肌肉靶向的微环DNA基因治疗.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910825998.1 (22)申请日 2019.09.03 (71)申请人 深圳新诺微环生物科技有限公司 地址 518109 广东省深圳市龙华新区龙华 街道清祥路1号宝能科技园6栋B座20 层 (72)发明人 谌平谢亦武陈志英 (74)专利代理机构 北京市诚辉律师事务所 11430 代理人 范盈 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/57(2006.01) C12N 15/12(2006.0。

2、1) A61K 48/00(2006.01) A61K 38/37(2006.01) A61K 38/48(2006.01) A61P 43/00(2006.01) A61P 7/04(2006.01) (54)发明名称 肌肉靶向的微环DNA基因治疗 (57)摘要 本申请涉及肌肉靶向的微环DNA基因治疗。 具体涉及一种用于在肌肉中长期高效表达治疗 性基因产物的微环DNA载体。 所述微环DNA载体配 合肌肉靶向投递技术， 可以在肌肉中长期高效表 达治疗性基因产物， 从而克服蛋白类药物半衰期 有限、 疗效无法持续的缺陷。 所述微环DNA载体可 以用于治疗常见的遗传性基因缺陷病或慢性疾 病， 具有安。

3、全、 有效、 低成本的优点。 权利要求书2页 说明书13页 序列表22页 附图3页 CN 110684798 A 2020.01.14 CN 110684798 A 1.一种表达治疗性基因产物的重组基因载体， 其中， 所述重组基因载体包含所述基因 产物的编码基因或目的基因； 优选的， 所述基因产物选自蛋白质， 多肽或核酸片段； 更优选的， 所述蛋白质或多肽选 自抗体、 功能性蛋白、 细胞因子、 酶或激素， 或者所述核酸片段选自基因片段， mRNA， siRNA， shRNA或miRNA； 优选的， 所述重组基因载体选自非病毒载体或病毒载体； 更优选的， 所述非病毒载体选 自标准质粒或其它环状表。

4、达盒子， 或者所述病毒载体选自逆转录病毒载体， 慢病毒载体， 腺 病毒载体和腺相关病毒载体。 2.如权利要求1所述重组基因载体， 其中， 所述功能性蛋白选自凝血因子IX(FIX)、 凝血 因子VIII(FVIII)或它们的变异体； 优选的， FIX选自全长的、 FIX-Padua突变体或FIX-KLW突 变体； 优选的， FVIII选自全长的、 BDD-FVIII突变体或BDD-FVIII-FD突变体； 所述非病毒载 体选自微环DNA载体， 或者所述病毒载体选自腺相关病毒载体。 3.如权利要求1或2所述重组基因载体， 其中， 所述FIX的氨基酸序列如SEQ ID NO： 3所 示， 所述FIX。

5、-Padua的氨基酸序列如SEQ ID NO： 4所示， 所述FIX-KLW的氨基酸序列如SEQ ID NO： 5所示， 所述BDD-FVIII的氨基酸序列如SEQ ID NO： 7所示； 所述BDD-FVIII-FD的氨基酸 序列如SEQ ID NO： 8所示。 4.如权利要求3所述重组基因载体， 其中， 所述FIX编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 9所示， 所述FIX-Padua编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 10所示， 所述FIX-KLW编码 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 11所示， 所述BDD-FVIII编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 12所。

6、示， 所述BDD-FVIII-FD编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 13所示。 5.如权利要求1-4中任一项所述重组基因载体的制备方法， 具体步骤包括： (1)从现有技术中分别获取基因产物的编码基因或目的基因的序列； (2)根据上述(1)中的序列构建表达所述基因产物的重组基因载体； 任选的， (3)在体内鉴定所述重组基因载体的表达水平， 并检测基因产物对相关疾病的治疗效 果； 所述重组基因载体包含所述基因产物的编码基因或目的基因； 优选的， 所述基因产物选自蛋白质， 多肽或核酸片段； 更优选的， 所述蛋白质或多肽选 自抗体、 功能性蛋白、 细胞因子、 酶或激素， 或者所述核酸片段选自。

