶蛋白/纳米羟基磷灰石组织工程骨移植 物及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明属于组织工程学技术领域， 公开了一 种含骨形态发生蛋白-2的丝胶蛋白/纳米羟基磷 灰石组织工程骨移植物的构建(制备)方法及其 应用。 包括生长因子、 支架材料和可选的种子细 胞， 所述种子细胞粘附于所述支架材料上， 构成 了具有空间结构和生物活性的细胞载体复合物， 所述的支架材料是由丝胶蛋白(SS)、 纳米羟基磷 灰石(nHAP)构成的复合支架材料， 丝胶蛋白包裹 了含有人重组骨形态发。

3、生蛋白-2生长因子， 复合 支架材料上粘附有骨髓间充质干细胞。 本发明可 根据SS、 nHAP的比例来调节支架的孔径、 降解速 度及生物力学强度。 本发明所述构建的仿生人工 组织工程骨可以用于修复大段骨缺损的骨移植 物， 在动物实验中已经证明了能很好的修复大段 骨缺损。 权利要求书2页 说明书10页 附图2页 CN 110665055 A 2020.01.10 CN 110665055 A 1.一种含生长因子的组织工程骨移植物， 包括复合支架材料和生长在所述复合支架材 料上的生长因子， 其特征在于， 所述的复合支架材料包括通过交联剂交联的丝胶蛋白和纳 米羟基磷灰石的复合物。 2.根据权利要求1。

4、所述的骨移植物， 其中， 所述生长因子与复合支架材料构成具有三维 空间结构和生物活性的细胞载体复合物， 其中， 所述复合支架材料呈多孔状， 孔的形状主要 为圆形， 复合支架材料的孔与孔之间相互贯通使得所述复合支架材料形成连通空隙； 优选 所述生长因子由所述丝胶蛋白包裹； 和/或 以所述的复合支架材料的总重计， 丝胶蛋白的含量为20-80重量， 纳米羟基磷灰石的 重量为20-80重量， 丝胶蛋白与交联剂的重量比为0.01-100:1； 所述生长因子与丝胶蛋白 的重量比为0.01-1:1； 优选所述骨移植物还包括种子细胞， 所述种子细胞粘附在所述复合支架材料上， 优选 所述种子细胞为骨髓间充质干细。

5、胞， 更优选种子细胞密度为1106-5106个/ml； 优选所述骨髓间充质干细胞为经分离、 扩增经体外传代为第3代的骨髓间充质干细胞。 3.根据权利要求1或2所述的骨移植物， 其中， 所述纳米羟基磷灰石的孔隙直径为100- 250 m、 孔隙率为90以上， 并且孔隙为连通孔隙； 和/或 所述丝胶蛋白分子量为50kDa-250kDa； 和/或 所述的丝胶蛋白为从丝素缺失突变型家蚕185N-ds蚕种提取的天然结构未破坏的丝胶 蛋白； 和/或 所述交联剂为辣根过氧化物酶和H2O2的混合物、 戊二醛和京尼平中的一种或多种； 和/ 或 所述生长因子为rhBMP2。 4.一种制备权利要求1-3中任意一项所。

6、述的组织工程骨移植物的方法， 其特征在于， 该 方法包括： 配置含有生长因子和丝胶蛋白的溶液， 然后在交联剂存在下与纳米羟基磷灰石的悬浮 液混合得到混合溶液； 将混合溶液注入模型进行冷冻、 干燥。 5.根据权利要求4所述的方法， 其中， 所述的丝胶蛋白采用低温LiBr法制备， 优选包括如下步骤： 将蚕茧剪碎， 浸于LiBr水溶液中进行裂解， 然后将裂解的丝胶液进行纯化， 可选择地进 行对所述丝胶液进行提浓或降浓， 得到所述浓度的丝胶蛋白溶液； 优选裂解的条件包括： LiBr水溶液的浓度为4-12M， 温度为25-40， 时间为12-36h， 所 述蚕茧为185Nd-s蚕茧； 优选所述纯化的步骤。

7、包括： 在室温下， 用超纯水进行透析； 所述纳米羟基磷灰石采用溶胶-絮凝法制备， 优选包括如下步骤： 在碱性水溶液条件下， 可选地在分散剂存在下， 将硝酸钙与磷酸铵接触沉淀， 将得到的 沉淀物进行干燥， 烧结得到100nm以下粒径的纳米羟基磷灰石； 优选通过氨水调节溶液的pH值为8-13， 干燥的条件包括温度为80-120， 烧结的条件 包括温度为600-800， 时间为2-3小时。 6.根据权利要求4或5所述的方法， 其中， 配置含有生长因子和丝胶蛋白的溶液的步骤 包括： 权利要求书 1/2 页 2 CN 110665055 A 2 将生长因子与丝胶蛋白溶液混合， 其中， 生长因子与丝胶蛋白。

