MS2蛋白纳米颗粒耦连单羧基酞菁锌的制备方法和在抗乳腺癌上的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911203934.4 (22)申请日 2019.11.29 (71)申请人 福州大学 地址 350108 福建省福州市闽侯县福州大 学城乌龙江北大道2号福州大学 (72)发明人 黄明东郭楠楠李林林袁彩 江龙光 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 饶文君蔡学俊 (51)Int.Cl. A61K 47/64(2017.01) A61K 47/69(2017.01) A61K 41/00(2020.01) A61P 35/00(2006.0。

2、1) (54)发明名称 一种MS2蛋白纳米颗粒耦连单羧基酞菁锌的 制备方法和在抗乳腺癌上的应用 (57)摘要 本发明公开了一种MS2蛋白纳米颗粒耦连单 羧基酞菁锌的制备方法和在抗乳腺癌上的应用， 将单羧基酞菁锌通过共价耦连的方式结合在MS2 蛋白纳米粒表面， 具有水溶性好， 载药量高， 均匀 和稳定的特征。 酞菁化合物的疏水性导致其在生 理环境中聚集， 影响了它们的光物理 （降低的1O2 形成） 、 化学 （降低的溶解度） 和生物学 （不充分的 肿瘤定位） 性质， 降低其光动力疗法 （PDT） 功效。 通过这种纳米共价耦连提高了酞菁锌对乳腺癌 的药效， 纳米颗粒可以显著改善单羧基的溶解 度， 。

3、并提供适当的粒径和表面性能， 延长血液循 环， 从而允许通过增强的渗透性和保留效应 （EPR） 的肿瘤的选择性累积， 在乳腺癌的应用中 具有良好的效果。 权利要求书1页 说明书6页 附图7页 CN 110841073 A 2020.02.28 CN 110841073 A 1.一种MS2蛋白纳米颗粒耦连单羧基酞菁锌纳米制剂的制备方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： （1） 以单羧基酞菁锌为原料药， 以MS2蛋白纳米颗粒为载药辅料， 将溶解于有机相中的 单羧基酞菁锌利用羧基活化剂进行羧基活化后， 之后与溶解于水相中的MS2蛋白纳米粒表 面的氨基发生酰胺反应， 将单羧基酞菁锌耦连在MS2蛋白纳米。

4、粒的表面； （2） 将反应后的纳米颗粒透析除杂、 浓缩、 过滤除菌后制得MS2蛋白纳米颗粒耦连单羧 基酞菁锌的纳米制剂。 2.一种MS2蛋白纳米颗粒耦连单羧基酞菁锌纳米制剂的制备方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： （1） 将单羧基酞菁锌溶解于有机相中， 浓度为0.5100 mol/L， 并用终浓度为2400 mol/L的羧基活化剂在室温下进行活化,活化148小时; （2） 室温下,将溶解于磷酸盐溶液中的MS2蛋白纳米粒加入至步骤 （1） 活化结束的酞菁 锌溶液里， 反应148小时， 得到MS2-CPZ纳米粒粗品， 酞菁锌和MS2的反应浓度比为： 5100： 1， 有机相和水相体积比为1： 。

5、110； （3） 将步骤 （2） 粗品离心除去沉淀， 离心去沉淀的条件为100010000 rpm离心1050 min， 剩下的上清液透析换液至0.1 M， pH7.4的磷酸盐溶液中， 之后再离心去除沉淀得到上 清液； （4） 将步骤 （3） 得上清液用3100 kDa截留率的浓缩管进行浓缩， 无菌滤膜抽滤除菌； 制 得MS2蛋白纳米颗粒耦连单羧基酞菁锌的纳米制剂； 步骤 （1） - （4） 中搅拌速度均为5001000 rpm。 3.根据权利要求1或2任意所述的制备方法， 其特征在于， 所述羧基活化剂包括1-(3-二 甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、 1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基。

