SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂及其中间体、制备方法和用途.pdf

《SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂及其中间体、制备方法和用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂及其中间体、制备方法和用途.pdf（10页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911063197.2 (22)申请日 2019.11.01 (71)申请人 海南一龄医疗产业发展有限公司 地址 571437 海南省琼海市中原镇博鳌乐 城国际医疗旅游先行区康祥路13号 申请人 苏学明李玮杨超 (72)发明人 苏学明李玮杨超 (74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务 所(特殊普通合伙) 11419 代理人 王玉松怀春颖 (51)Int.Cl. C07D 413/04(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 31/5377(。

2、2006.01) (54)发明名称 SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂及其中间体、 制备方法和用途 (57)摘要 本发明提供一种SET8赖氨酸甲基转移酶抑 制剂及其中间体、 制备方法和用途， 该抑制剂的 结构通式如下所示，该抑制剂对 SET8赖氨酸甲基转移酶具有显著的抑制活性， 同 时具有显著地体外抗肿瘤活性， 可以进一步开发 成以SET8为靶标的靶向抗肿瘤药物。 权利要求书2页 说明书7页 CN 110684022 A 2020.01.14 CN 110684022 A 1.式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂、 其光学异构体、 溶剂合物或其药学上可 接受的盐， 其中， R1或R2各自独立地。

3、选自C1-C6烷基、 取代C1-C6烷基、 环烷基、 苯基、 取代苯基、 苄基、 取代 苄基、 杂环基或取代杂环基； 所述取代C1-C6烷基独立地被一个或多个选自卤素、 硝基、 氨基、 羟基或氰基的取代基取代； 所述取代苯基或取代苄基各自独立地被一个或多个选自卤素、 C1-C6烷基、 C1-C6烷氧基、 三氟甲氧基、 三氟甲基、 硝基、 氨基、 羟基、 C1-C6烷酰氨基、 氰基、 C1- C6烷氨基或C1-C6烷氧酰基的取代基取代； 所述取代杂环基独立地被一个或多个选自卤素、 C1-C6烷基、 C1-C6烷氧基、 三氟甲氧基、 三氟甲基、 苯基、 苄基、 硝基、 氨基、 羟基、 C1-C6烷。

4、酰氨 基、 氰基、 C1-C6烷氨基或C1-C6烷氧酰基的取代基取代； R3选自环烷基或取代环烷基； 所述取代环烷基独立地被一个或多个选自卤素、 C1-C6烷 基、 C1-C6烷氧基、 三氟甲氧基、 三氟甲基、 硝基、 氨基、 羟基、 C1-C6烷酰氨基、 氰基、 C1-C6烷氨 基或C1-C6烷氧酰基的取代基取代。 2.如权利要求1所述的式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂、 其光学异构体、 溶剂 合物或其药学上可接受的盐， 其中， R3为环烷基， 优选环己烷基。 3.如权利要求1所述的式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂、 其光学异构体、 溶剂 合物或其药学上可接受的盐， 其中， 。

5、R1选自C1-C4烷基、 取代C1-C4烷基、 环烷基、 杂环基或取代杂环基； 所述取代C1-C4烷基独 立地被一个氨基取代； 所述取代杂环基独立地被一个选自C1-C4烷基或苄基的取代基取代； 所述杂环基为吗啉基或四氢吡喃基； 优选地， 所述R1选自杂环基或取代杂环基； 所述取代杂 环基被一个甲基或苄基取代； 所述杂环基为吗啉基或四氢吡喃基； 优选地， 所述R1为吗啉 基； R2选自苯基、 取代苯基、 苄基或取代苄基； 所述取代苯基或取代苄基各自独立地被一个 选自C1-C4烷基或C1-C4烷氧基的取代基取代； 优选地， 所述R2为取代苄基， 所述取代苄基被一 个甲氧基取代。 4.如权利要求3所。