8、溶液的用量比为5-10 g 生长因子： ml丝胶蛋白溶液； 优选丝胶蛋白溶液的浓度为1-10重量。 7.根据权利要求4或5所述的方法， 其中， 交联剂源为辣根过氧化物酶和双氧水的混合 物、 戊二醛和京尼平中的一种或多种； 优选所述的交联剂源为辣根过氧化物酶和双氧水的 混合物， 更优选所述辣根过氧化物酶与双氧水的用量体积比为1-10:1； 和/或 丝胶蛋白溶液与交联剂的体积比为100:1-50。 8.根据权利要求4或5所述的方法， 其中， 该方法还包括： 冷冻、 干燥结束后进行负压抽 吸负载种子细胞： 优选包括如下步骤： (1)将干燥材料进行预湿培养得到预湿支架； (2)将种子细胞均匀加入预湿支。

9、架， 然后置于真空负压抽吸器中抽吸保持负压培养。 9.一种制备权利要求1-3中任意一项所述的组织工程骨移植物的方法， 其中， 纳米羟基 磷灰石是采用溶胶-絮凝法制备， 丝胶蛋白溶液采用LiBr方法提取， 细胞支架载体复合物采 用超声混匀后注入磨具后低温冻干制备， 具体包括： 复合人工骨制备包括以下步骤： A、 nHAP人工骨材料粉末制备 (1)将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成， 加入氨水， 调整溶液的pH值为8-13， 可 选地添加分散剂， 调整搅拌器速率和搅拌时间， 使其沉淀完全， 然后经洗涤、 过滤； (2)将沉淀物在80-120干燥， 在600-800温度下烧结2-3小时， 得到粉末。

10、粒径小于 100nm与人体骨组织成分相似的纳米级粉末； B、 丝胶蛋白溶液的制备(根据需要制备不同的浓度) 将185Nd-s蚕茧剪碎， 浸于6M LiBr水溶液中， 35下裂解24h， 然后将丝胶液用超纯水 在室温透析两天， 得到丝胶蛋白溶液； 其负载rhBMP-2的丝胶蛋白缓释溶液合成步骤如下： 取丝胶蛋白浓度约3重量的丝胶蛋白溶液， 将生长因子BMP-2与上述3重量的丝胶 蛋白溶液按照1:50(质量比)混合， 配置浓度为5 g/ml rhBMP-2的丝胶蛋白溶液； C.丝胶蛋白/羟基磷灰石为载体的缓释体系复合支架材料的制备 将载有rhBMP-2的丝胶蛋白溶液混入nHAP混合物悬浮液中， 然。

11、后通过冷冻干燥制备缓 释rhBMP-2的复合支架； D.复合支架负载种子细胞， 采用负压抽吸制备， 其步骤如下： (1)rhBMP-2的复合支架置入6孔板中， 含10重量胎牛血清的DMEM培养液预湿24小时， 37、 5体积CO2培养箱培养24h， (2)把骨髓间充质干细胞均匀加入上述预湿处理的支架中， 然后置于真空负压抽吸器 中抽吸保持负压， 放入37孵箱中保持10分钟后， 放入37、 5CO2培养箱中贴附2小时后 缓慢加入1.5ml DMEM培养液于37、 5体积CO2培养箱继续培养2-3d换液一次。 10.权利要求1-3中任意一项所述的组织工程骨移植物和权利要求4-9中任意一项制备 方法。

12、制备得到的组织工程骨移植物作为仿生人工骨在骨科中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110665055 A 3 丝胶蛋白/纳米羟基磷灰石组织工程骨移植物及其制备方法 和应用 技术领域 0001 本发明涉及骨缺损的一种修复生物可降解活性材料， 属于组织工程学技术领域， 具体涉及一种仿生人工骨的构建及其在骨科中的应用， 更具体涉及丝胶蛋白/纳米羟基磷 灰石组织工程骨移植物及其制备方法和应用。 背景技术 0002 由于创伤、 肿瘤、 先天性畸形、 感染、 病理等因素造成的骨组织缺损是临床面临的 难题之一， 植骨术是解决这一问题的主要方法。 植骨术主要分为自体来源植骨术、 同种异体 或异种植骨。

13、术。 这两种方法的弊端或局限性主要有供源不足、 供区损伤和取骨后的并发症、 移植排斥反应等。 近年来随着组织工程学科的发展， 利用组织工程学原理和方法构建的组 织工程骨移植可以改进上述弊端， 组织工程为骨缺损的修复带来美好的前景。 骨组织工程 研究主要有4方面： 支架材料、 种子细胞、 细胞因子、 临床使用。 0003 组织工程化骨作为骨修复材料的替代物可以避免生物源修复材料的缺陷。 将生物 相容性好的有骨传导能力的并在体内可生物降解的支架材料与具有强大诱骨活性的细胞 因子结合可以使骨缺损修复材料拥有骨传导和诱导的双重特性， 在迅速成骨的同时植入材 料逐渐降解， 为临床骨缺损的修复提供了全新的。