6、碳二亚胺、 二环己基碳 二亚胺、 二异丙基碳二亚胺、 N-羟基丁二酰亚胺、 1-羟基苯并三唑、 O-苯并三氮唑-四甲基脲 六氟磷酸盐、 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸盐、 N,N-二异丙基乙胺 中的一种或多种。 4.根据权利要求1或2任意所述的制备方法， 其特征在于， 所述有机相包括丙酮、 甲醇、 DMSO、 DMF中的任意一种， 所述的水相为磷酸盐缓冲液。 5.据权利要求1或2任意所述的制备方法， 其特征在于， 制备得到的纳米制剂的摩尔比 不大于6。 6.一种如权利要求1或2任意所述的纳米制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 11。

7、0841073 A 2 一种MS2蛋白纳米颗粒耦连单羧基酞菁锌的制备方法和在抗 乳腺癌上的应用 技术领域 0001 本发明涉及单羧基酞菁锌， 特别是涉及一种水溶性的单羧基酞菁锌纳米颗粒的制 备及其在制备抗乳腺癌上药物中的应用。 背景技术 0002 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。 随着经济和社会的迅速发展， 乳腺癌的发 病率在发展中国家中逐年递增近年来， 其发病率呈现出显着的上升趋势。 乳腺癌是一种有 高度异质性的恶性肿瘤， 其类型多样， 不同类型的乳腺癌其治疗和预后存在明显差异。 三阴 性乳腺癌在乳腺癌中占约15%， 且在年轻女性患者中更为常见。 三阴性乳腺癌定义为乳腺癌 细胞中缺乏三种受。

8、体， 即雌激素受体， 孕激素受体和人表皮生长因子受体。 不幸的是， 三阴 性乳腺癌具有高度异质性、 极端攻击性以及没有明确的靶点， 包括化疗， 放射和手术切除等 常规治疗， 都不能取得良好的预后效果。 0003 光动力疗法 （PDT） 是一种临床使用的微创治疗方法。 光动力学疗法通过光敏剂在 肿瘤组织中有效聚集、 经适当波长的光照射以激发光敏剂与组织中的氧反应， 产生活性氧 （单线态氧或自由基氧） 等细胞毒性剂， 从而杀死肿瘤细胞， 达到治疗肿瘤目的。 PDT具有毒 副作用小， 可消灭隐性癌病灶、 对正常组织损伤很小、 无耐药性、 可以重复治疗等一系列优 点。 目前， 光敏剂研究最多的是卟啉类。

9、衍生物和酞菁类衍生物。 然而， 随着研究的深入， 人们 发现酞菁类衍生物有着明显的优势： 酞菁类光敏剂最大吸收波长在600800 nm范围内， 适 于光动力治疗， 且具有摩尔吸光系数较高、 单线态氧量子产率高、 组分单一等优点。 因此， 酞 菁类光敏剂被认为是最有发展前景的光敏剂之一。 在诸多的金属酞菁类化合物中， 插入金 属锌离子的光敏剂可以改良自身的光物理和光化学性质， 使它具有更高的单线态氧产率, 因此也被广泛的研究。 光敏剂酞菁锌能够以微摩尔效力的杀死肿瘤细胞， 但是由于酞菁锌 本身的水溶性差、 体内半衰期短、 对正常组织细胞有毒副作用、 在肿瘤组织积累量少等缺 点， 在一定程度上限制。

10、酞菁锌在临床中的应用。 发明内容 0004 本发明通过对酞菁锌进行改造， 从而获得亲水性的高效光敏剂。 本实验室合成的 2-单羧基取代酞菁锌 （CPZ， 图1） ， 可以通过耦连的方式与多肽、 蛋白生成酰胺键进行连接， 从而改善酞菁锌的水溶性。 0005 为了对周围健康组织的附带损害的最小化， 肿瘤中光敏剂的选择性积累对于有效 的光动力疗法是至关重要的。 纳米颗粒可以增加疏水治疗或PDT试剂的溶解度， 并提供适当 的大小和表面性能， 延长血液循环， 从而允许通过增强的渗透性和保留 （EPR） 效应的肿瘤的 选择性累积。 噬菌体MS2是一种粒径为27nm的球形病毒颗粒， 包含180个相同的蛋白单。