6、述的式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂、 其光学异构体、 溶剂 合物或其药学上可接受的盐， 其中， 所述抑制剂选自式 所示的化合物： 5.一种式 -2所示的制备权利要求4所述的式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂 权利要求书 1/2 页 2 CN 110684022 A 2 的中间体， 其中， R为氨基的保护基， 优选地， R为叔丁氧羰基。 6.一种权利要求1所述的式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂的制备方法， 所述 方法包括如下步骤： 1)式A所示的羧酸或式D所示的酰氯与式B所示的硫代酰胺在催化剂存在下发生缩合反 应生成式C所示的硫代酰亚胺中间体； 2)式C所示的硫代酰亚胺中。

7、间体与式E所示的肼或其盐在碱的催化下， 环合生成式一所 示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂； 反应方程式如下： 7.如权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 步骤1)所述的催化剂为HATU和DIEA， 其 中式A所示的羧酸或式D所示的酰氯与式B所示的硫代酰胺、 HATU和DIEA的摩尔比为1： 1.05- 1.2： 1.05-1.2： 1.05-1.2； 优选地， 步骤2)所述的碱为乙酸钠； 式C所示的硫代酰亚胺中间体与式E所示的肼或其 盐、 碱的摩尔比为1： 1.1-1.3： 1.98-2.6。 8.药物组合物， 包括权利要求1-4任一项所述的式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑 制剂、 。

8、其光学异构体、 溶剂合物或其药学上可接受的盐以及药学可接受的载体或赋形剂。 9.一种权利要求1-4任一项所述的式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂、 其光学 异构体、 溶剂合物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤的药物中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110684022 A 3 SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂及其中间体、 制备方法和用途 技术领域 0001 本发明属于药物化学领域， 具体涉及一种SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂及其中间 体、 制备方法和用途。 背景技术 0002 表观遗传是基因表达的改变不依赖于基因序列的改变， 而是依赖于DNA甲基化和 组蛋白的化学修饰。 遗传突变。

9、、 表观遗传突变、 生活方式和环境因素共同影响着人类的健康 与疾病。 编码表观遗传调控基因的突变在肿瘤发生发展过程中主要体现在组蛋白修饰改 变， DNA启动子高甲基化、 DNA广泛低甲基化和染色质结构异常四个方面。 DNA异常甲基化很 可能会造成抑癌基因转录的抑制、 基因组不稳以及致癌基因的异常激活。 肿瘤中组蛋白修 饰酶的突变， 包含组蛋白甲基化酶、 去甲基化酶、 乙酰化酶突变等， 也会造成基因表达异常 从而决定肿瘤细胞表型。 这些表观遗传变化与肿瘤细胞的生长、 免疫逃逸、 转移、 异质性和 耐药性等直接相关， 甚至导致肿瘤的发生。 针对表观遗传突变的治疗策略成为了新的肿瘤 治疗方向， 多种。

10、表观遗传药物已经开始了临床试验。 另外， 这种治疗策略还在自身免疫、 心 血管疾病、 神经以及发育和衰老等方面也有很大应用前景。 0003 SET8赖氨酸甲基转移酶又称SETD8、 PR-SET7、 KMT5a， 是现今发现唯一能够特异性 单甲基化组蛋白H4赖氨酸20位(histone H4lysine20， H4K20)的赖氨酸甲基转移酶。 SET8通过 对组蛋白甲基化修饰， 参与机体内基因转录调控、 基因组稳定、 细胞周期进程及胚胎发育等 生物学过程。 目前， 国内外多个研究报道了关于SET8赖氨酸甲基转移酶调控肿瘤发生发展 的作用机制。 比如， 研究表明SET8可以通过对非组蛋白Numb。

11、甲基化来调节细胞的凋亡和增 殖。 Li等发现SET8赖氨酸甲基转移酶是Wnt信号通路的传导介质， 对于激活哺乳动物细胞和 斑马鱼中的Wnt报告基因和靶基因至关重要。 Chen等发现， 研究热点miRNA是通过直接靶向 SET8来调节细胞增殖和细胞周期。 SET8不仅参与调控Wnt靶基因表达， 影响Wnt3a介导的胚 胎发育， 还参与Twist调控上皮间质的转化， 从而影响肿瘤的形成和发展。 2016年Moreaux等 首次证明SET8对于多发性骨髓瘤细胞存活的重要性， 提出抑制SET8赖氨酸甲基转移酶是改 善治疗多发性骨髓瘤的潜在策略。 此外， 还有研究指出SET8的表达是胃癌患者的独立预后 。

