抗痤疮丙酸杆菌、葡萄球菌复合IgY抗原制备方法及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910941585.X (22)申请日 2019.09.30 (71)申请人 南京道大药业有限公司 地址 211505 江苏省南京市江北新区中山 科技园科创大道9号B9幢第一层 (72)发明人 付宇 (74)专利代理机构 上海精晟知识产权代理有限 公司 31253 代理人 安曼 (51)Int.Cl. A61K 39/295(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 39/085(2006.01) A61K 39/05(2006.01) A61P。

2、 17/10(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 17/00(2006.01) A61P 17/02(2006.01) A61P 31/22(2006.01) A61P 31/10(2006.01) C07K 16/12(2006.01) C07K 16/02(2006.01) (54)发明名称 一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗 原制备方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球 菌复合IgY抗原制备方法及其应用， 属于抗痤疮 丙酸杆菌、 葡萄球菌技术领域， 包括以下方法： 步 骤一： 免疫原制备， 取痤疮丙酸杆菌及菌体碎片 和。

3、金黄色和白色葡萄球菌及菌体碎片混合后分 别与福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂混合， 搅拌 乳化， 制成油包水福氏完全佐剂和福氏不完全佐 剂痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌免疫原； 步骤二： 免 疫， 将福氏完全佐剂免疫原注射给产蛋母鸡。 本 发明制取的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌 复合IgY抗体局部施于面部、 全身皮肤， 既无全身 用药的局限性和副作用又有用药起效快用药量 少疗效好不破坏粘膜皮肤表面正常微生态环境。 权利要求书2页 说明书18页 CN 110680917 A 2020.01.14 CN 110680917 A 1.一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法， 其特征在于， 包括以。

4、下方法： 步骤一： 免疫原制备， 取痤疮丙酸杆菌及菌体碎片和金黄色和白色葡萄球菌及菌体碎 片混合后分别与福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂混合， 搅拌乳化， 制成油包水福氏完全佐 剂和福氏不完全佐剂痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌免疫原； 步骤二： 免疫， 将福氏完全佐剂免疫原注射给产蛋母鸡； 步骤三： 抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的制备， 收集免疫母鸡的鸡蛋 并取蛋黄液与蒸馏水混合搅拌， 并调节酸碱取上清， 即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合 IgY抗体提取物。 2.如权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法， 其特征 在于， 在步骤一中免疫原制备包括： (1)取致。

5、病的痤疮丙酸杆菌及痤疮丙酸杆菌菌体碎片碎片4090份， 金黄色和白色葡 萄球菌及金黄色和白色葡萄球菌菌体碎片碎片1060份混合成菌液； (2)将等量体积的菌液与等量体积的福氏完全佐剂混合， 搅拌乳化， 制成油包水福氏完 全佐剂痤疮丙酸杆菌、 金黄色和白色葡萄球菌免疫原； (3)将等量体积的菌液与等量体积的福氏不完全佐剂混合， 搅拌乳化， 制成油包水福氏 不完全佐剂痤疮丙酸杆菌、 金黄色和白色葡萄球菌免疫原； (4)、 每毫升福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原中， 均含有细菌20亿40 亿。 3.如权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法， 其特征 在于， 在步。

6、骤二中免疫包括： (1)将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉30100点注射给产蛋母鸡， 每只产蛋母鸡注射 0.7ml1.5ml免疫原； (2)每隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1.0ml1.5ml皮下和肌肉5080点注射给产 蛋母鸡； (3)使用福氏不完全佐剂免疫原加强免疫34次后， 每隔四周再使用福氏不完全佐剂 免疫原1.0ml1.5ml皮下和肌肉5080点注射给产蛋母鸡加强免疫5次， 前后共免疫910 次。 4.如权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法， 其特征 在于， 在步骤三中抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的制备包括： (1)收集免疫30天免疫母鸡。

7、的鸡蛋， 鸡蛋表面用用自开水洗净、 酒精消毒， 取蛋黄， 去除 蛋黄膜取蛋黄液； (2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:69的比例加蒸馏水， 充分搅拌， 并用1NHCl调节酸 碱度至pH4.95.2， 在温度4下静置10小时或过夜； (3)将蛋黄稀释液高速离心30分钟， 取上清， 将蛋黄稀释液上清置于截留分子量为 10kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩815倍； (4)加入0.025.0的葡萄糖酸氯已定充分搅拌， 并使用1NNaOH调节酸碱度至 pH7.07.5， 并在温度4下静置10小时或过夜； (5)高速离心1530分钟， 取上清， 将上清经0.45 0.22 的消毒微孔滤膜过滤除菌， 即得抗痤。

