培养基及利用其培养基进行胚胎质量的评估方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911063474.X (22)申请日 2019.10.31 (71)申请人 深圳中山泌尿外科医院 地址 518000 广东省深圳市福田区福强路 1001号 (72)发明人 曾勇姚志鸿熊风孙青 李观贵陈培林钟惠娴万才云 彭晓琪周灿权 (74)专利代理机构 北京轻创知识产权代理有限 公司 11212 代理人 厉洋洋 (51)Int.Cl. C12N 5/073(2010.01) G01N 33/68(2006.01) (54)发明名称 一种培养基及利用其培养基进行胚胎质量 的。

2、评估方法 (57)摘要 本发明属于蛋白检测领域， 具体涉及一种培 养基及利用其培养基进行胚胎质量的评估方法。 所述培养基， 包括胎牛血清蛋白、 胰岛素-转铁蛋 白-硒添加剂和嘌呤霉素。 本发明利用培养基进 行胚胎质量的评估方法,依次通过胚胎培养与胚 胎条件培养液的收集、 解冻胚胎条件培养液、 培 养子宫内膜基质细胞、 添加胚胎条件培养液和蛋 白检测， 得到具体的细胞分泌蛋白的差异蛋白， 从而对胚胎质量进行评估。 本发明的评估方法十 分的有效和准确， 弥补了市面上的空白。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 110684721 A 2020.01.14 CN 110684721 A 1.。

3、一种培养基， 其特征在于， 包括胎牛血清蛋白、 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉 素， 所述胎牛血清蛋白、 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素的质量比为1979:20:1。 2.根据权利要求1所述的培养基， 其特征在于， 所述胎牛血清蛋白的浓度为10g/dl， 所述胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的浓度为1g/dl， 所述嘌呤霉素的浓度为500ng/mL。 3.一种利用权利要求1或2所述的培养基进行胚胎质量的评估方法， 其特征在于,包括 以下步骤： A、 胚胎培养与胚胎条件培养液的收集： 取囊胚培养液微滴， 取受精卵采用序贯培养液 进行胚胎培养得到胚胎， 所述胚胎在胚胎培养2天后按照10： (1。

4、2)的体积比添加所述囊胚 培养液微滴培养3天， 得到胚胎条件培养液并于-70-80下保藏310天； B、 解冻子宫内膜基质细胞： 将冷冻于液氮罐中的子宫内膜基质细胞于3440下解冻 后按照1： (35)的体积比加入所述培养基， 接着在10001200r/min的转速下离心2 4min， 弃去上清液后加入1ml所述培养基， 重悬培养液得到重悬细胞液； C、 培养子宫内膜基质细胞： 将步骤B中的重悬细胞液加入4.55.5ml所述培养基， 然后 将重悬细胞液中内的细胞按照十字混匀法均匀铺开， 接着在37和5CO2的培养箱中孕育 46个小时， 再然后弃去培养液且用PBS冲洗后加入4.55.5ml所述培。

5、养基， 再接着放入到 37和5CO2的培养箱中孕育23天后用胰蛋白酶进行消化， 并培养于48孔细胞培养板 中， 所述48孔细胞培养板中每孔细胞数为5104个， 置于37和5CO2的培养箱中培养至培 养板中细胞汇合度达到90以上， 更换为胎牛血清蛋白含量为2的完全培养液； D、 添加胚胎条件培养液： 将步骤C中的所述完全培养液弃去， 用PBS冲洗12次后每个 孔均加入179180 L的所述培养基和1822 L的步骤A中的胚胎条件培养液得到混合液， 接着静置4649h后收集所述混合液中的细胞上清液即得到子宫内膜细胞分泌蛋白； E、 蛋白检测： 将步骤D中的细胞上清液用采用激光扫描仪InnoScan。

6、 300扫描信号， 得到 子宫内膜细胞分泌蛋白的差异蛋白从而判断胚胎质量。 4.根据权利要求3所述的胚胎质量的评估方法， 其特征在于,所述囊胚培养液微滴的制 备方法为在培养皿中滴入2530 l的培养液， 接着在培养液中添加细胞培养油至细胞培养 油覆盖所述培养液静置1天得到。 5.根据权利要求5所述的胚胎质量的评估方法， 其特征在于,取受精卵采用序贯培养液 进行胚胎培养的具体步骤为： 在静置培养的第一天， 受精卵采用受精卵培养基， 静置培养的 第二天至第三天， 受精卵采用卵裂期胚胎培养液， 静置培养的第四天至第五天， 受精卵采用 囊胚培养液。 6.根据权利要求3所述的胚胎质量的评估方法， 其特征。