11、体， 如 图2。 180个蛋白质单体能够自发地组装成中空蛋白质外壳， 其不含基因组物质， 蛋白质亚基 可以在大肠杆菌中重组表达， 并以完全组装的蛋白纳米粒存在， 该纳米粒在pH310、 低于60 说明书 1/6 页 3 CN 110841073 A 3 的温度下是稳定的。 病毒衣壳纳米颗粒尺寸大小均匀， 相对较大的尺寸允许它们承载显 着增加的药物， 并且有机会通过适当设计的化学策略将多个官能团连接到其内部和外部表 面。 并且MS2纳米颗粒的多个蛋白质亚基最终将解离和降解， 从而避免不期望的生物累积， 不会有毒害性。 对于实体肿瘤具有的EPR效应， 利用噬菌体MS2的蛋白外壳构建一个靶向多 价载。

12、体。 因此， 在本发明中， 将MS2表面的氨基和单羧基酞菁锌外围的羧基通过酰胺键连接 在一起， 由于MS2蛋白纳米粒的高亲水性可以有效的改善光敏剂单羧基酞菁锌的亲水性， 从 而制得一种良好的新型亲水性、 靶向性、 高载量的新型抗癌材料。 结果表明， MS2-CPZ纳米颗 粒明显的增强了酞菁锌的光动力抗肿瘤的疗效。 本研究将为三阴性乳腺癌治疗的药物开发 提供新思路， 并且提供了一种药效增强的酞菁锌纳米粒的制备方法。 0006 本发明的一个目的在于提供一种新型药效增强的纳米颗粒， 其不仅结构稳定， 药 效明显并且对机体没有毒害性。 0007 发明的另一个目的在于提供一种采用有效的纳米共价耦连技术，。

13、 通过将酞菁锌通 过共价耦连的方式结合在MS2蛋白纳米粒表面制备出的MS2-酞菁纳米颗粒能够有效的在肿 瘤组织聚集并杀死肿瘤细胞。 0008 为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案： （1） 以单羧基酞菁锌为原料药， 以MS2蛋白纳米颗粒为载药辅料， 将溶解于有机相中的 单羧基酞菁锌利用羧基活化剂进行羧基活化后， 之后与溶解于水相中的MS2蛋白纳米粒表 面的氨基发生酰胺反应， 将单羧基酞菁锌耦连在MS2蛋白纳米粒的表面； （2） 将反应后的纳米颗粒透析除杂、 浓缩、 过滤除菌后制得MS2蛋白纳米颗粒耦连单羧 基酞菁锌的纳米制剂。 0009 优选地， 采取以下技术方案：（1） 将单羧基酞菁锌溶。

14、解于有机溶液中， 浓度为0.5 100 mol/L， 并用浓度为2400 mol/L的羧基活化剂在室温下进行活化,活化148小时; （2） 室温下,将溶解于磷酸盐溶液中的MS2蛋白纳米粒加入至步骤 （1） 活化结束的酞菁 锌溶液里， 反应148小时， 得到MS2-CPZ纳米粒粗品， 酞菁锌和MS2的反应浓度比为： 5100： 1， 有机相和水相体积比为1： 110； （3） 将步骤 （2） 粗品离心除去沉淀， 离心去沉淀的条件为100010000 rpm离心1050 min， 剩下的上清液透析换液至0.1 M磷酸盐溶液 （pH7.4） 中， 之后再离心去除沉淀得到上清 液； （4） 将步骤 （。

15、3） 得上清液用3100 kDa截留率的浓缩管进行浓缩， 无菌滤膜抽滤除菌； 然 后通过动态光散射法测量纳米颗粒的粒径。 0010 步骤 （1） - （4） 中搅拌速度均为5001000 rpm。 0011 所述MS2蛋白纳米粒， 纯化采用PEG沉淀噬菌体颗粒的步骤 （Joseph Sambrook, Russell David W.著， 黄培堂等译， 分子克隆实验指南M， 第三版。 北京： 科学出版社， 2002， 186-187） ， 并稍微修改进行纯化。 0012 进一步地， 将制备得到的MS2蛋白纳米粒耦连光敏剂酞菁锌抗癌药物的纳米制剂 应用于制备治疗乳腺癌的药物中。 0013 本发明。