8、疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体弃脂质和脂蛋白的提取物； 权利要求书 1/2 页 2 CN 110680917 A 2 (6)将除去脂质物质抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物加硫酸胺至55 60的饱和度， 充分搅拌， 室温静置311小时； (7)高速离心10分钟， 取沉淀， 将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量， 再加硫酸胺至33 40的饱和度， 充分搅拌， 室温静置311小时； (8)高速离心10分钟， 取沉淀， 用蒸馏水溶解后装入透析袋， 用蒸馏水透析除盐， 即得抗 痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品。 5.如权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法。

9、， 其特征 在于， 免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、 清洁环境下饲养、 以及SPF环境下饲养的家 庭土鸡、 白毛乌骨鸡、 海兰褐鸡、 莱杭鸡、 罗曼鸡和明星鸡。 6.如权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法， 其特征 在于， 第一次免疫后第28天收集免疫母鸡的鸡蛋， 第一次免疫后第28天至第320天的免疫母 鸡的鸡蛋均有高效价的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体。 7.如权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法， 其特征 在于， 提取的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的纯度采用还原性SDS- PAGE测定。 8.如。

10、权利要求1所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法， 其特征 在于， 在步骤一中菌体碎片采用石炭酸灭活处理， 同时用超声波粉碎机将细菌菌体碎片超 声粉碎。 9.一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法的应用， 其特征在于， 加入药 学上可接受的附加剂制成含有抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的喷雾剂、 气雾剂、 搽洗液、 软膏和胶布。 10.如权利要求9所述的一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法的应用， 其特征在于， 制取的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体局部施于皮肤， 用于防 治不同临床和病理表现痤疮， 以及继发性痤疮感染性炎症。。

11、 权利要求书 2/2 页 3 CN 110680917 A 3 一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法及其 应用 技术领域 0001 本发明涉及抗痤疮IgY制备及其应用， 特别是涉及一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌 复合IgY抗原制备方法及其应用， 属于抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌技术领域。 背景技术 0002 痤疮丙酸杆菌Propionibacteriumacnes， 也称痤疮杆菌、 疮疱丙酸杆菌， 属于细菌 界、 放线菌门、 纲、 亚纲、 目、 丙酸杆菌亚目、 科、 以及丙酸杆菌属， 是一种生长相对缓慢的典 型革兰氏阳性厌氧菌短杆状， 细胞内寄生， 属于皮肤的正常菌群， 一般寄居。

12、在皮肤的毛囊及 皮脂腺中。 痤疮丙酸杆菌的基因控制产生分解皮肤和免疫原性蛋白的酶。 痤疮丙酸杆菌生 活在毛孔里的脂肪酸上， 当毛孔被堵塞时， 它们就会疯狂生长， 分解饱和脂肪酸， 产生大量 的游离脂肪酸， 这些脂肪酸通过毛孔渗入皮肤， 引起皮肤应激反应， 产生粉刺、 红肿等， 葡萄 状球菌等细菌通过流出的脓液粘在皮肤上， 导致皮肤组织受损。 0003 痤疮是由痤疮丙酸杆菌引起的毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病， 好发于 青少年人群， 临床表现以好发于面部及上胸背部的粉刺、 丘疹、 脓疱、 结节等多形性皮损为 特点。 痤疮常年发生， 并可反复发生， 青春期后往往能自然减轻或痊愈。 但患者常常。

13、留下面 部结缔组织增生疙瘩和凹陷永久性损伤， 严重影响容貌， 导致心理创伤， 临床上根据痤疮皮 损性质和严重程度分为3度、 4级： 1级： 仅有粉刺； 2级： 除粉刺外， 还有一些炎性丘疹； 3级： 除 粉刺外， 还有较多的炎性丘疹或脓疱； 4级： 除有粉刺、 炎性丘疹及脓疱外， 还有结节、 囊肿或 瘢痕。 痤疮的非炎症性皮损表现为开放性和闭合性粉刺。 闭合性粉刺的典型皮损是约1毫米 大小的肤色丘疹， 无明显毛囊开口。 开放性粉刺表现为圆顶状丘疹伴显著扩张的毛囊开口。 粉刺进一步发展会演变成各种炎症性皮损， 表现为炎性丘疹、 脓疱、 结节和囊肿。 炎性丘疹 呈红色， 直径15毫米不等； 脓疱大。

14、小一致， 其中充满了白色脓液； 结节直径大于5毫米， 触 之有硬结和疼痛感； 囊肿的位置更深， 充满了脓液和血液的混合物。 这些皮损还可融合形成 大的炎性斑块和窦道等。 炎症性皮损消退后常常遗留色素沉着、 持久性红斑、 凹陷性或肥厚 性瘢痕。 0004 痤疮的发生主要与皮脂分泌过多、 毛囊皮脂腺导管堵塞后痤疮丙酸杆菌感染， 以 及继发葡萄球菌感染和炎症反应所致。 青春期人体内雄激素， 特别是睾酮的水平迅速升高， 促进皮脂腺发育并产生大量皮脂， 同时毛囊皮脂腺导管的角化异常造成导管堵塞， 皮脂排 出障碍， 形成角质栓即微粉刺。 毛囊中多种微生物， 尤其是痤疮丙酸杆菌因皮脂含有较多脂 肪酸等成分致。