7、基因片段， mRNA， siRNA， shRNA或miRNA； 优选的， 所述重组基因载体选自非病毒载体或病毒载体； 更优选的， 所述非病毒载体选 自标准质粒或其它环状表达盒子， 或者所述病毒载体选自逆转录病毒载体， 慢病毒载体， 腺 病毒载体和腺相关病毒载体。 6.如权利要求5所述制备方法， 其中， 所述功能性蛋白选自凝血因子IX(FIX)、 凝血因子 VIII(FVIII)或它们的变异体； 所述非病毒载体选自微环DNA载体， 或者所述病毒载体选自 腺相关病毒载体； 优选的， FIX选自全长的、 FIX-Padua突变体或FIX-KLW突变体； FVIII选自全长的、 BDD- FVIII突。

8、变体或BDD-FVIII-FD突变体。 7.一种宿主细胞， 其包含权利要求1-4中任一项所述重组基因载体； 优选的， 所述宿主 权利要求书 1/2 页 2 CN 110684798 A 2 细胞包括细菌细胞、 酵母细胞、 昆虫细胞或哺乳动物细胞。 8.一种药物组合物， 其包含如权利要求1-4中任一项所述重组基因载体， 以及药学上可 接受的载体。 9.如权利要求1-4中任一项所述重组基因载体， 如权利要求7所述宿主细胞， 或如权利 要求8所述药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途； 优选的， 所述疾病选自遗传性基因缺陷疾病； 更优选的， 所述遗传疾病选自A型或B型血 友病。 10.一种治疗患。

9、者疾病的方法， 该方法包括： (1)制备如权利要求1-4中任一项所述重组基因载体； 或者实施如权利要求5-6中任一 项所述的制备方法制备重组基因载体； (2)通过局部递送给予肌肉(如骨骼肌)有效剂量的所述重组基因载体， 在肌肉(如骨骼 肌)中高转基因表达以产生足以实现治疗效果的基因产物。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110684798 A 3 肌肉靶向的微环DNA基因治疗 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 具体涉及一种微环(Minicircle， MC)DNA载体， 更具体 为一种肌肉靶向的微环DNA基因治疗。 背景技术 0002 蛋白类药物(包括激素、 多肽)已广泛应用于多。

10、种单基因遗传病(Monogenic Disorders)及慢性病的临床治疗。 但是蛋白/激素/多肽药物热稳定性不好， 制备存储不便； 而且其体内半衰期有限， 需反复多次给药。 特别是对于遗传性基因缺陷病和慢性病来说， 往 往需长期甚至终生给药， 蛋白药物使用更是不便、 费用难以承担。 基因治疗可在体内持续表 达目的基因产物， 方便地实现长期治疗的目的。 基因治疗的实质是将携带目的基因的基因 载体投递至机体靶器官/组织， 目的基因进入细胞后， 利用宿主细胞的转录/翻译系统持续 表达治疗性基因产物。 肌肉(骨骼肌)接近体表， 是由终末分化的肌肉细胞组成， 转基因一但 进入即可持续存在， 是理想的基。

11、因治疗靶组织。 0003 基因载体及相应的基因投递手段是基因治疗的关键。 基因载体包括病毒载体和非 病毒载体两大类。 病毒载体可主动进入宿主细胞， 转染高效， 是主流的基因载体， 其中的代 表是腺相关病毒(Adeno-associated Virus， AAV)载体。 相反， 以质粒为代表的非病毒载体 无法主动进入宿主细胞， 体内转染有限。 与本发明最类似的方案是基于AAV载体或基于质粒 载体的基因治疗。 AAV载体为代表的病毒载体其病毒外壳免疫原性强， 容易引起剧烈的免疫 反应， 安全风险高。 此外， 基因随机整合导致的致癌和致畸风险也不容忽视。 AAV载体基因容 量有限， 总包装容量是4.。

12、7kb， 除去固有的ITR序列和启动子、 polyA等调控序列， 目的基因长 度一般不能超过3.5kb。 当目的基因较大时， AAV载体无法包装。 而质粒载体的最大缺陷是体 内转染效率低， 表达难以持续。 0004 对于现有技术中存在的技术问题， 微环(Minicircle， MC)DNA无免疫原性， 无基因 整合风险， 不受目的基因大小限制， 克服了质粒不能持续表达的缺陷， 配合肌肉靶向投递技 术， 可以在肌肉中长期高效表达治疗性基因产物。 发明内容 0005 本发明涉及微环(Minicircle， MC)DNA载体， 以及肌肉靶向的微环DNA基因治疗。 0006 本发明提供了一种表达治疗性。