16、的有益效果在于： （1） 本发明通过调节单羧基酞菁锌和MS2蛋白纳米粒的比例、 浓度和制备的工艺参数， 来优化药物的耦连率、 粒径大小， 实现了纳米药物制备的可控性和纳米颗粒的均一性， 且工 说明书 2/6 页 4 CN 110841073 A 4 艺简单 （一步反应） 、 温和、 可放大生产， 无需高温高压条件， 是纳米医药领域的创新技术； （2） MS2蛋白纳米颗粒没有毒性， 防止引入毒性物质对正常细胞有毒性作用； （3） 由于本发明纳米制剂结构稳定性、 粒径均一， 具有被动靶向性， 具有肿瘤组织EPR效 应， 能显著提升药物在肿瘤组织的积累， 降低药物副作用， 具有良好的应用前景。 附图。

17、说明 0014 图1示出的是由实施例2的方法制备的药效增强的抗乳腺癌纳米颗粒中光敏剂2- 单羧基取代酞菁锌 （CPZ） 的化学结构式。 0015 图2示出的是由实施例1的方法制备的自组装MS2蛋白纳米颗粒的结构示意图。 0016 图3示出的分别是是由实施例1和实施例2的方法制备的MS2蛋白纳米和MS2-CPZ纳 米粒颗粒中的粒径分布。（A） MS2蛋白纳米粒的粒径强度分布图；（B） 纯MS2-CPZ纳米粒的粒 径强度分布图；（C） 纯MS2-CPZ纳米粒的电镜图。 0017 图4示出的是酶标仪分别测量纯MS2-CPZ中MS2和CPZ的含量。（A） 为MS2的标准曲 线；（B） 为CPZ的标准曲。

18、线。 0018 图5示出的是酶标仪定量纯MS2-CPZ纳米粒单线态氧产率的示意图。 0019 图6示出的是单独单羧基酞菁锌和MS2-CPZ纳米粒对一系列细胞的毒性作用的比 较。（A） 人乳腺癌细胞 （MDA-MB-231） ；（B） 小鼠乳腺癌细胞 （4T1） ；（C） 人胚肺成纤维细胞 （HELF） 。 0020 图7示出的是单独单羧基酞菁锌和MS2-CPZ纳米粒诱导对乳腺癌细胞线粒体凋亡 的示意图。（A） 光照组小鼠乳腺癌细胞 （4T1） ，（B） 不光照组小鼠乳腺癌细胞 （4T1） ，（C） 光照 组人乳腺癌细胞 （MDA-MB-231） ，（D） 不光照组人乳腺癌细胞 （MDA-MB-。

19、231） 。 具体实施方式 0021 为更好地理解本发明， 以下结合实施例对本发明做进一步说明， 但本发明要求保 护的范围并不局限于实施例表述的范围。 0022 实施例1 一种MS2蛋白纳米颗粒的制备方法， 包括如下步骤： （1） 在大肠杆菌中表达MS2蛋白， 将破碎后的菌体高速离心去除沉淀， 上清液放入37 水浴中8小时， 利用细菌细胞自身的核酸酶消化过上清液中残存的RNA和DNA， 病毒样颗粒因 为具有耐RNase的特性， 所以外壳蛋白包裹的RNA不被消化； （2） 加固体NaCl至终浓度为1 mol/L， 冰浴1小时。 4、 12000 r/min离心10min， 以除去 细菌碎片， 将。

20、上清液转移到另一干净的离心管中； （3） 加固体聚乙二醇PEG6000至终浓度为10 （W/V） ， 37震荡30 min， 过夜冰浴以使病 毒样颗粒形成沉淀； （4） 4、 12000 rpm离心10min， 回收沉淀的病毒样颗粒， 弃去上清并用纸吸去残存； （5） 加入沉淀体积120倍的0.01 M磷酸盐缓冲液， ， 用枪头不停吸打使其充分混匀。 然 后加入等体积的氯仿振荡在37震荡30 min， 以除去病毒样颗粒悬液里的聚乙二醇和细菌 碎片; （6） 4、 16000 rpm离心15 min， 分离有机相和水相， 回收含病毒样颗粒的水相， 即为粗 说明书 3/6 页 5 CN 11084。