15、使其大量生长及繁殖。 痤疮丙酸杆菌产生的脂酶分解皮脂生成游离脂肪酸， 同时趋化炎症细胞和介质， 最终诱导并加重炎症反应。 0005 痤疮日常护理为每日1到2次温水洗脸， 忌用油脂类、 粉类化妆品和含有糖皮质激 素的软膏及霜剂， 忌用手挤压或搔抓皮损。 痤疮治疗的常用方法为局部外用药物： 维A酸类、 过氧化苯甲酰、 抗生素类、 壬二酸、 硫磺洗剂等； 口服抗生素： 四环素类， 其次为大环内酯类， 疗程612周。 严重的痤疮则口服异维A酸， 疗程以达到最小累积剂量60mg/kg为目标。 抗雄 说明书 1/18 页 4 CN 110680917 A 4 激素治疗： 如： 口服避孕药复方醋酸环丙孕酮片。

16、， 适用于女性中、 重度痤疮患者， 伴有雄激素 水平过高表现或多囊卵巢综合征。 迟发型痤疮及月经期前痤疮显著加重的女性患者也可考 虑应用口服避孕药。 口服糖皮质激素： 主要用于暴发性或聚合性痤疮， 遵循短期、 小剂量、 与 其他方法联合应用的原则。 其他治疗包括对于不能耐受或不愿接受药物治疗的患者， 还可 考虑物理治疗， 如光动力疗法、 果酸疗法、 激光治疗等。 痤疮的分级治疗包括： 1级： 采用局部 治疗， 首选外用维A酸类制剂。 2级： 联合外用维A酸类及过氧化苯甲酰或抗生素， 必要时联合 口服抗生素。 3级： 常常需要联合治疗， 口服抗生素联合外用过氧化苯甲酰和/或维A酸类药 物为首选。。

17、 有指征的女性患者也可考虑抗雄激素治疗。 4级： 口服异维A酸是最有效的治疗方 法， 可作为一线治疗。 对于炎性丘疹和脓疱较多者， 也可先系统应用抗生素联合外用过氧化 苯甲酰， 待皮损明显改善后再改用口服异维A酸序贯治疗。 痤疮的维持治疗为： 待皮损明显 消退以后均应继续维持治疗， 首选外用维A酸类药物， 维持治疗612个月， 必要时可联合过 氧化苯甲酰。 0006 继发性葡萄球菌感染通常发生在2级以上， 有炎性丘疹、 脓疱， 长期炎症反应出现 炎性斑块和窦道、 伴随结蹄组织增生出现结节、 囊肿及瘢痕等。 结节、 囊肿及瘢痕形成则留 下永久性炎症性皮损。 因此继发性葡萄球菌感染是永久性皮损的主。

18、要病因， 长期抗菌素使 用也导致导致菌群失调和细菌耐药性。 故迫切需要解决皮肤表面存在多少痤疮丙酸杆菌和 葡萄球菌存在的问题， 且不破坏机体微生态环境的防治手段和方法。 0007 葡萄球菌是大家族， 有许多不同的种和型， 它们除了有各自特异性的抗原外， 还存 在着不同数量的不同种和型的家族遗传的共同抗原。 根据这个原理， 我们采用痤疮丙酸杆 菌、 葡萄球菌混合免疫产蛋母鸡， 诱导其产生的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY 抗体不但可以与免疫的痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌产生特异性免疫反应， 而且也能够与不同 种属和型的具有共同抗原决定簇的痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌产生特异性免疫反应。 当IgY 。

19、抗体与细菌表面抗原发生免疫反应则可以阻止痤疮丙酸杆菌进入细胞及葡萄球菌粘附于 炎症部位， 促进吞噬细胞消灭痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌， 从而减少感染达到防治疾病的效 果。 当IgY抗体与细菌表面抗原发生免疫反应时， 其改变细菌表面结构、 抑制细菌的一些功 能活性、 抑制细菌生长、 减少和抑制细菌对细胞的黏附、 促进分叶核细胞和巨噬细胞等吞噬 细胞对细菌的吞噬和清除。 事实上临床上使用特异性IgY抗体防治龋齿和婴幼儿轮状病毒 性腹泻预防胆囊纤维化患者绿脓杆菌感染减轻幽门螺杆菌引起的胃炎。 0008 抗痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌复合IgY抗体与目前抗菌素作用原理不同， 其与细菌 表面相应抗原发生特异性结合。