14、思路和方法。 0004 骨髓间充质干细胞主要存在于骨髓中， 现证实MSCs至少可向9种以上成熟细胞分 化， 其中包括成骨细胞及内皮细胞， 分化多向性提示它可能成为细胞治疗和组织工程人工 骨构建的理想种子细胞， 因此， 骨髓MSCs成为骨组织工程理想的种子细胞。 0005 骨形态发生蛋白的安全性和高效诱导成骨活性被越来越多的实验所证实， BMP-2 被认为具有最高的生物活性， 是最具有前途的骨诱导蛋白， 能促使原位和异位成骨， 被认为 是最具有前途的骨诱导物质， 美国食品和药物管理局2004年正式批准rhBMP-2用于临床治 疗长骨骨折， 但由于BMP-2在体内含量极微， 半衰期短， 需要反复给。

15、药， 使得对BMP-2的进一 步研究和应用受到局限。 因此， 生物材料持续可控释放生长因子的能力对于其在临床治疗 中的有效性具有重要意义。 0006 羟基磷灰石(HA)是人体和动物骨骼的主要无机矿物成分， 人们对HA做了广泛的研 究， 通过改进工艺技术已能制备出不同形状、 孔隙率和降解率的HA产品， 已研制出商业化生 产的HA人工骨， 并已经美国FDA认证， 获准应用于临床。 羟基磷灰石的孔径达到纳米级时将 表现出一系列的独特性能， nHAP复合材料比相应的微米复合材料具有更好的生物学性能； 同时优化材料的组成、 结构和工艺将可能得到力学性能与天然骨更为匹配的骨修复材料。 0007 近年来在骨。

16、组织工程中， 有关纳米羟基磷灰石(nHAP)材料学的研究在国际上得到 迅速发展， 完整的科学体系正在形成。 nHAP具有与人体骨组织相似的无机成分(钙、 磷)能制 备出不同形状、 孔隙率和降解率的产品， 羟基磷灰石纳米粒子引入到非亲水性的可生降解 聚酯基体材料中去， 就有可能得到能被降解， 力学性能较好， 骨诱导性能优越的新型骨修复 材料。 说明书 1/10 页 4 CN 110665055 A 4 0008 但是单一人工材料一般难以满足骨组织工程用细胞外支架材料的要求， 还有nHAP 的难降解性、 脆性制约了它在临床中的使用。 发明内容 0009 本发明的目的在于克服现有的骨组织工程用细胞外。

17、支架材料中nHAP的难降解性、 脆性， 以及生物材料在体内含量极微， 半衰期短， 需要反复给药的缺陷， 提供一种能够可持 续释放生物材料的组织工程骨移植物及其制备方法和应用。 0010 生长因子例如骨形态发生蛋白-2属于 -转化生长因子(Transforming growth factor- ， TGF- )超家族成员之一， 在胚胎发生和发育， 组织与细胞的增殖分化等方面起着 重要作用， BMP-2的高效诱导成骨活性已被越来越多的实验证实， 天然BMP-2在体内含量极 微， 半衰期短， 难以在体内维持持续的促成骨效应。 在细胞与细胞外基质之间的信息传递方 面， 生长因子起着重要的作用。 重组生。

18、长因子的控释成为影响生物材料能否有效应用于组 织再生的重要因素之一。 骨形态蛋白2(BMP-2)已被广泛应用于骨缺损的科学研究和临床治 疗。 用于临治疗的BMP-2应具有可控持续释放的能力， 以指导细胞的增殖、 成骨分化和骨的 成型。 因此， 生物材料持续可控释放生长因子的能力对于其在临床治疗中的有效性具有重 要意义。 纳米材料在传递靶向药物、 调控细胞分化和促进骨组织再生方面具有显著地优势。 相关研究表明由胶团和树枝状大分子组成的聚合物纳米颗粒和磷酸钙、 生物玻璃等无机纳 米颗粒作为生物活性药物的加载体系已经在肌肉、 骨骼等组织工程中得到应用。 但是单一 人工材料一般难以满足骨组织工程用细胞。

19、外支架材料的要求， 还有nHAP的难降解性、 脆性 制约了它在临床中的使用。 0011 丝胶蛋白(SS)主要来源于娟丝类昆虫， 丝胶蛋白由蚕的中部丝腺分泌， 是包裹在 丝素纤维表层的一种天然大分子粘性蛋白， 但丝胶蛋白长期以来在脱胶过程中被当作废物 丢弃， 降解过程中需要大量的氧， 丝胶的直接排放造成环境的污染。 通过对天然结构未破坏 的纯丝胶蛋白水凝胶研究， 发现丝胶蛋白具有良好的生物相容性、 粘附性、 高孔隙率和维持 药物释放等特性， 由此本发明首次采用丝胶蛋白生物材料作为新型的组织工程天然支架材 料及药物缓释载体。 0012 本发明将丝胶蛋白与纳米羟基磷灰石复合(根据骨修复部位对生物力学。