7、在于,在步骤A中， 所述胚胎在胚 胎培养2天后于2530 l囊胚培养液微滴中培养3天。 7.根据权利要求3所述的胚胎质量的评估方法， 其特征在于,在步骤B中， 将子宫内膜基 质细胞于37下解冻后按照1： 4的体积比加入所述培养基， 接着在1000r/min的转速下离心 3min， 弃去上清液后加入1ml所述培养基得到重悬细胞液。 8.根据权利要求3所述的胚胎质量的评估方法， 其特征在于,在步骤C中， 将步骤B中的 重悬细胞液按照1： 4的体积比加入培养基， 在37和5CO2的培养箱中孕育6个小时。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110684721 A 2 一种培养基及利用其培养基进行胚胎质。

8、量的评估方法 技术领域 0001 本发明属于蛋白检测领域， 具体的涉及一种培养基及利用其培养基进行胚胎质量 的评估方法。 背景技术 0002 胚胎条件培养液简称BCM， 是一种含有胚胎的培养液。 体外受精胚胎移植(invi trofertilizationandembryotransfer， IVF-ET)是目前治疗不孕症最好的方法。 胚胎现有 的评估方法主要根据细胞数目， 碎片和均匀度等形态学参数进行胚胎评分， 但在实际操作 过程中发现， 该方法进行胚胎评级时受人为主观因素影响较大， 经常存在着评分不一致的 现象。 而为进一步提高成功率和降低多胎妊娠率， 需采用一种更为科学的方法鉴别胚胎质 。

9、量， 以便在保证一定妊娠率的情况下减少移植胚胎的数量和次数。 胚胎作为一种有分泌活 性的生物体， 大量的研究表明， 种植前的胚胎能够分泌不同的配体分子， 配体分子包括生长 因子， 细胞因子和激素类分子等。 而有相关学者发现了胚胎的分泌活性与其种植潜能可能 具有相关性。 0003 但由于BCM中外加蛋白的含量往往显著高于胚胎自身分泌的蛋白数量， 目前直接 定量检测如质谱法和酶联免疫法等对BCM进行检测也无法检出明确的胚胎源性信号分子或 仅能实现部分信源分子的检出。 所以检测BCM中的胚胎信号分子难度较大， 直接对BCM中胚 胎分泌信号分子检测无法取得良好的成果。 而子宫内膜基质细胞又称HESC作。

10、为胚胎植入重 要的接受环境， 在自然生理过程中， 卵子或精子均不能单独引起子宫内膜的变化， 只有在精 卵结合并发育成胚胎， 才能启动子宫内膜一系列的形态及分子响应， 为胚胎种植做准备。 这 提示胚胎信号可以作为植入发生的起始信号， 可能扮演着 “导火索” 的角色， 主要功能并不 是直接的效应作用， 而是作用于母体子宫内膜， 引起生物信号由 “点”“线”“面” 到 “体” 的全 面响应。 而且这种响应可能与BCM对应胚胎的质量及种植潜能密切相关。 而现有技术中缺少 一种利用BCM进行胚胎的质量评估的方法。 发明内容 0004 本发明为了解决上述背景技术中缺少一种利用BCM进行胚胎的质量评估的方法。

11、的 技术问题， 提供能够有效进行胚胎质量评估的一种培养基及利用其培养基进行胚胎质量的 评估方法。 0005 本发明解决上述技术问题的技术方案如下： 一种培养基， 包括胎牛血清蛋白、 胰岛 素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素， 所述胎牛血清蛋白、 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌 呤霉素的质量比为1979:20:1。 0006 本发明的有益效果是： 上述培养基的营养成份能够很好的用于胚胎条件培养液的 培养。 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂采用赛默飞官网订购的41400045型号的Insulin , Transferrin,SeleniumSolution(ITS-G),100X。 胎牛血清蛋白采购来自上。

12、海信帆生物科技 有限公司。 上述培养基的制备方法为： 取10g的Sigma-Aldrich中国官网上购买的Sigma， 说明书 1/4 页 3 CN 110684721 A 3 D2906-1L型粉末， 补充1.5g碳酸氢钠， 溶于纯净水后过滤取滤液， 然后向滤液中添加1浓 度的胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素配置为培养基。 添加10浓度的胎牛血清蛋白 及1浓度的青链霉素配置为完全培养基即所需要的培养基。 0007 在上述技术方案的基础上， 本发明还可以做如下改进。 0008 进一步， 所述胎牛血清蛋白的浓度为10g/dl， 所述胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂 的浓度为1g/dl， 所述嘌呤霉。