20、抑制了细菌的活性、 阻止细菌粘附于组织细胞、 排斥了细菌 在炎症部位的存在、 改变了细菌表面结构和电场并促进吞噬细胞对细菌的吞噬和清除， 同 时又完全不会诱发耐药菌株的产生， 不破坏局部和整体微生态平衡， 同时也避免了抗菌素 滥用和广泛的耐药菌株发生， 故显示出特异性抗痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌复合IgY抗体制 剂的重要性和可行性。 根据上述特异性IgY抗体的作用原理， 特异性抗痤疮丙酸杆菌和葡萄 球菌复合IgY抗体制剂能够有效地治疗所有由痤疮丙酸杆菌和葡萄球菌类细菌， 以及具有 与这这些细菌有共同抗原决定簇的细菌引起的痤疮和皮肤感染性炎症， 如： 痤疮及痤疮感 染、 皮肤破损引起的皮肤急、 慢性。

21、炎症、 化脓、 疖肿和皮下痈肿等。 说明书 2/18 页 5 CN 110680917 A 5 发明内容 0009 本发明的主要目的是为了解决治疗由痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌以及具有共同抗 原决定簇的细菌引起的单纯性痤疮、 化脓性痤疮； 由此引起的皮肤疖肿和及皮下痈肿， 同时 阻止面部疙瘩的形成而提供一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法及其应 用。 0010 本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到： 0011 一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法， 包括以下方法： 0012 步骤一： 免疫原制备， 取痤疮丙酸杆菌及菌体碎片和金黄色和白色葡萄球菌及菌 体碎片混合后分。

22、别与福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂混合， 搅拌乳化， 制成油包水福氏完 全佐剂和福氏不完全佐剂痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌免疫原； 0013 步骤二： 免疫， 将福氏完全佐剂免疫原注射给产蛋母鸡； 0014 步骤三： 抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的制备， 收集免疫母鸡的 鸡蛋并取蛋黄液与蒸馏水混合搅拌， 并调节酸碱取上清， 即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌 复合IgY抗体提取物。 0015 优选的， 在步骤一中免疫原制备包括： 0016 (1)取致病的痤疮丙酸杆菌及痤疮丙酸杆菌菌体碎片碎片4090份， 金黄色和白 色葡萄球菌及金黄色和白色葡萄球菌菌体碎片碎片1060份混合成菌液； 0017。

23、 (2)将等量体积的菌液与等量体积的福氏完全佐剂混合， 搅拌乳化， 制成油包水福 氏完全佐剂痤疮丙酸杆菌、 金黄色和白色葡萄球菌免疫原； 0018 (3)将等量体积的菌液与等量体积的福氏不完全佐剂混合， 搅拌乳化， 制成油包水 福氏不完全佐剂痤疮丙酸杆菌、 金黄色和白色葡萄球菌免疫原； 0019 (4)、 每毫升福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原中， 均含有细菌20亿 40亿。 0020 3、 优选的， 在步骤二中免疫包括： 0021 (1)将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉30100点注射给产蛋母鸡， 每只产蛋母鸡 注射0.7ml1.5ml免疫原； 0022 (2)每隔一周使用福氏不完全佐。

24、剂免疫原1.0ml1.5ml皮下和肌肉5080点注射 给产蛋母鸡； 0023 (3)使用福氏不完全佐剂免疫原加强免疫34次后， 每隔四周再使用福氏不完全 佐剂免疫原1.0ml1.5ml皮下和肌肉5080点注射给产蛋母鸡加强免疫5次， 前后共免疫9 10次。 0024 优选的， 在步骤三中抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的制备包括： 0025 (1)收集免疫30天免疫母鸡的鸡蛋， 鸡蛋表面用用自开水洗净、 酒精消毒， 取蛋黄， 去除蛋黄膜取蛋黄液； 0026 (2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:69的比例加蒸馏水， 充分搅拌， 并用1NHCl调 节酸碱度至pH4.95.2， 在温度4下。

25、静置10小时或过夜； 0027 (3)将蛋黄稀释液高速离心30分钟， 取上清， 将蛋黄稀释液上清置于截留分子量为 10kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩815倍； 0028 (4)加入0.025.0的葡萄糖酸氯已定充分搅拌， 并使用1NNaOH调节酸碱度至 说明书 3/18 页 6 CN 110680917 A 6 pH7.07.5， 并在温度4下静置10小时或过夜； 0029 (5)高速离心1530分钟， 取上清， 将上清经0.45 0.22 的消毒微孔滤膜过滤除 菌， 即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体弃脂质和脂蛋白的提取物； 0030 (6)将除去脂质物质抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复。