20、的要求可 以调整复合比例)制备复多孔支架材料， 以其为载体， 加载并控释生长因子例如骨形态蛋白 2(BMP-2)， 检测BMP-2的加载和释放情况， 并对其成骨诱导性进行了研究， 用体外构建仿生 人工骨， 经实验证实细胞复合前后可高效、 持续释放BMP-2并促进其增殖分化； 优选实施方 式中， 种子细胞在复合支架中扫描电镜见细胞贴附生长良好， 复合支架材料可缓慢、 持续释 放BMP-2， 时间长达42天。 用上述方法构建的仿生人工骨植入桡骨缺损模型可以很好的修复 桡骨节段性骨缺损。 通过实验证实缺损模型12周时骨折完全愈合， 皮质骨连续， 髓腔再通。 本研究结果表明， 利用生物材料持续可控释放。

21、生长因子的能力对于其在临床治疗中的有效 性具有重要意义， 其主要是通过软骨化骨的方式诱导成骨， 是治疗节段性骨缺损的理想方 法。 0013 根据本发明的第一方面， 本发明提供一种含生长因子的组织工程骨移植物， 包括 复合支架材料和生长在所述复合支架材料上的生长因子， 所述的复合支架材料包括通过交 联剂交联的丝胶蛋白和纳米羟基磷灰石的复合物。 说明书 2/10 页 5 CN 110665055 A 5 0014 根据本发明的第二方面， 本发明提供一种制备本发明所述的组织工程骨移植物的 方法， 该方法包括： 配置含有生长因子和丝胶蛋白的溶液， 然后在交联剂存在下与纳米羟基 磷灰石的悬浮液混合得到混。

22、合溶液； 将混合溶液注入模型进行冷冻、 干燥。 0015 根据本发明的第三方面， 提供一种制备组织工程骨移植物的方法， 其中， 纳米羟基 磷灰石是采用溶胶-絮凝法制备， 丝胶蛋白溶液采用LiBr方法提取， 细胞支架载体复合物采 用超声混匀后注入磨具后低温冻干制备， 具体包括： 0016 复合人工骨制备包括以下步骤： 0017 A、 nHAP人工骨材料粉末制备 0018 (1)将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成， 加入氨水， 调整溶液的pH值为8- 13， 可选地添加分散剂， 调整搅拌器速率和搅拌时间， 使其沉淀完全， 然后经洗涤、 过滤； 0019 (2)将沉淀物在80-120干燥， 在60。

23、0-800温度下烧结2-3小时， 得到粉末粒径小 于100nm与人体骨组织成分相似的纳米级粉末； 0020 B、 丝胶蛋白溶液的制备(根据需要可制备不同的浓度) 0021 将185Nd-s蚕茧剪碎， 浸于6M LiBr水溶液中， 35下裂解24h， 然后将丝胶液用超 纯水在室温透析两天， 得到丝胶蛋白溶液； 0022 其负载rhBMP-2的丝胶蛋白缓释溶液合成步骤如下： 0023 取丝胶蛋白浓度约3重量的丝胶蛋白溶液， 将生长因子BMP-2与上述3重量的 丝胶蛋白溶液按照1:50(质量比)混合， 配置浓度为5 g/ml rhBMP-2的丝胶蛋白溶液； 0024 C.丝胶蛋白/羟基磷灰石为载体的。

24、缓释体系复合支架材料的制备 0025 将载有rhBMP-2的丝胶蛋白溶液混入nHAP混合物悬浮液中， 然后通过冷冻干燥制 备缓释rhBMP-2的复合支架； 0026 D.复合支架负载种子细胞， 采用负压抽吸制备， 其步骤如下： 0027 (1)rhBMP-2的复合支架置入6孔板中， 含10重量胎牛血清的DMEM培养液预湿24 小时， 37、 5体积CO2培养箱培养24h， 0028 (2)把骨髓间充质干细胞均匀加入上述预湿处理的支架中， 然后置于真空负压抽 吸器中抽吸保持负压， 放入37孵箱中保持10分钟后， 放入37、 5CO2培养箱中贴附2小 时后缓慢加入1.5ml DMEM培养液于37、。

25、 5体积CO2培养箱继续培养2-3d换液一次。 0029 根据本发明的第四方面， 本发明提供一种本发明所述的组织工程骨移植物和本发 明的制备方法制备得到的组织工程骨移植物作为仿生人工骨在骨科中的应用。 0030 本发明通过对天然结构未破坏的纯丝胶蛋白水凝胶研究， 发现丝胶蛋白具有良好 的生物相容性、 粘附性、 高孔隙率和维持药物释放等特性， 由此本发明首次采用丝胶蛋白生 物材料作为新型的组织工程天然支架材料及药物缓释载体， 采用本发明的组织工程骨移植 物作为仿生人工骨在骨科中应用时， 生长因子能够持续可控释放， 由此克服了BMP-2直接应 用的不足。 0031 本发明的生长因子如rhBMP-2。