13、基因产物的重组基因载体， 其中， 所述重组基因载 体包含所述基因产物的编码基因或目的基因。 0007 在一个方面中， 所述基因产物选自蛋白质， 多肽或核酸片段。 优选的， 所述蛋白质 或多肽选自抗体、 功能性蛋白、 细胞因子、 酶或激素， 或者所述核酸片段选自基因片段， mRNA， siRNA， shRNA或miRNA。 0008 在一个方面中， 所述重组基因载体选自非病毒载体或病毒载体。 优选的， 所述非病 毒载体选自标准质粒或其它环状表达盒子， 或者所述病毒载体选自逆转录病毒载体， 慢病 毒载体， 腺病毒载体和腺相关病毒(Adeno-associated Virus， AAV)载体。 说明。

14、书 1/13 页 4 CN 110684798 A 4 0009 在一个方面中， 所述功能性蛋白选自凝血因子IX(FIX)、 凝血因子VIII(FVIII)或 它们的变异体。 优选的， FIX选自全长的、 FIX-Padua突变体或FIX-KLW突变体。 优选的， FVIII 选自全长的、 B区缺失型(B-domain deleted)凝血因子VIII(BDD-FVIII)突变体或BDD- FVIII-FD突变体。 所述非病毒载体选自微环DNA载体， 或者所述病毒载体选自腺相关病毒载 体。 0010 在一个方面中， 所述FIX的氨基酸序列如SEQ ID NO： 3所示， 所述FIX-Padua。

15、的氨基 酸序列如SEQ ID NO： 4所示， 所述FIX-KLW的氨基酸序列如SEQ ID NO： 5所示， 所述BDD- FVIII的氨基酸序列如SEQ ID NO： 7所示； 所述BDD-FVIII-FD的氨基酸序列如SEQ ID NO： 8 所示。 0011 在一个方面中， 所述FIX具有与SEQ ID NO： 3所示序列至少90、 95、 98或99 同源性的氨基酸序列， 且具有与之前FIX相同的功能； 所述FIX-Padua具有与SEQ ID NO： 4所 示序列至少90、 95、 98或99同源性的氨基酸序列， 且具有与之前FIX相同的功能； 所 述FIX-KLW具有与SEQ I。

16、D NO： 5所示序列至少90、 95、 98或99同源性的氨基酸序列， 且具有与之前FIX相同的功能； 所述BDD-FVIII具有与SEQ ID NO： 7所示序列至少90、 95、 98或99同源性的氨基酸序列， 且具有与之前BDD-FVIII相同的功能； 所述BDD- FVIII-FD具有与SEQ ID NO： 8所示序列至少90、 95、 98或99同源性的氨基酸序列， 且具有与之前BDD-FVIII相同的功能。 0012 在一个方面中， 所述FIX编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 9所示， 所述FIX- Padua编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 10所示， 所述。

17、FIX-KLW编码基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO： 11所示， 所述BDD-FVIII编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 12所示， 所述BDD- FVIII-FD编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 13所示。 0013 在一个方面中， 所述FIX编码基因具有与SEQ ID NO： 9所示序列至少90、 95、 98或99同源性的核苷酸序列， 且编码得到的FIX具有与之前FIX相同的功能； 所述FIX- Padua编码基因具有与SEQ ID NO： 10所示序列至少90、 95、 98或99同源性的核苷酸 序列， 且编码得到的FIX-Padua具有与之前FIX-Padu。

18、a相同的功能； 所述FIX-KLW编码基因具 有与SEQ ID NO： 11所示序列至少90、 95、 98或99同源性的核苷酸序列， 且编码得到 的FIX-KLW具有与之前FIX-KLW相同的功能； 所述BDD-FVIII编码基因具有与SEQ ID NO： 12 所示序列至少90、 95、 98或99同源性的核苷酸序列， 且编码得到的BDD-FVIII具有 与之前BDD-FVIII相同的功能； 所述BDD-FVIII-FD编码基因具有与SEQ ID NO： 13所示序列 至少90、 95、 98或99同源性的核苷酸序列， 且编码得到的BDD-FVIII-FD具有与之前 BDD-FVIII相同。