26、合IgY抗体提取物加硫酸胺至 5560的饱和度， 充分搅拌， 室温静置311小时； 0031 (7)高速离心10分钟， 取沉淀， 将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量， 再加硫酸胺至 3340的饱和度， 充分搅拌， 室温静置311小时； 0032 (8)高速离心10分钟， 取沉淀， 用蒸馏水溶解后装入透析袋， 用蒸馏水透析除盐， 即 得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品。 0033 优选的， 免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、 清洁环境下饲养、 以及SPF环境 下饲养的家庭土鸡、 白毛乌骨鸡、 海兰褐鸡、 莱杭鸡、 罗曼鸡和明星鸡。 0034 优选的， 第一次免疫后第28天收集免疫母鸡的鸡。

27、蛋， 第一次免疫后第28天至第320 天的免疫母鸡的鸡蛋均有高效价的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体。 0035 优选的， 提取的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的纯度采用还 原性SDS-PAGE测定。 0036 优选的， 在步骤一中菌体碎片采用石炭酸灭活处理， 同时用超声波粉碎机将细菌 菌体碎片超声粉碎。 0037 一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法的应用， 加入药学上可接受 的附加剂制成含有抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的喷雾剂、 气雾剂、 搽洗液、 软 膏和胶布。 0038 优选的， 制取的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体局部施于。

28、皮肤， 用 于防治不同临床和病理表现痤疮， 以及继发性痤疮感染性炎症。 0039 本发明的有益技术效果： 按照本发明的一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗 原制备方法及其应用， 制取的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体局部施于面 部、 全身皮肤， 既无全身用药的局限性和副作用， 又有局部用药起效快、 用药量少、 疗效好、 不吸收、 不破坏面部及全身皮肤正常菌群的微生态环境、 不导致局部菌群失调等效果， 也无 毒副作用， 更无抗菌素局部使用易产生耐药性等问题； IgY抗体不激活补体系统， 不与类风 湿因子产生非特异性结合， 不固定金黄色葡萄球菌A蛋白， 不与蛋白G， 以及人类细胞。

29、Fc受体 结合， 因而不易发生变态反应。 抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合抗体提取物不产生急性毒 性反应和慢性毒性反应， 属于实际无毒级； 抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物 三致试验阴性， 属于无致畸、 致癌、 致突变的制品， 同时也无眼结膜、 粘膜、 皮肤刺激性。 具体实施方式 0040 为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案， 下面结合实施例对本发 明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限于此。 0041 本实施例提供的抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法及其应用， 包括 以下方法： 0042 步骤一： 免疫原制备， 取痤疮丙酸杆菌及菌体碎片和金黄色和白。

30、色葡萄球菌及菌 体碎片混合后分别与福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂混合， 搅拌乳化， 制成油包水福氏完 说明书 4/18 页 7 CN 110680917 A 7 全佐剂和福氏不完全佐剂痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌免疫原； 0043 步骤二： 免疫， 将福氏完全佐剂免疫原注射给产蛋母鸡； 0044 步骤三： 抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的制备， 收集免疫母鸡的 鸡蛋并取蛋黄液与蒸馏水混合搅拌， 并调节酸碱取上清， 即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌 复合IgY抗体提取物。 0045 在步骤一中免疫原制备包括： (1)取致病的痤疮丙酸杆菌及痤疮丙酸杆菌菌体碎 片碎片4090份， 金黄色和白色葡萄。

31、球菌及金黄色和白色葡萄球菌菌体碎片碎片1060份 混合成菌液； (2)将等量体积的菌液与等量体积的福氏完全佐剂混合， 搅拌乳化， 制成油包 水福氏完全佐剂痤疮丙酸杆菌、 金黄色和白色葡萄球菌免疫原； (3)将等量体积的菌液与等 量体积的福氏不完全佐剂混合， 搅拌乳化， 制成油包水福氏不完全佐剂痤疮丙酸杆菌、 金黄 色和白色葡萄球菌免疫原； (4)每毫升福氏完全佐剂免疫原和福氏不完全佐剂免疫原中， 均 含有细菌20亿40亿。 0046 在步骤二中免疫包括： (1)将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉30100点注射给产 蛋母鸡， 每只产蛋母鸡注射0.7ml1.5ml免疫原； (2)每隔一周使用福氏不完。