26、采用丝胶蛋白作为载体缓释来解决 0032 rhBMP-2释放的问题， 由此可以最大限度的发挥rhBMP-2的作用时间， 本发明所述 构建的仿生人工组织工程骨可以用于修复大段骨缺损的骨移植物， 在动物实验中已经证明 了能很好的修复大段骨缺损， 使丝胶蛋白组织工程骨的临床应用成为可能。 0033 本发明利用生物材料丝胶蛋白作为载体缓释来解决BMP-2释放的问题， 经过试验 说明书 3/10 页 6 CN 110665055 A 6 证实被认为是有效的手段， 其应用于组织工程骨治疗骨缺损的应用， 用于解决临床上因骨 缺损及骨创伤引起的骨修复问题。 附图说明 0034 图1为本发明实施例组织工程骨移植。

27、物结构示意图； 0035 图2为本发明实施例nHAP粉末人工骨扫描电镜下(200kv100000)； 0036 图3为本发明实施例复合后人工骨扫描电镜下观察(5kv300)(SS/HA质量比1： 1)； 0037 图4为本发明实施例复合后人工骨扫描电镜下观察(5kv100)(SS/nHAP质量比4： 6)； 0038 图5为本发明实施例A组12周X线； 0039 附图标记说明 0040 1： 组织工程骨移植物； 0041 2： 丝胶蛋白； 0042 3： 生长因子； 0043 4： 种子细胞； 0044 5： 纳米羟基磷灰石。 具体实施方式 0045 以下通过实施例来描述本发明， 应该指出的是。

28、， 所列举的实施例不应理解对发明 的限制。 0046 如图1所示， 本发明提供一种含生长因子的组织工程骨移植物1， 包括复合支架材 料和生长在所述复合支架材料上的生长因子3， 所述的复合支架材料包括通过交联剂交联 的丝胶蛋白2和纳米羟基磷灰石5的复合物。 0047 根据本发明的骨移植物， 其中， 如图1所示， 所述生长因子与复合支架材料构成具 有三维空间结构和生物活性的细胞载体复合物， 其中， 所述复合支架材料呈多孔状， 孔的形 状主要为圆形， 复合支架材料的孔与孔之间相互贯通使得所述复合支架材料形成连通空 隙。 0048 根据本发明的骨移植物， 为了使生长因子能够进行更好的持续可控释放， 优。

29、选所 述生长因子生长在丝胶蛋白上。 0049 根据本发明的骨移植物， 优选以所述的复合支架材料的总重计， 丝胶蛋白的含量 为20-80重量， 纳米羟基磷灰石的重量为20-80重量。 0050 根据本发明的骨移植物， 优选所述交联剂为辣根过氧化物酶与H2O2的混合物、 戊二 醛和京尼平中的一种或多种， 由于戊二醛与京尼平的体内毒性， 优选所述交联剂为辣根过 氧化物酶与H2O2的混合物。 0051 根据本方面， 所述辣根过氧化物酶与H2O2的质量比无特殊要求， 例如为0.1-1:1。 0052 根据本发明的骨移植物， 优选丝胶蛋白与交联剂的重量比为0.01-100:1。 0053 根据本发明的骨移。

30、植物， 优选所述生长因子与丝胶蛋白的重量比为0.01-1:1。 0054 按照前述比例构建本发明的骨移植物， 不仅生长因子能够进行更好的持续可控释 说明书 4/10 页 7 CN 110665055 A 7 放， 而且能够改善支架材料的难降解性和脆性， 提高生物材料在体内的含量和延长其半衰 期。 0055 根据本发明的一种优选实施方式， 优选所述骨移植物还包括种子细胞4， 所述种子 细胞4粘附在所述复合支架材料上， 更优选所述种子细胞为骨髓间充质干细胞。 0056 根据本发明， 所述种子细胞的类别无特殊要求， 可以为本领域的常规选择， 根据本 发明， 优选所述骨髓间充质干细胞为经分离、 扩增经。

31、体外传代为第3代的骨髓间充质干细 胞。 0057 根据本发明， 更优选所述种子细胞密度为1106-5106个/ml。 0058 根据本发明的一种优选实施方式， 所述纳米羟基磷灰石的孔隙直径为100250 m、 孔隙率为90以上， 并且孔隙为连通孔隙。 0059 根据本发明的一种优选实施方式， 所述丝胶蛋白分子量为50kDa250kDa。 0060 根据本发明的一种优选实施方式， 所述的丝胶蛋白为从丝素缺失突变型家蚕 185N-ds蚕种提取的天然结构未破坏的丝胶蛋白。 0061 根据本发明的一种优选实施方式， 所述交联剂为戊二醛、 京尼平、 辣根过氧化物酶 和H2O2的混合物的一种， 优选所述交。