21、1073 A 5 纯化的病毒样颗粒； （7） 粗纯的MS2颗粒再用分子筛进一步进行纯化， 最终得到纯度较高的MS2蛋白纳米粒， 其结构示意图如图2所示 实施例2 一种MS2-CPZ纳米颗粒的制备方法， 包括如下步骤： （1） 将单羧基酞菁锌溶解于二甲亚砜中， 浓度为55 mol/L， 加入终浓度100 mol/L的 二环己基碳二亚胺进行活化， 室温活化48小时； （2） 将溶解于磷酸盐溶液中MS2蛋白纳米粒加入至步骤 （1） 活化结束的酞菁锌溶液里， 室温反应48小时， 得到MS2-CPZ纳米粒粗品， 酞菁锌和MS2的反应浓度比为： 33:1， 有机相和 水相体积比为1:5； （3） 将步骤 。

22、（2） 粗品离心除去沉淀， 离心去沉淀的条件为8000 rpm离心10 min， 剩下的 上清液透析换液至磷酸盐溶液中， 之后再离心去除沉淀得到上清液； （4） 将步骤 （3） 得上清液用30 kDa截留率的浓缩管进行浓缩， 无菌滤膜抽滤除菌； 然后 通过动态光散射法测量纳米颗粒的粒径,通过酶标仪分别对纳米粒中MS2蛋白和单羧基酞 菁锌进行定量。 0023 制备得到的MS2-CPZ纳米颗粒的化学结构式如图1所示。 0024 实施例3： MS2-CPZ纳米粒粒径分布 实施例1中MS2蛋白纳米粒的粒径25室温下进行， 平行测定三次， MS2蛋白纳米粒的平 均粒径约为28.99 d.nm， 分散系数。

23、约为0.0299， 结果见图3A； 纯MS2-CPZ纳米粒的平均粒径 约为29.21 d.nm， 分散系数约为0.037， 结果见图3B， 相对于MS2蛋白纳米粒， 实施例1中MS2- CPZ纳米粒的平均粒径提高了0.2 nm左右， 分散系数PDI均小于0.1， 表现出良好的单分散 性。 制备的MS2-CPZ纳米粒的电镜结果见图3C。 0025 实施例4： MS2-CPZ纳米粒的耦连比计算 分别测量实施例2中制备的纯MS2-CPZ纳米粒中MS2蛋白的浓度和CPZ的浓度。 测量MS2 的浓度时， 样品稀释10倍， 通过BCA试剂盒配制不同浓度的BSA标准溶液， 在酶标仪上测量 562 nm处的各。

24、自的吸光度， 最后根据所得的数据绘制标准曲线， 拟合线性回归方程， y= 1.03x +0.102， R2=0.9965 （图4A） 。 测量CPZ的浓度时， 样品稀释4倍后， 用以二甲亚砜为溶剂 的不同浓度的纯ZnPc为标准曲线， 稀释后的的纯MS2-CPZ再用二甲亚砜稀释10倍溶解， 以2- 单羧基取代酞菁锌的激发波长 （610nm） 、 发射波长 （680nm） 测量荧光值， 最后根据所得的数 据绘制标准曲线， 拟合线性回归方程， y=1.87106x+2.83105， R2 =0.99 （图4B） 。 0026 根据以下公式计算耦连比： 。 0027 该纳米制剂的耦连比率为6.50.3。

25、， 结合上述的粒径和和稳定性， 我们得出结论， 该纳米制剂是一种具有较高载药量的稳定纳米粒子。 0028 实施例5： 单线态氧产率测定 分别测量实施例1制备的纯MS2蛋白纳米粒、 实施例2中制备的纯MS2-CPZ纳米粒、 单独 SOSG单线态氧探针在无机盐溶液的单线态氧产率。 两种纳米粒的浓度分别为1mol/L， SOSG单线态氧探针浓度为10 mol/L， 室温下下孵育10min， 然后用670nm的激光照射， 每次 说明书 4/6 页 6 CN 110841073 A 6 0.5min， 共照射5min， 每次照射后在酶标仪上测量荧光强度， 其中激发波长 （504nm） 、 发射波 长 （。