32、全佐剂免疫原 1.0ml1.5ml皮下和肌肉5080点注射给产蛋母鸡； (3)使用福氏不完全佐剂免疫原加强 免疫34次后， 每隔四周再使用福氏不完全佐剂免疫原1.0ml1.5ml皮下和肌肉5080点 注射给产蛋母鸡加强免疫5次， 前后共免疫910次。 0047 在步骤三中抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的制备包括： (1)收集 免疫30天免疫母鸡的鸡蛋， 鸡蛋表面用用自开水洗净、 酒精消毒， 取蛋黄， 去除蛋黄膜取蛋 黄液； (2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:69的比例加蒸馏水， 充分搅拌， 并用1NHCl调节酸 碱度至pH4.95.2， 在温度4下静置10小时或过夜； (3)将蛋。

33、黄稀释液高速离心30分钟， 取 上清， 将蛋黄稀释液上清置于截留分子量为10kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩815倍； (4)加入0.025.0的葡萄糖酸氯已定充分搅拌， 并使用1NNaOH调节酸碱度至pH7.0 7.5， 并在温度4下静置10小时或过夜； (5)高速离心1530分钟， 取上清， 将上清经0.45 0.22 的消毒微孔滤膜过滤除菌， 即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体弃脂质和 脂蛋白的提取物； (6)将除去脂质物质抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物加硫 酸胺至5560的饱和度， 充分搅拌， 室温静置311小时； (7)高速离心10分钟， 取沉淀， 将沉淀使用蒸。

34、馏水稀释到原体积量， 再加硫酸胺至3340的饱和度， 充分搅拌， 室温静 置311小时； (8)高速离心10分钟， 取沉淀， 用蒸馏水溶解后装入透析袋， 用蒸馏水透析除 盐， 即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品。 0048 免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、 清洁环境下饲养、 以及SPF环境下饲养的 家庭土鸡、 白毛乌骨鸡、 海兰褐鸡、 莱杭鸡、 罗曼鸡和明星鸡， 第一次免疫后第28天收集免疫 母鸡的鸡蛋， 第一次免疫后第28天至第320天的免疫母鸡的鸡蛋均有高效价的抗痤疮丙酸 杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体， 提取的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的 纯度， 采用还。

35、原性SDS-PAGE测定， 在步骤一中菌体碎片采用石炭酸灭活处理， 同时用超声波 粉碎机将细菌菌体碎片超声粉碎。 0049 一种抗痤疮丙酸杆菌、 葡萄球菌复合IgY抗原制备方法的应用， 加入药学上可接受 的附加剂制成含有抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的喷雾剂、 气雾剂、 搽洗液、 软 膏和胶布， 制取的特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体局部施于皮肤， 用于防治 说明书 5/18 页 8 CN 110680917 A 8 不同临床和病理表现痤疮， 以及继发性痤疮感染性炎症。 0050 实施例1： 0051 制备600克抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物生产工艺流程：。

36、 0052 步骤一： 免疫原的制备 0053 (1)来自于化脓性痤疮患者分离的痤疮丙酸杆菌及金黄色和白色葡萄球菌， 经庖 肉培养基扩增培养痤疮丙酸杆菌， 以及10的新鲜羊血胰胨肉汤培养基扩增培养金黄色和 白色葡萄球菌， 经鉴定确认为痤疮丙酸杆菌及金黄色和白色葡萄球菌； 0054 (2)将上述菌体碎片经石炭酸灭活处理， 另外， 用超声波粉碎机将细菌超声粉碎30 分钟， 使细菌菌体碎片粉碎裂解成细小的和/或分子的碎片； 0055 (3)痤疮丙酸杆菌及痤疮丙酸杆菌菌体碎片金黄色和白色葡萄球菌及金黄色和白 色葡萄球菌菌体碎片65:25:10数量份混合； 0056 (4)其中细菌与菌体碎片碎片的比例为细。

37、菌75份， 菌体碎片碎片25份； 0057 (5)将400ml菌体碎片及菌体碎片碎片的菌液与400ml的福氏完全佐剂混合， 使用 高速搅拌器搅拌乳化， 制成油包水福氏完全佐剂免疫原； 0058 (5)福氏不完全佐剂免疫原的制备则为： 将400ml菌体碎片及菌体碎片碎片的菌液 与400ml的福氏不完全佐剂混合， 使用高速搅拌器搅拌乳化， 制成油包水福氏不完全佐剂免 疫原， 每毫升免疫原中含有细菌30亿； 0059 步骤二： 免疫产蛋母鸡 0060 (1)使用注射器将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉80点注射给30周的海兰褐产蛋 母鸡， 每只注射1.5ml免疫原； 0061 (2)隔一周使用福氏不完全。