32、联剂为辣根过氧化物酶和H2O2的混合物。 0062 根据本发明的一种优选实施方式， 所述生长因子可以为本领域的常规选择， 例如 所述生长因子为BMP2， 优选为rhBMP2。 本发明对此无特殊要求， 在此不详细赘述。 0063 按照本发明的前述组成和结构的骨移植物， 作为仿生人工骨在骨科中应用时， 生 长因子能够持续可控释放。 对其制备方法无特殊要求， 只要具有前述组成和结构均可实现 本发明的目的。 0064 根据本发明的优选实施方式， 本发明所述的组织工程骨移植物， 包括由骨髓间充 质干细胞、 含rhBMP-2生长因子、 纳米羟基磷灰石和丝胶蛋白构建的具有三维空间结构及生 物活性的仿生人工骨。

33、。 0065 本发明的构建方法， 可以包括： 0066 采用溶胶-絮凝法制备纳米羟基磷灰石(nHAP)； 0067 采用低温LiBr法制备提取结构未破坏的丝胶蛋白溶液； 0068 采用密度梯度离心法联合贴壁法分离、 培养、 扩增骨髓间充质干细胞； 0069 采用负压抽吸法构建细胞支架载体复合物仿生人工骨。 0070 根据本发明的一种优选实施方式， 提供一种制备本发明所述的组织工程骨移植物 的方法， 该方法包括： 配置含有生长因子和丝胶蛋白的溶液， 然后在交联剂存在下与纳米羟 基磷灰石的悬浮液混合得到混合溶液； 将混合溶液注入模型进行冷冻、 干燥。 0071 根据本发明的方法， 优选所述的丝胶蛋。

34、白采用低温LiBr法制备， 更优选包括如下 步骤： 将蚕茧剪碎， 浸于LiBr水溶液中进行裂解， 然后将裂解的丝胶液进行纯化， 可选择地 进行对所述丝胶液进行提浓或降浓， 得到所述浓度的丝胶蛋白溶液。 0072 根据本发明的一种优选实施方式， 优选裂解的条件包括： LiBr水溶液的浓度为4- 12M， 和/或温度为25-40， 和/或， 时间为12-36h。 0073 根据本发明的一种优选实施方式， 优选所述蚕茧为185Nd-s蚕茧。 0074 本发明中， 优选所述纯化的步骤包括： 在室温下， 用超纯水进行透析。 0075 根据本发明， 优选所述纳米羟基磷灰石采用溶胶-絮凝法制备， 更优选包括。

35、如下步 说明书 5/10 页 8 CN 110665055 A 8 骤： 在碱性水溶液条件下， 在分散剂存在下， 将硝酸钙与磷酸铵接触沉淀， 将得到的沉淀物 进行干燥， 烧结得到100nm以下粒径的纳米羟基磷灰石。 0076 根据本发明， 优选通过氨水调节溶液的pH值为8-13， 更优选干燥的条件包括温度 为80-120， 和/或烧结的条件包括温度为600-800， 和/或时间为2-3小时。 0077 根据本发明， 所述分散剂可以为常规选择， 本发明对此无特殊要求， 在此不进行详 细说明。 0078 根据本发明， 其中优选配置含有生长因子和丝胶蛋白的溶液的步骤包括： 0079 将生长因子与丝胶。

36、蛋白溶液混合， 其中， 优选生长因子与丝胶蛋白溶液的用量比 为5-10 g生长因子： ml丝胶蛋白溶液； 更优选丝胶蛋白溶液的浓度为1-10重量。 0080 根据本发明， 其中， 优选交联剂源为辣根过氧化物酶和双氧水的混合物、 戊二醛和 京尼平中的一种或多种； 优选所述的交联剂源为辣根过氧化物酶和双氧水的混合物， 更优 选所述辣根过氧化物酶与双氧水的用量体积比为1-10:1。 0081 根据本发明， 其中， 优选丝胶蛋白溶液与交联剂的体积比为100:1-50。 0082 根据本发明， 其中， 优选该方法还包括： 冷冻、 干燥结束后进行负压抽吸负载种子 细胞： 优选包括如下步骤： 0083 (1。

37、)将干燥材料进行预湿培养得到预湿支架； 0084 (2)将种子细胞均匀加入预湿支架， 然后置于真空负压抽吸器中抽吸保持负压培 养。 0085 根据本发明， 预湿和真空负压抽吸均可以参照现有技术的步骤进行， 本发明对此 无特殊要求， 例如可以按照如下步骤进行， 但不能因此本发明仅适用于下述步骤： (1) rhBMP-2的复合支架置入6孔板中， 含10重量胎牛血清的DMEM培养液预湿24小时， 37、 5 体积CO2培养箱培养24h， 0086 (2)把骨髓间充质干细胞均匀加入上述预湿处理的支架中， 然后置于真空负压抽 吸器中抽吸保持负压， 放入37孵箱中保持10分钟后， 放入37、 5CO2培养。

38、箱中贴附2小 时后缓慢加入1.5ml DMEM培养液于37、 5体积CO2培养箱继续培养2-3d换液一次。 0087 根据本发明的一种优选的实施方式， 本发明提供一种制备本发明所述的组织工程 骨移植物的方法， 其中， 纳米羟基磷灰石是采用溶胶-絮凝法制备， 丝胶蛋白溶液采用LiBr 方法提取， 细胞支架载体复合物采用超声混匀后注入磨具后低温冻干制备， 具体包括： 0088 复合人工骨制备包括以下步骤： 0089 A、 nHAP人工骨材料粉末制备 0090 (1)将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成， 加入氨水， 调整溶液的pH值为8- 13， 添加分散剂， 调整搅拌器速率和搅拌时间， 使其沉淀。