19、的功能。 0014 本申请还提供了一种之前所述重组基因载体的制备方法， 具体步骤包括： 0015 (1)从现有技术中分别获取基因产物的编码基因或目的基因的序列； 0016 (2)根据上述(1)中的序列构建表达所述基因产物的重组基因载体； 0017 任选的， 0018 (3)在体内鉴定所述重组基因载体的表达水平， 并检测基因产物对相关疾病的治 疗效果； 0019 所述重组基因载体包含所述基因产物的编码基因或目的基因。 0020 在一个方面中， 所述基因产物选自蛋白质， 多肽或核酸片段。 优选的， 所述蛋白质 说明书 2/13 页 5 CN 110684798 A 5 或多肽选自抗体、 功能性蛋白。

20、、 细胞因子、 酶或激素， 或者所述核酸片段选自基因片段， mRNA， siRNA， shRNA或miRNA。 0021 在一个方面中， 所述重组基因载体选自非病毒载体或病毒载体。 优选的， 所述非病 毒载体选自标准质粒或其它环状表达盒子， 或者所述病毒载体选自逆转录病毒载体， 慢病 毒载体， 腺病毒载体和腺相关病毒载体。 0022 在一个方面中， 所述功能性蛋白选自凝血因子IX(FIX)、 凝血因子VIII(FVIII)或 它们的变异体， 所述非病毒载体选自微环DNA载体， 或者所述病毒载体选自腺相关病毒载 体。 0023 在一个方面中， FIX选自全长的、 FIX-Padua突变体或FIX。

21、-KLW突变体； FVIII选自全 长的、 BDD-FVIII突变体或BDD-FVIII-FD突变体。 0024 本申请还提供了一种宿主细胞， 其包含之前所述重组基因载体。 0025 在一个方面中， 所述宿主细胞包括细菌细胞、 酵母细胞、 昆虫细胞或哺乳动物细 胞。 0026 本申请还提供了一种药物组合物， 其包含之前所述重组基因载体， 以及药学上可 接受的载体。 0027 在一个方面中， 所述药物组合物可根据常规方法制成药物制剂。 制剂过程中， 优选 将重组基因载体与药学上可接受的载体混合或用载体稀释。 当载体作为稀释剂时， 其可以 为固体、 半固体或液体。 制剂选自片剂、 丸剂、 粉剂、 。

22、胶囊、 混悬剂、 乳剂、 溶液剂、 气溶胶、 注 射用溶液等形式。 合适的载体、 赋形剂或稀释剂包括水、 乳糖、 葡萄糖、 蔗糖、 山梨醇、 甘露 醇、 硅酸钙、 纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮、 羟基苯甲酸甲酯、 羟基苯甲酸丙酯、 滑石粉、 硬脂酸镁 和矿物油等。 制剂还可以包括填充剂、 抗凝血剂、 润滑剂、 保湿剂、 调味剂、 乳化剂、 防腐剂 等。 0028 本申请还提供了之前所述重组基因载体， 所述宿主细胞， 或所述药物组合物在制 备用于治疗疾病的药物中的用途。 0029 在一个方面中， 所述疾病选自遗传性基因缺陷疾病或慢性疾病。 优选的， 所述遗传 疾病选自A型或B型血友病。 0030 本。

23、申请还提供了一种治疗患者疾病的方法， 该方法包括： (1)制备如之前所述重组 基因载体； 或者实施如之前所述的制备方法制备重组基因载体； (2)通过局部递送给予肌肉 (如骨骼肌)有效剂量的所述重组基因载体， 在肌肉(如骨骼肌)中高转基因表达以产生足以 实现治疗效果的基因产物。 0031 本发明的积极效果包括： 利用微环DNA载体配合肌肉靶向投递技术， 可以在肌肉中 长期高效表达治疗性基因产物， 从而克服基因产物(尤其是蛋白类药物)半衰期有限、 疗效 无法持续的缺陷。 B型血友病小鼠经FIX因子微环DNA载体肌肉注射1个月后， 其凝血效果与 野生型小鼠一致。 可见， 本发明的微环DNA载体对于治。