12、标志物， SET8赖氨酸甲基转移酶的表达水平可以帮助患者确定患有不良疾病的风险。 总之， SET8赖氨酸甲基转移酶在机体生命过程中扮演着重要的角色， 参与调控体内细胞的细胞周 期、 细胞增殖及凋亡等过程， 并与许多肿瘤的发生、 生长、 转移等密切相关。 但是， 靶向SET8 赖氨酸甲基转移酶的化合物报道较少， 因此， 研究出一类新的靶向SET8赖氨酸甲基转移酶 类化合物是目前研究的难点及热点。 发明内容 0004 为了解决现有技术存在的技术问题， 本发明提供了一种新颖结构的SET8赖氨酸甲 基转移酶抑制剂， 该抑制剂对SET8赖氨酸甲基转移酶具有显著的抑制活性， 同时具有显著 地体外抗肿瘤活性。

13、， 可以进一步开发成以SET8为靶标的靶向抗肿瘤药物。 说明书 1/7 页 4 CN 110684022 A 4 0005 本发明其中一个技术方案提供一种式 所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂、 其 光学异构体、 溶剂合物或其药学上可接受的盐， 0006 0007 其中， 0008 R1或R2各自独立地选自C1-C6烷基、 取代C1-C6烷基、 环烷基、 苯基、 取代苯基、 苄基、 取代苄基、 杂环基或取代杂环基； 所述取代C1-C6烷基独立地被一个或多个选自卤素、 硝基、 氨基、 羟基或氰基的取代基取代； 所述取代苯基或取代苄基各自独立地被一个或多个选自 卤素、 C1-C6烷基、 C1-C。

14、6烷氧基、 三氟甲氧基、 三氟甲基、 硝基、 氨基、 羟基、 C1-C6烷酰氨基、 氰 基、 C1-C6烷氨基或C1-C6烷氧酰基的取代基取代； 所述取代杂环基独立地被一个或多个选自 卤素、 C1-C6烷基、 C1-C6烷氧基、 三氟甲氧基、 三氟甲基、 苯基、 苄基、 硝基、 氨基、 羟基、 C1-C6烷 酰氨基、 氰基、 C1-C6烷氨基或C1-C6烷氧酰基的取代基取代； 0009 R3选自环烷基或取代环烷基； 所述取代环烷基独立地被一个或多个选自卤素、 C1- C6烷基、 C1-C6烷氧基、 三氟甲氧基、 三氟甲基、 硝基、 氨基、 羟基、 C1-C6烷酰氨基、 氰基、 C1-C6 烷氨。

15、基或C1-C6烷氧酰基的取代基取代。 0010 进一步改进的方案中， R3为环烷基， 优选环己烷基。 0011 进一步改进的方案中， R1选自C1-C4烷基、 取代C1-C4烷基、 环烷基、 杂环基或取代杂 环基； 所述取代C1-C4烷基独立地被一个氨基取代； 所述取代杂环基独立地被一个选自C1-C4 烷基或苄基的取代基取代； 所述杂环基为吗啉基或四氢吡喃基； 优选地， 所述R1选自杂环基 或取代杂环基； 所述取代杂环基被一个甲基或苄基取代； 所述杂环基为吗啉基或四氢吡喃 基； 优选地， 所述R1为吗啉基； 0012 R2选自苯基、 取代苯基、 苄基或取代苄基； 所述取代苯基或取代苄基各自独立。

16、地被 一个选自C1-C4烷基或C1-C4烷氧基的取代基取代； 优选地， 所述R2为取代苄基， 所述取代苄基 被一个甲氧基取代。 0013 进一步改进的方案中， 所述抑制剂选自式 所示的化合物： 0014 0015 本发明另一个技术方案提供一种式 -2所示的制备式 所示的SET8赖氨酸甲基转 移酶抑制剂的中间体， 说明书 2/7 页 5 CN 110684022 A 5 0016 0017 其中， R为氨基的保护基， 优选地， R为叔丁氧羰基。 0018 本发明另一个方案提供一种式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂的制备方 法， 所述方法包括如下步骤： 0019 1)式A所示的羧酸或式D所示。