13、素的浓度为500ng/mL。 0009 采用上述进一步方案的有益效果是， 确定的浓度能够让得到的培养基效果更好。 0010 本发明还提供一种利用上述所述的培养基进行胚胎质量的评估方法， 包括以下步 骤： 0011 A、 胚胎培养与胚胎条件培养液的收集： 取囊胚培养液微滴， 取受精卵采用序贯培 养液进行胚胎培养得到胚胎， 所述胚胎在胚胎培养2天后按照10： (12)的体积比添加所述 囊胚培养液微滴培养3天， 得到胚胎条件培养液并于-70-80下保藏310天； 0012 B、 解冻子宫内膜基质细胞： 将冷冻于液氮罐中的子宫内膜基质细胞于3440下 解冻后按照1： (35)的体积比加入所述培养基， 。

14、接着在10001200r/min的转速下离心2 4min， 弃去上清液后加入1ml所述培养基， 重悬培养液得到重悬细胞液； 0013 C、 培养子宫内膜基质细胞： 将步骤B中的重悬细胞液加入4.55.5ml所述培养基， 然后将重悬细胞液中内的细胞按照十字混匀法均匀铺开， 接着在37和5CO2的培养箱中 孕育46个小时， 再然后弃去培养液且用PBS冲洗后加入4.55.5ml所述培养基， 再接着放 入到37和5CO2的培养箱中孕育23天后用胰蛋白酶进行消化， 并培养于48孔细胞培养 板中， 所述48孔细胞培养板中每孔细胞数为5104个， 置于37和5CO2的培养箱中培养至 培养板中细胞汇合度达到9。

15、0以上， 更换为胎牛血清蛋白含量为2的完全培养液； 0014 D、 添加胚胎条件培养液： 将步骤C中的所述完全培养液弃去， 用PBS冲洗12次后 每个孔均加入179180 L的所述培养基和1822 L的步骤A中的胚胎条件培养液得到混合 液， 接着静置4649h后收集所述混合液中的细胞上清液即得到子宫内膜细胞分泌蛋白； 0015 E、 蛋白检测： 将步骤D中的细胞上清液用采用激光扫描仪InnoScan300扫描信号， 得到子宫内膜细胞分泌蛋白的差异蛋白从而判断胚胎质量。 0016 本发明的有益效果： 由于不同类型不同丰度信号分子刺激产生不同的细胞学响 应， 且信号传递过程中存在级联放大效应。 即。

16、将胚胎条件培养液中未知的、 低丰度的、 检测 困难的信号分子作用于重悬细胞液及子宫内膜基质细胞后， 相当于初级信号经过逐级级联 放大(Cascadeamplification)， 翻译为可知的、 高丰度的、 容易检测的次级信号。 所以胚胎 条件培养液可以通过影响子宫内膜基质细胞的分泌活性， 从而改变子宫内膜基质细胞的分 泌蛋白种类。 所以我们可以将含有不同胚胎分泌信号的胚胎条件培养液作为培养基添加剂 添加至子宫内膜基质细胞的培养基中刺激子宫内膜基质细胞的发育， 然后对子宫内膜基质 细胞上清液中的细胞分泌蛋白采用激光扫描仪InnoScan300扫描信号， 得到具体的细胞分 泌蛋白的差异蛋白， 从。

17、而对胚胎质量进行评估。 本发明的评估方法十分的有效和准确， 弥补 了市面上的空白。 受精卵和冷冻于液氮罐中的子宫内膜基质细胞均是现有的且来自深圳中 山泌尿外科医院。 0017 进一步， 所述囊胚培养液微滴的制备方法为在培养皿中滴入2530 l的培养液， 接着在培养液中添加细胞培养油至细胞培养油覆盖所述培养液静置5天得到。 说明书 2/4 页 4 CN 110684721 A 4 0018 采用上述进一步方案的有益效果是， 囊胚培养液微滴上的细胞培养油能够起到隔 绝胚胎培养液与外界物理接触， 同时气体可通过培养油输送至囊胚培养液。 0019 进一步， 取受精卵采用序贯培养液进行胚胎培养的具体步骤。

18、为： 在静置培养的第 一天， 受精卵采用受精卵培养基， 静置培养的第二天至第三天， 受精卵采用卵裂期胚胎培养 液， 静置培养的第四天至第五天， 受精卵采用囊胚培养液。 0020 采用上述进一步方案的有益效果是， 能够让受精卵顺利的形成胚胎。 0021 进一步， 在步骤A中， 所述胚胎在胚胎培养2天后按照10： 2的体积比囊胚培养液微 滴中培养3天。 0022 采用上述进一步方案的有益效果是， 确定的比例能够让最后差异蛋白的检测更加 准确从而更好的判断胚胎质量。 0023 进一步， 在步骤B中， 将子宫内膜基质细胞于37下解冻后按照1： 4的体积比加入 所述培养基， 接着在1000r/min的转。