38、佐剂免疫原1.5ml皮下和肌肉80点注射给产蛋母鸡， 共 4次； 0062 (3)每隔4周再使用福氏不完全佐剂免疫原1.5ml皮下和肌肉80点注射给产蛋母鸡 加强免疫共5次， 前后共免疫10次， 免疫母鸡总数为400只； 0063 步骤三： 抗抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的制备 0064 (1)收集第一次免疫后5090天的免疫母鸡的鸡蛋， 使用70的酒精浸泡进行鸡 蛋表面消毒， 取蛋黄， 去除蛋黄膜取蛋黄液； 0065 (2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:8的比例加蒸馏水， 充分搅拌， 并使用1NHCl调节 酸碱度至pH5.0， 放置4冰柜10小时； 0066 (3)将蛋黄稀释。

39、液高速离心10000rpm， 30分钟， 取上清， 将上清置于截留分子量 100kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩10倍， 加入2.0的葡萄糖酸氯已定充分搅拌， 并使用 1NNaOH调节酸碱度至pH7.2， 并放置410小时； 0067 (4)高速离心10000rpm， 20分钟， 取上清， 将上清经0.45 的消毒微孔滤膜过滤除 菌， 即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物； 0068 (5)抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物经ELISA方法测定其提取物 中每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的效价为1:1000/mg蛋白， 或者称粗提取物中每毫克蛋白 中的特异性IgY抗体的。

40、比活为1:1000， 在IgY抗体粗提取物中， IgY抗体的纯度经非还原性 SDS-PAGE测定为31.3。 0069 实施例2： 说明书 6/18 页 9 CN 110680917 A 9 0070 制备600克抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物生产工艺流程： 0071 步骤一： 免疫原的制备 0072 (1)来自于化脓性痤疮患者分离的痤疮丙酸杆菌及金黄色和白色葡萄球菌， 经庖 肉培养基扩增培养痤疮丙酸杆菌， 以及10的新鲜羊血胰胨肉汤培养基扩增培养金黄色和 白色葡萄球菌， 经鉴定确认为痤疮丙酸杆菌及金黄色和白色葡萄球菌； 0073 (2)将上述菌体碎片经石炭酸灭活处理。 另外，。

41、 用超声波粉碎机将细菌菌体碎片超 声粉碎30分钟， 使细菌菌体碎片粉碎裂解成细小的和/或分子的碎片； 0074 (3)痤疮丙酸杆菌及痤疮丙酸杆菌菌体碎片金黄色和白色葡萄球菌及金黄色和白 色葡萄球菌菌体碎片65:25:10数量份混合。 其中细菌与菌体碎片碎片的比例为细菌75份， 菌体碎片碎片25份； 0075 (4)将400ml菌体碎片及菌体碎片碎片的菌液与400ml的福氏完全佐剂混合， 使用 高速搅拌器搅拌乳化， 制成油包水福氏完全佐剂免疫原； 0076 (5)福氏不完全佐剂免疫原的制备则为： 将400ml菌体碎片及菌体碎片碎片的菌液 与400ml的福氏不完全佐剂混合， 使用高速搅拌器搅拌乳化。

42、， 制成油包水福氏不完全佐剂免 疫原， 每毫升免疫原中含有细菌30亿； 0077 步骤二： 免疫产蛋母鸡 0078 (1)使用注射器将福氏完全佐剂免疫原皮下和肌肉80点注射给30周的海兰褐产蛋 母鸡， 每只注射1.5ml免疫原； 0079 (2)隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1.5ml皮下和肌肉80点注射给产蛋母鸡， 共 4次； 0080 (3)每隔4周再使用福氏不完全佐剂免疫原1.5ml皮下和肌肉80点注射给产蛋母鸡 加强免疫共5次， 前后共免疫10次， 免疫母鸡总数为400只； 0081 步骤三： 抗抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的制备 0082 (1)收集第一次免疫后50。

43、90天的免疫母鸡的鸡蛋， 使用70的酒精浸泡进行鸡 蛋表面消毒， 取蛋黄， 去除蛋黄膜取蛋黄液； 0083 (2)将蛋黄液与蒸馏水按体积比1:8的比例加蒸馏水， 充分搅拌， 并使用1NHCl调节 酸碱度至pH5.0， 放置4冰柜10小时； 0084 (3)将蛋黄稀释液高速离心10000rpm， 30分钟， 取上清， 将上清置于截留分子量 100kDa的中空纤维超滤器中超滤浓缩10倍， 加入2.0的氯已定充分搅拌， 并使用1NNaOH调 节酸碱度至pH7.2， 并放置410小时； 0085 (4)高速离心10000rpm， 20分钟， 取上清， 将上清经0.45 的消毒微孔滤膜过滤除 菌， 即得。

44、抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物； 0086 (5)抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物加硫酸胺至55的饱和度， 充分搅拌， 室温静置4小时， 高速离心10000rpm15分钟， 取沉淀， 将沉淀使用蒸馏水稀释到原 体积量， 再加硫酸胺至33的饱和度， 充分搅拌， 室温静置4小时； 0087 (6)高速离心10000rpm15分钟， 取沉淀， 用蒸馏水稀释溶解后装入透析袋， 用蒸馏 水透析除盐， 即得抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品； 抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球 菌复合IgY抗体纯品经ELISA方法测定其抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体纯品中每 毫克蛋白的特。