39、完全， 然后经洗涤、 过滤； 0091 (2)将沉淀物在80-120干燥， 在600-800温度下烧结2-3小时， 得到粉末粒径小 于100nm与人体骨组织成分相似的纳米级粉末； 0092 B、 丝胶蛋白溶液的制备(根据需要可制备不同的浓度) 0093 将185Nd-s蚕茧剪碎， 浸于6M LiBr水溶液中， 35下裂解24h， 然后将丝胶液用超 纯水在室温透析两天， 得到丝胶蛋白溶液； 0094 其负载rhBMP-2的丝胶蛋白缓释溶液合成步骤如下： 0095 取丝胶蛋白浓度约3重量的丝胶蛋白溶液， 将生长因子BMP-2与上述3重量的 说明书 6/10 页 9 CN 110665055 A 9。

40、 丝胶蛋白溶液按照1:50(质量比)混合， 配置浓度为5 g/ml rhBMP-2的丝胶蛋白溶液； 0096 C.丝胶蛋白/羟基磷灰石为载体的缓释体系复合支架材料的制备 0097 将载有rhBMP-2的丝胶蛋白溶液混入nHAP混合物悬浮液中， 然后通过冷冻干燥制 备缓释rhBMP-2的复合支架； 0098 D.复合支架负载种子细胞， 采用负压抽吸制备， 其步骤如下： 0099 (1)rhBMP-2的复合支架置入6孔板中， 含10重量胎牛血清的DMEM培养液预湿24 小时， 37、 5体积CO2培养箱培养24h， 0100 (2)把骨髓间充质干细胞均匀加入上述预湿处理的支架中， 然后置于真空负压。

41、抽 吸器中抽吸保持负压， 放入37孵箱中保持10分钟后， 放入37、 5CO2培养箱中贴附2小 时后缓慢加入1.5ml DMEM培养液于37、 5体积CO2培养箱继续培养2-3d换液一次。 0101 本发明采用密度梯度离心联合贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞， 大大提高了分 离的成功率。 0102 按照本发明前述的制备方法制备的组织工程骨移植物1， 包括含生长因子3的复合 支架材料2和种子细胞4， 所述种子细胞4粘附于所述支架材料1上， 构成了具有三维空间结 构和生物活性的细胞载体复合物， 所述的支架材料2是采用成型复合的丝胶蛋白/纳米羟基 磷灰石复合支架， 复合支架含有生长因子， 其上粘附有骨。

42、髓间充质干细胞。 0103 按照本发明前述的制备方法制备的组织工程骨移植物， 所述纳米羟基磷灰石 (nano-hydroxyapatite， nHAP)是孔隙直径为100250 m、 孔隙率为90以上的多孔活性材 料， 并且所得孔隙为连通孔隙。 0104 按照本发明前述的制备方法制备的组织工程骨移植物， 优选所述的丝胶蛋白 (sericin silk， SS)溶液是丝胶蛋白从丝素缺失突变型家蚕蚕185N-ds品种提取。 0105 按照本发明前述的制备方法制备的组织工程骨移植物， 通过上述结构使得复合支 架能缓慢释放生长因子人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2) 0106 按照本发明前述的制。

43、备方法， 优选所述的种子细胞是取自于骨髓， 经分离、 扩增经 体外传代为第3代的骨髓间充质干细胞， 细胞密度为11065106个/ml。 0107 根据本发明， 优选所述的丝胶蛋白溶液是包裹了含一定浓度的rhBMP-2生长因子 的混合溶液。 0108 根据本发明， 优选所述的rhBMP-2的配置浓度为5 g/ml。 0109 根据本发明， 能够缓慢、 持续、 高效释放细胞因子骨形态发生蛋白-2。 0110 根据本发明， 采用LiBr方法获得的丝胶蛋白在交联剂存的情况下， 成胶性好， 能形 成水凝胶的结构未破坏的丝胶蛋白溶液。 0111 本发明提供了本发明所述的组织工程骨移植物和按照本发明的制备。

44、方法制备得 到的组织工程骨移植物作为仿生人工骨在骨科中的应用。 0112 以下通过实施例对本发明进行详细说明： 0113 本发明的实施例按照如下步骤构建： 0114 nHAP人工骨材料粉末制备 0115 (1)将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成(硝酸钙与磷酸铵的摩尔比为1:1)， 加入氨水， 调整溶液的pH值为10， 调整搅拌器速率和搅拌时间， 使其沉淀完全， 然后经洗涤、 过滤； 说明书 7/10 页 10 CN 110665055 A 10 0116 (2)将沉淀物在100干燥， 在700温度下烧结2小时， 得到粉末粒径小于100nm与 人体骨组织成分相似的纳米级粉末(扫描电镜下观察(5。