24、疗遗传性基因缺陷病或慢性疾病具有 很好的前景， 并提供了新的临床思路。 附图说明 0032 图1： 微环DNA空载体pMC.DTS-CMVmax， 含attB和attP重组位点、 32个串联重复的I- SceI酶切位点(I-SceI*32)、 kana抗性基因、 SV40DNA核靶向序列(DNA nuclear targeting 说明书 3/13 页 6 CN 110684798 A 6 sequence ,DTS)、 CMV启动子/增强子、 嵌和内含子(chimeric intron)、 多克隆位点 (multiple cloning site,MCS)、 牛生长因子(bovine gro。

25、wth hormone,bGH)poly A信号。 0033 图2： FIX因子微环DNA载体图谱。 0034 图3： BDD-FVIII因子微环DNA载体图谱。 0035 图4： 小鼠肌肉注射FIX因子微环DNA载体或BDD-FVIII微环DNA， ELISA检测血浆FIX 因子或BDD-FVIII因子表达水平。 0036 图5： FIX因子微环DNA载体肌肉注射1个月后， 剪鼠尾实验(tail-clip assay)检测 B型血友病小鼠与野生型小鼠出血的凝血效果。 具体实施方式 0037 实施例1、 微环DNA母质粒构建 0038 1)合成全长FIX和BDD-FVIII基因DNA片段(如S。

26、EQ ID NO： 9-13所示)。 0039 2)上述DNA片段亚克隆至微环DNA空载体pMC.DTS-CMVmax(图谱如图1所示)， 构建 成微环DNA母质粒。 0040 实施例2、 微环DNA制备 0041 1)微环DNA母质粒转化基因工程E coli细菌ZYCY10P3S2T(Nature Biotechnology 2010,28:1287-9)。 0042 2)将含有微环母质粒的ZYCY10P3S2T接种至含kana的TB培养基， 37摇床培养12- 16h， 菌体产生大量微环DNA母质粒。 0043 3)加入含阿拉伯糖的诱导培养基， 在阿拉伯糖的诱导下(32摇床培养8h)， Z。

27、YCY10P3S2T表达C31重组酶和识别I-SceI位点的核酸内切酶。 微环DNA母质粒在C31重 组酶作用下， 在attB/attP重组位点处发生DNA重组， 形成两个小的环状DNA分子： i)微环DNA (只含目的基因表达框和36-bp的attR位点)； ii)质粒骨架DNA组成的小环(含I-SceI酶切位 点)。 质粒骨架DNA形成的小环以及未重组的残留微环DNA母质粒在I-SceI内切酶作用下， 被 线性化， 进而被DNA酶降解， ZYCY10P3S2T菌体内只剩下微环DNA。 0044 4)使用质粒提取试剂盒提取微环DNA。 0045 实施例3、 微环DNA动物体内表达验证 004。

28、6 1.实验步骤 0047 1)FIX微环DNA和BDD-FVIII微环DNA肌肉注射C57BL/6小鼠。 0048 2)按预定时间点定期采血， 分离血浆。 0049 3)ELISA试剂盒检测血浆FIX因子和BDD-FVIII因子表达(见图3)。 0050 2.实验结果 0051 单次肌肉注射微环(MC.FIX和MC.BDD-FVIII)， FIX和BDD-FVIII在小鼠中持续表达 超过40天， 血浆FIX浓度维持在30ng/mL左右， 血浆BDD-FVIII维持在正常水平的2-3。 0052 实施例4、 微环DNA凝血活性实验 0053 1.实验分组 0054 肌肉注射小鼠， 分组情况见下。

29、表： 0055 分组小鼠品系处理方式 空白对照组(N4)F9-KO肌肉注射PBS(50 l) 说明书 4/13 页 7 CN 110684798 A 7 微环DNA实验组(N4)F9-KO肌肉注射MC.FIX(3 g MC稀释于50 l PBS) 正常对照组(N4)C57/BL6无处理 0056 C57/BL6： 凝血功能正常的普通小鼠； F9-KO:C57/BL6遗传背景的FIX基因敲除小鼠 (B型血友病小鼠) 0057 2.出血时间检测 0058 小鼠尾尖0.5cm处剪断， 从开始出血计时， 每隔30s以滤纸粘断端出血处至滤纸上 完全不见红色血迹为止， 记录为该小鼠的出血时间， 出血时间最。