45、异性IgY抗体的效价为1:4000/mg蛋白， 或者称抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复 说明书 7/18 页 10 CN 110680917 A 10 合IgY抗体纯品里每毫克蛋白中的特异性鸡IgY抗体的比活为1:4000。 在IgY抗体纯品中， IgY抗体的纯度经非还原性SDS-PAGE测定为86.4。 0088 实验例3： 0089 痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合免疫原按本发明的方法免疫海兰褐产蛋母鸡， 取第 一次免疫后4060天的免疫母鸡的鸡蛋， 并按本发明的方法制备出抗痤疮丙酸杆菌及葡萄 球菌复合IgY抗体的提取物， 应用ELISA方法测定抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体 结合不同抗原的生。

46、物学效价。 0090 表1抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提取物的效价 0091 0092 根据上述实验结果可以清楚地看到： 痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌菌体碎片+菌体碎 片碎片免疫原免疫产蛋母鸡， 可以产生分别抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌IgY抗体； 根据免疫 产蛋母鸡时每种细菌使用的剂量不同， 所产生的各自特异性IgY抗体的效价也不相同， 免疫 剂量大的细菌产生IgY抗体的效价也高， 反之则低； 痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体 与痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌混合抗原都能起反应， 而且总的特异性IgY抗体的效价也增加 了， 其效价有一定的叠加作用； 由上述实验可见， 一种抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌。

47、复合IgY 抗体可以治疗由上述细菌引起的痤疮及急、 慢性痤疮感染性炎症等； 同时也可以用一种抗 痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体治疗由上述细菌中的任何一种细菌引起的急、 慢性 痤疮感染性炎症； 由此还可以扩大到由与上述细菌具有共同抗原决定簇的细菌引起的痤 疮， 以及急、 慢性痤疮感染性炎症等， 都可以使用本发明的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合 IgY抗体治疗。 0093 实验例4： 0094 痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合免疫原按本发明的方法免疫海兰褐产蛋母鸡， 取第 一次免疫后4060天的免疫母鸡的鸡蛋， 并按本发明的方法制备出抗痤疮丙酸杆菌及葡萄 球菌复合IgY抗体的提纯品， 应用ELISA。

48、方法测定抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体 结合不同抗原的生物学效价。 0095 表2抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体提纯品的效价 0096 说明书 8/18 页 11 CN 110680917 A 11 0097 根据上述实验结果可以清楚地看到： 按本发明的方法制备出抗痤疮丙酸杆菌及葡 萄球菌复合IgY抗体的提纯品要比实验例1中的按本发明的方法制备出抗痤疮丙酸杆菌及 葡萄球菌复合IgY抗体的提取物的特异性IgY抗体结合痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合抗原 和痤疮丙酸杆菌、 金黄色和白色葡萄球菌细菌各自抗原的生物学效价都要高， 基本是按比 例增加； 痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合免疫原免疫产蛋。

49、母鸡， 可以产生分别抗三种细菌的 特异性IgY抗体； 根据免疫产蛋母鸡时每种细菌使用的剂量不同， 所产生的各自特异性IgY 抗体的效价也不相同， 免疫剂量大的细菌产生IgY抗体的效价也高， 反之则低； 抗痤疮丙酸 杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体与痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合抗原都能起反应， 而且总的 特异性IgY抗体的效价也增加了， 其效价有一定的叠加作用； .由上述实验可见， 一种抗痤疮 丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体可以治疗由上述三种菌引起的急， 慢性痤疮及继发性痤 疮感染性脓疱疹等； .同时也可以用一种抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体治疗由上 述三种菌中的任何一种细菌或真菌引起的急，。

50、 慢性痤疮及继发性痤疮感染性脓疱疹等； 由 此还可以扩大到由与上述三种菌有共同抗原决定簇的细菌引起的急， 慢性痤疮及继发性痤 疮感染性脓疱疹， 以及皮疹等都可以使用本发明的抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗 体治疗。 0098 实验例5： 0099 比较不同鸡种的免疫应答和产生抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体的能 力： 以权利要求1所述的一种特异性抗痤疮丙酸杆菌及葡萄球菌复合IgY抗体粗提取物的制 备方法， 分别免疫规模化笼养海兰褐产蛋母鸡、 明星母鸡和莱杭产蛋母鸡， 以及放养的产蛋 土鸡， 采用第一次免疫后40100天的免疫母鸡的鸡蛋， 并按权利要求1所述的方法提取抗 痤疮丙酸杆菌及。