17、的酰氯与式B所示的硫代酰胺在催化剂存在下发生缩 合反应生成式C所示的硫代酰亚胺中间体； 0020 2)式C所示的硫代酰亚胺中间体与式E所示的肼或其盐在碱的催化下， 环合生成式 一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂； 0021 反应方程式如下： 0022 0023 进一步改进的方案中， 步骤1)所述的催化剂为HATU和DIEA， 其中式A所示的羧酸或 式D所示的酰氯与式B所示的硫代酰胺、 HATU和DIEA的摩尔比为1： 1.05-1.2： 1.05-1.2： 1.05-1.2； 0024 优选地， 步骤2)所述的碱为乙酸钠； 式C所示的硫代酰亚胺中间体与式E所示的肼 或其盐、 碱的摩尔比为1。

18、： 1.1-1.3： 1.98-2.6 0025 本发明另一个方案提供一种式 所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂的制备方 法， 所述方法包括如下步骤： 0026 1)式 -4所示的化合物和2-(4-甲氧基苯基)硫代乙酰胺在催化剂存在下反应制备 式 -1所示的中间体； 0027 2)式 -1所示的中间体和环己基肼或其盐在碱的催化下， 反应生成式 -2所示的中 间体； 0028 3)脱去式 -2所示的中间体的保护基R， 制备式 所示的化合物； 说明书 3/7 页 6 CN 110684022 A 6 0029 反应方程式如下： 0030 0031 其中， R为氨基的保护基， R1为Cl或OH。 。

19、0032 进一步改进的方案中， 步骤1)所述的催化剂为HATU和DIEA， 其中 -4所示的化合 物、 2-(4-甲氧基苯基)硫代乙酰胺与HATU和DIEA的摩尔比为1： 1.05-1.2： 1.05-1.2： 1.05- 1.2； 0033 优选地， 步骤2)所述的碱为乙酸钠； -1所示的中间体与环己基肼或其盐、 碱的摩 尔比为1： 1.1-1.3： 1.98-2.6。 0034 进一步改进的方案中， 步骤2)所述的反应溶剂是体积比为1： 0.8-2的乙酸和1， 4- 二氧六环的混合液； 步骤3)具体为在苯甲醚存在下， 用浓度为3-5M的氯化氢1， 4-二氧六环 溶液脱去保护基。 0035 。

20、本发明另一方面提供一种药物组合物， 包括式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑 制剂、 其光学异构体、 溶剂合物或其药学上可接受的盐以及药学可接受的载体或赋形剂。 0036 本发明式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂或其药学可接受的盐还可以以 晶体存在， 本发明包含式I所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂、 其光学异构体、 溶剂合物 或可接受的盐的任意晶型。 0037 本发明式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂、 其光学异构体、 溶剂合物或可 接受的盐可以通过以下途径给药： 局部、 静脉内、 口服、 皮下、 等。 0038 本发明的式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂、 其光学异构体。

21、、 溶剂合物或 其药学上可接受的盐可根据给药途径配成各种适宜的剂型。 0039 当口服用药时， 本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式， 包括但不限于 片剂、 胶囊、 颗粒剂。 其中， 载体或赋形剂包括但不限于作为填充剂的乳糖、 葡萄糖、 微晶纤 维素等； 作为粘合剂的羧甲基纤维素、 聚维酮、 甲基纤维素等； 作为崩解剂的羧甲基纤维素 钠、 交联聚维酮等； 作为润滑剂的硬脂酸镁、 滑石粉、 二氧化硅等。 0040 当皮肤局部施用时， 本发明化合物可制成适当的软膏等制剂形式， 载体或赋形剂 选自凡士林、 丙二醇、 聚氧化乙烯等。 说明书 4/7 页 7 CN 110684022 A 7 00。