30、长观察60min， 超出60min仍 出血的按照60min计算(见图4)。 0059 3.实验结果 0060 与空白对照组(PBS)相比， MC.FIX微环肌肉注射B型血友病小鼠， 有2只出血时间明 显缩短(2/4)， 与正常对照小鼠的出血时间相当， 说明MC.FIX微环肌肉注射对B型血友病有 明显疗效。 0061 以上所述， 仅为本发明的较佳的具体实施例， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 根据本发明的技术方案及其 构思加以等同替换或改变， 都应涵盖在本发明的保护范围内。 说明书 5/13 页 8 CN 110684798 A 8 00。

31、62 说明书 6/13 页 9 CN 110684798 A 9 0063 说明书 7/13 页 10 CN 110684798 A 10 0064 说明书 8/13 页 11 CN 110684798 A 11 0065 说明书 9/13 页 12 CN 110684798 A 12 0066 说明书 10/13 页 13 CN 110684798 A 13 0067 说明书 11/13 页 14 CN 110684798 A 14 0068 说明书 12/13 页 15 CN 110684798 A 15 0069 说明书 13/13 页 16 CN 110684798 A 16 SEQU。

32、ENCE LISTING 深圳新诺微环生物科技有限公司 肌肉靶向的微环DNA基因治疗 CP11901190C 13 PatentIn version 3.3 1 28 PRT FIX信号肽 1 Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 1 5 10 15 Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys 20 25 2 18 PRT FIX前肽 （propeptide） 2 Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys I。

33、le Leu Asn Arg Pro 1 5 10 15 Lys Arg 3 461 PRT FIX 3 Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 1 5 10 15 Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu 20 25 30 Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn 35 40 45 Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe。

34、 Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 50 55 60 Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn 65 70 75 80 序列表 1/22 页 17 CN 110684798 A 17 Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln 85 90 95 Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile 100 105 1。

35、10 Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 115 120 125 Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe 130 135 140 Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe 1。

36、65 170 175 Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala 180 185 190 Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu 195 200 205 Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe 210 215 220 Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro T。

37、rp 225 230 235 240 Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile 245 250 255 Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly 260 265 270 Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu 275 280 285 His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro H。

38、is His Asn 290 295 300 Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu 305 310 315 320 Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile 325 330 335 Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr 340 345 350 Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly A。

39、rg Ser Ala Leu Val 355 360 365 Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg 370 375 380 Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 序列表 2/22 页 18 CN 110684798 A 18 385 390 395 400 Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val 405 410 415 Thr G。

40、lu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly 420 425 430 Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser 435 440 445 Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 450 455 460 4 461 PRT FIX-Padua突变体 4 Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 。

41、1 5 10 15 Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu 20 25 30 Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn 35 40 45 Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 50 55 60 Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn 65 70 7。

42、5 80 Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln 85 90 95 Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile 100 105 110 Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 115 120 125 Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe 130 13。

43、5 140 Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe 165 170 175 Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala 180 185 190 Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Gl。

44、u 序列表 3/22 页 19 CN 110684798 A 19 195 200 205 Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe 210 215 220 Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp 225 230 235 240 Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile 245 250 255 Val Asn Glu Lys Trp Il。

45、e Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly 260 265 270 Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu 275 280 285 His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn 290 295 300 Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu 305 310 315 320 Leu Asp Glu Pr。

46、o Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile 325 330 335 Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr 340 345 350 Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val 355 360 365 Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Leu 370 375 380 Ser Thr Ly。

47、s Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 385 390 395 400 Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val 405 410 415 Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly 420 425 430 Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser 435 440 445 Ar。

48、g Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 450 455 460 5 461 PRT FIX-KLW突变体 5 Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 序列表 4/22 页 20 CN 110684798 A 20 1 5 10 15 Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu 20 25 30 Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu 。

49、Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn 35 40 45 Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Lys Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 50 55 60 Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn 65 70 75 80 Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln 85 90 95 Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly S。

50、er Cys Lys Asp Asp Ile 100 105 110 Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 115 120 125 Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe 130 135 140 Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys S。