45、kv300)， 见图2)； 0117 所述的丝胶蛋白通过下列的步骤构建： 0118 1)称取蚕茧(185 Nd-s)600mg置于试剂瓶中； 0119 2)加入24ml 6M LiBr溶液； 0120 3)35水浴24h； 0121 4)4000rpm5min初步去除不溶性物质； 0122 5)加入6ml Tris-HCl(1M pH 9.0)； 0123 6)将上述溶液转入到预处理好的透析袋(NWCO 3000Da)中； 0124 7)透析袋放置含有超纯水的试剂瓶中； 0125 8)置于搅拌器上慢速搅拌透析； 0126 9)每6h换水一次； 0127 10)透析48h； 0128 11)采用。

46、PEG 6000水溶液浓缩丝胶液直到达到需要的浓度； 0129 所述的仿生人工骨通过以下步骤构建： 0130 (1)取上述制备浓度约3重量(浓度可根据制备人工骨的生物力学要求调整)的 丝胶蛋白溶液， 为了生产载有rhBMP-2的丝胶溶液， 将生长因子以1:50(质量比)的rhBMP-2 与SS上述3重量的丝胶蛋白溶液(w/w)混合， 配置浓度为5 g/ml rhBMP-2的丝胶蛋白溶 液。 0131 (2)将纳米羟基磷灰石与上述制备的含rhBMP-2生长因子的3丝胶蛋白溶液以一 定的质量比例混合(根据应用生物力学的需要调整SS、 nHAP的比例)， 然后放入超声波振荡 仪中充分搅拌， 加入HP。

47、R/H2O2(HRP5mg/ml， H2O2万分之3)按100:3:3的体积使其混合均匀。 将 混匀的溶液用注射注放入模型中， 立即放入-20冰箱中冷冻24小时， 分别制备的圆柱形或 方形支架材料， 随后用真空冷冻干燥机干燥72h， 得到含rhBMP-2的丝胶蛋白/羟基磷灰石复 合支架材料， 人工骨材料采用Co60辐照灭菌备用。 0132 人工骨材料负载种子细胞， 采用负压抽吸制备， 其步骤如下： 0133 (1)rhBMP-2的复合支架置入6孔板中， 含10重量胎牛血清的DMEM培养液预湿24 小时， 37、 5体积CO2培养箱培养24h， 0134 (2)把骨髓间充质干细胞均匀加入上述预湿。

48、处理的支架中(以SS/nHAP质量比1:1 为本次的实验样品， 可以依据情况调整)， 然后置于真空负压抽吸器中抽吸保持负压， 放入 37孵箱中保持10分钟后， 放入37、 5CO2培养箱中贴附2小时后缓慢加入1.5ml DMEM培 养液于37、 5体积CO2培养箱继续培养2-3d换液一次。 0135 图1为本发明实施例组织工程骨移植物结构示意图， 图1说明； 本发明的一种组织 工程骨移植物包括支架材料、 生长因子和种子细胞， 构成了具有孔隙率的三维空间结构和 生物活性的细胞载体复合物。 0136 图2为本发明实施例制备的纯nHAP粉末人工骨扫描电镜下(200kv100000)， 图2 看出本发。

49、明制备出尺寸均一、 水分散性良好的纳米羟基磷灰石颗粒。 0137 图3为本发明实施例复合后人工骨扫描电镜下观察(5kv300)(SS/nHAP质量比1： 1)， 图3说明丝胶蛋白/羟基磷灰石复合支架具有良好的多孔结构， 羟基磷灰石纳米颗粒均 说明书 8/10 页 11 CN 110665055 A 11 匀分布在丝胶蛋白支架中。 0138 图4为本发明实施例复合后人工骨扫描电镜下观察(5kv100)(SS/nHAP质量比 4： 6)， 图4说明丝胶蛋白/羟基磷灰石复合支架具有良好的多孔结构， 羟基磷灰石纳米颗粒 均匀分布在丝胶蛋白支架中， 且随着nHA P含量的增大， 孔隙变小。 0139 图。

50、5为本发明实施例A组12周X线， 图5说明12周时植入材料降解完毕， 髓腔完全再 通， 骨塑形完全， 骨缺损修复。 0140 仿生人工骨在动物骨缺损修中的应用： 0141 1、 动物实验手术操作(新西兰大白兔) 0142 1.选用盐酸氯胺酮注射液20mg/kg， 由耳缘静脉注入麻醉。 0143 2.右侧前臂常规脱毛， 消毒， 手术铺巾。 0144 3.取前臂桡侧中段作2cm纵形切口， 暴露桡骨干， 在距桡骨近端2.5cm处用线锯连 同骨膜一起锯断桡骨做成2cm的骨缺损动物模型。 0145 4.生理盐水冲洗伤口后按不同的组别分别植入A组:rhBMP2/SS/nHAp+BMSCs(本发 明的骨移植。