22、41 本发明式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂、 其光学异构体、 溶剂合物或其 药学上可接受的盐还可以无菌注射制剂形式用药， 包括无菌注射液， 也可以是冻干形式。 其 中， 可使用的载体和溶剂包括水、 等渗氯化钠溶液等。 0042 本发明另一方面提供的式一所示的SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂、 其光学异构 体、 溶剂合物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤的药物中的应用。 尤其是在制备以 SET8为靶标的靶向抗肿瘤药物方面的应用。 所述肿瘤包括但不限于例如肝癌、 神经胶质瘤、 结直肠癌、 胃癌、 乳腺癌、 黑色素瘤、 肺癌、 前列腺癌、 胰腺癌、 膀胱癌、 肾癌、 多发性骨髓瘤、 宫颈癌等。

23、。 0043 本发明首次合成和鉴定一种SET8赖氨酸甲基转移酶抑制剂。 其体外活性评价结果 表明： 该抑制剂对SET8赖氨酸甲基转移酶具有显著的抑制活性， 同时具有显著地体外抗肿 瘤活性， 毒性低， 可以进一步开发成以SET8赖氨酸甲基转移酶为靶标的靶向抗肿瘤药物。 具体实施方式 0044 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领域技术人员将会 理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体 条件者， 按照常规条件或制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为 可以通过市购获得的常规产品。 且在计算各物质的用量或产率时。

24、， 部分数据是进行了进位 处理。 0045 实施例1： 制备2-(2-(4-甲氧基苯基)硫代乙酰基)氨基甲酰基)吗啉-4-羧酸叔丁 酯(式II) 0046 0047 将原料4-(叔丁氧基羰基)吗啉-2-羧酸(1.0mmol， 231mg)、 2-(7-氧化苯并三氮 唑)-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU， 1.1mmol， 418mg)溶于4mL干燥的二氯甲烷中， 氮气保护、 室温下搅拌20分钟后， 向上述体系中加入原料2-(4-甲氧基苯基)硫代乙酰胺 (1.1mmol， 199mg)， 继续搅拌1小时后， 将N,N-二异丙基乙胺(DIEA， 1.1mmol， 142mg)滴入上 。

25、述反应体系后， 继续在氮气保护、 室温下搅拌反应2天。 反应液用50mL乙酸乙酯稀释后， 依次 用20mL水、 饱和氯化钠溶液洗涤后， 无水硫酸钠干燥， 浓缩反应液后， 柱层析分离V(石油 醚):V(乙酸乙酯)5:1-2:1， 得134mg淡黄色油状物II， 产率34。 1H NMR(400MHz,CDCl3): 10.25(s,1H),7.25(d,J8.7Hz,2H),6.85(d,J8.7Hz,2H).,4.614.52(m,2H),4.28 (brs,1H),4.003.93(m,3H),3.79(s,3H),3.58(td,J11.8,2.8Hz,1H),2.91-2.79(m, 2。

26、H),1.47(s,9H)。 0048 实施例2制备2-(1-环己基-3-(4-甲氧基苄基)-1H-1,2,4-三唑-5-基)吗啉-4-羧 酸叔丁酯(式III) 说明书 5/7 页 8 CN 110684022 A 8 0049 0050 将式II(0.16mmol， 63mg)、 环己基肼盐酸盐(0.2mmol， 30mg)、 乙酸钠(0.36mmol， 30mg)依次溶于1mL乙酸和1mL 1,4-二氧六环的混合溶剂中后， 进行封口， 然后在80加热 下反应至II反应完全。 反应液用30mL乙酸乙酯稀释后， 依次用20mL饱和碳酸钠溶液、 饱和氯 化钠溶液洗涤后， 无水硫酸钠干燥， 浓缩反。

27、应液后， 柱层析分离V(石油醚):V(乙酸乙酯) 3:1-1:1， 得40mg淡黄色油状物III， 产率55。 0051 实施例3制备2-(1-环己基-3-(4-甲氧基苄基)-1H-1,2,4-三唑-5-基)吗啉(式I) 0052 将式III(0.09mmol， 41mg)、 苯甲醚(0.1mmol， 11mg)、 0.5mL氯化氢的1,4-二氧六环 溶液(4M)依次溶于3mL二氯甲烷中后， 封口反应3天， 至III反应完全。 蒸干反应液得黄色油 状物， 将油状物用30mL乙酸乙酯稀释后， 用20mL饱和碳酸钠溶液洗涤后， 无水硫酸钠干燥， 浓缩反应液后， 柱层析分离V(氨的二氯甲烷溶液):V。