19、速下离心3min。 0024 采用上述进一步方案的有益效果是， 确定的比例能够让最后差异蛋白的检测更加 准确从而更好的判断胚胎质量。 0025 进一步， 在步骤C中， 将步骤B中的重悬细胞液按照1： 4的体积比加入培养基， 在37 和5CO2的培养箱中孕育6个小时。 0026 采用上述进一步方案的有益效果是， 上述条件有利于更好的判断胚胎质量。 附图说明 0027 图1为本发明子宫内膜细胞分泌蛋白的差异蛋白测试图； 具体实施方式 0028 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述， 所举实例只用于解释本发明， 并 非用于限定本发明的范围。 0029 实施例1、 0030 一种培养基， 包括胎牛。

20、血清蛋白、 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素， 所述胎 牛血清蛋白、 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素的质量比为1979:20:1。 0031 可选的， 所述胎牛血清蛋白的浓度为10g/dl， 所述胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂 的浓度为1g/dl， 所述嘌呤霉素的浓度为500ng/mL。 0032 一种利用上述所述的培养基进行胚胎质量的评估方法， 包括以下步骤： 0033 A、 胚胎培养与胚胎条件培养液的收集： 取30 L的优质囊胚的囊胚培养液微滴， 取 10g受精卵采用序贯培养液进行胚胎培养得到胚胎， 所述胚胎在胚胎培养2天后按照10： 1的 体积比添加所述囊胚培养液微滴培养3天， 得。

21、到胚胎条件培养液并于-80下保藏3天； 0034 B、 解冻子宫内膜基质细胞： 将10mg的冷冻于液氮罐中的子宫内膜基质细胞于34 下解冻后按照1： 2的体积比加入所述培养基， 接着在1000r/min的转速下离心2min， 弃去上 清液后加入1ml所述培养基， 重悬培养液得到重悬细胞液； 0035 C、 培养子宫内膜基质细胞： 将步骤B中的重悬细胞液加入4.55.5ml的所述培养 基， 然后将重悬细胞液中内的细胞按照十字混匀法均匀铺开， 接着在37和5CO2的培养 箱中孕育6个小时， 再然后弃去培养液且用PBS冲洗后4.5ml所述培养基， 再接着放入到37 说明书 3/4 页 5 CN 11。

22、0684721 A 5 和5CO2的培养箱中孕育2天后用胰蛋白酶进行消化， 并培养于48孔细胞培养板中， 48孔细 胞培养板中每孔细胞数为5104个， 置于37和5CO2的培养箱中培养至培养板中细胞汇 合度达到90以上， 更换为胎牛血清蛋白含量为2的完全培养液； 0036 D、 添加胚胎条件培养液： 将步骤C中的所述完全培养液弃去， 用PBS冲洗2次后每个 孔均加入180 L的所述培养基和20 L的步骤A中的胚胎条件培养液得到混合液， 接着静置 48h后收集所述混合液中的细胞上清液即得到子宫内膜细胞分泌蛋白； 0037 E、 蛋白检测： 将步骤D中的细胞上清液用采用激光扫描仪InnoScan3。

23、00扫描信号， 得到子宫内膜细胞分泌蛋白的差异蛋白从而判断胚胎质量。 0038 实施例2、 0039 与实施例1不同是， 在步骤A中， 取30 L的无囊胚形成的囊胚培养液微滴。 0040 实施例3、 0041 与实施例1不同是， 在步骤A中， 取30 L的未培养过囊胚的囊胚培养液。 0042 综合实施例1至实施例3， 得到了如图1所示的子宫内膜细胞分泌蛋白的差异蛋白 测试图。 通过蛋白芯片检测培养优质囊胚的囊胚培养液微滴中IL-6含量， 荧光信号值为 1843.0； 而无囊胚形成的囊胚培养液微滴检测IL-6的荧光信号值为1080.5； 未培养过囊胚 的囊胚培养液微滴检测IL-6的荧光信号值则为。

24、478.4。 这表明不同囊胚质量的BCM诱导子宫 内膜细胞分泌IL-6含量可作为胚胎质量评定的依据， 成为一种新型的无创胚胎质量评定方 法。 0043 在本说明书的描述中， 术语 “一个实施例” 、“一些实施例” 、“具体实施例” 等的描述 意指结合该实施例或示例描述的具体特征、 结构、 材料或特点包含于本发明的至少一个实 施例或示例中。 在本说明书中， 对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实 例。 而且， 描述的具体特征、 结构、 材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以 合适的方式结合。 0044 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和 原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 110684721 A 6 图1 说明书附图 1/1 页 7 CN 110684721 A 7 。