28、(甲醇)25:1-20:1， 得26mg黄色油 状物I， 产率81。 0053 1H NMR(400MHz,CDCl3): 7.25-7.23(m,2H),6.82-6.80(m,2H),4.67-4.64(m,2H), 4.28-4.21(m,2H),3.98(s,2H),3.85-3.79(m,1H),3.77(s,3H),3.73-3.67(m,1H),3.31- 3.25(m,1H),3.19-3.15(m,1H),3.01-2.87(m,2H),1.98-2.85(m,6H),1.73-1.70(m,1H), 1.40-1.26(m,4H).13C NMR(400MHz,CDCl3)。

29、: 161.8,158.1,152.0,130.7,129.9,113.8, 70.0,67.4,58.0,55.3,48.9,45.6,33.9,33.0,32.9,25.7,25.1.ESI-MS:m/z 357.2M+H+。 0054 实验例1式I化合物体外抑制赖氨酸甲基转移酶SET8的活性 0055 活性检测的步骤完全根据Cayman公司SET8甲基转移酶抑制剂筛选试剂盒操作。 简 单来说， 按照下表将试剂盒中的试剂加入96孔板中待测。 0056 0057 之后， 每孔加入10 L SET8蛋白， 反应开始。 37孵育10分钟后， 在激发波长535nm 和吸收波长590nm处测定荧光强。

30、度(A)值。 按下述公式计算化合物的抑制率： 抑制率 (A正 常-A样 品)/)正 常*100。 0058 结果表明， 化合物对赖氨酸甲基转移酶具有显著的抑制作用(抑制率70.0)。 0059 实验例2式I化合物的抗肿瘤活性研究 0060 1、 实验方法： 将神经胶质瘤细胞株SH-SY5Y、 结直肠癌细胞株SW480、 肝癌细胞株 HepG2分别用含10小牛血清的RPMI-1640培养基， 在37、 5CO2培养箱中培养。 采用CCK- 说明书 6/7 页 9 CN 110684022 A 9 9法进行细胞增殖抑制试验， 主要操作为： 取对数生长期的肿瘤细胞株， 用0.25的胰蛋白 酶消化， 。

31、10新生小牛血清的RPMI-1640培养液调制成6104个/mL的细胞悬液， 接种于96 孔板中， 每孔接种100 L。 在37， 5CO2饱和湿度条件下培养12h。 待其贴壁后， 吸弃孔内培 养上清液， 每个孔加入用含1小牛血清的RPMI-1640培养基配制的样品液， 使得样品终浓 度分别为100 M、 30 M、 10 M、 3 M、 1 M和0.3 M。 每个浓度平行3孔， 继续培养48h后， 每孔加入 10 L CCK-8溶液(大连美仑， MA0218)， 在37， 5CO2条件下继续温育4h。 在酶联免疫检测 仪上选择470nm， 测定各孔的吸光值， 同时设置空白组(仅加入含细胞的培。

32、养液)和对照组 (以培养液替代药物)， 计算细胞增殖抑制率。 抑制率()(1-实验组3孔OD值平均值/对照 组3孔OD值平均值)100。 以抑制率作纵坐标， 作回归曲线， 计算出样品IC50值。 采用 Graphpad prism 7.0软件进行数据处理及统计分析。 0061 2、 抗肿瘤活性实验结果 0062 式I化合物对神经胶质瘤细胞株SH-SY5Y、 结直肠癌细胞株SW480和肝癌细胞株 HepG2的IC50和100 M时IC的结果见表1。 0063 表1式I化合物的抗肿瘤活性 0064 0065 从表中可以看出， 式I化合物对神经胶质瘤细胞株SH-SY5Y、 结直肠癌细胞株SW480 和肝癌细胞株HepG2显示良好的肿瘤细胞增殖抑制活性。 说明书 7/7 页 10 CN 110684022 A 10 。