26、525nm） 测量荧光值， 结果见图5。 0029 实施例6： 细胞毒性实验 方案： 将人乳腺癌细胞 （MDA-MB-231） 、 小鼠乳腺癌细胞 （4T1） 、 人胚肺成纤维细胞 （HELF） 分别接种到96孔板 （10,000个细胞/孔） 中， 24小时后， 根据浓度梯度分别用单羧基酞 菁锌和MS2-CPZ纳米粒处理细胞， 三个平行组。 24小时后， 用PBS洗涤， 然后换上新鲜的培养 基， 光毒组用670nm的激光器照射37s， 约 1.5J/cm2。 继续培养14小时后， 吸出96孔板中的培 养基并用PBS洗涤， 然后向每个孔中加入100 L MTT， 4小时后， 吸出96孔板中的MT。

27、T溶液， 向 各孔中加入100 L DMSO溶液。 在振荡器上孵育30分钟后， 用酶标仪在490 nm处测量吸光 度， 结果见图6。 0030 结果： 为了分别确定单羧基酞菁锌、 MS2-CPZ纳米粒在对乳腺癌细胞的光毒性和暗 毒性， 我们首先用不同的乳腺癌细胞系进行细胞生长实验， 包括小鼠三阴性4T1细胞和人三 阴性MDA-MB-231细胞， 并且以人胚肺成纤维细胞 （HELF） 细胞作对照细胞系。 用含有不同浓 度的羧基酞菁锌和MS2-CPZ纳米粒的培养液培养细胞24小时， 分别进行光照和不光照操作， 并在指定的时间点进行MTT测定。 MTT测定结果的IC50显示 （见表1） ， 光照组同。

28、光敏剂酞菁锌 浓度下， 在MDA-MB-231细胞MS2-CPZ纳米粒组IC50值比单羧基酞菁锌组高4倍， 效果较好。 虽 然在 4T1细胞中， MS2-CPZ纳米粒组IC50值与CPZ组相差不多， 但是由于纳米在体内会有很好 的EPR效应， 在动物实验(4T1模型)中效果会优于单羧基酞菁锌组， MS2-CPZ纳米粒和单羧基 酞菁锌对HELF细胞的毒性均明显低于两种肿瘤细胞。 无光照组中， MS2-CPZ纳米粒的细胞毒 性均明显低于单羧基酞菁锌。 0031 光照下， 与单独的单羧基酞菁锌相比发现MS2-CPZ纳米粒对MDA-MB-231和4T1的抑 制作用得到极大提高， 并且对MS2-CPZ纳。

29、米粒正常细胞HELF没有明显毒性， 这不仅充分证明 纳米制剂对光敏剂酞菁锌药效具有增强的影响， 增加对三阴性乳腺癌细胞增殖的抑制作 用， 而且还表明MS2-CPZ纳米粒对MDA-MB-231细胞的抑制作用优于4T1细胞。 此外， MS2-CPZ 纳米粒还能够明显的降低单羧基酞菁锌本身的细胞毒性。 0032 表1 细胞毒性IC50值 实施例7： 细胞线粒体凋亡实验 方案： 将小鼠乳腺癌细胞 （4T1） 、 人乳腺癌细胞 （MDA-MB-231） 分别接种到96孔板 （10, 000个细胞/孔） 中， 24小时后， 分别用浓度为1 mol/L的单羧基酞菁锌和MS2-CPZ纳米粒处 理细胞。 24小。

30、时后， 用PBS洗涤， 然后换上新鲜的培养基， 光照组用670nm的激光器照射37s， 约1.5 J/cm2。 继续培养14小时后， 吸出96孔板中的培养基并用PBS洗涤， 然后向每个孔中加 说明书 5/6 页 7 CN 110841073 A 7 入100 L含有JC-1染色工作液的培养基， 孵育20分钟， 然后用JC-1染色缓冲液洗涤两次， 换 上100 L新鲜培养基。 最后在高内涵系统上进行成像， 结果见图7。 0033 结果： 为了分别确定单羧基酞菁锌、 MS2-CPZ纳米粒诱导乳腺癌细胞线粒体的凋亡 情况， 我们首先用不同的乳腺癌细胞系进行细胞生长实验， 包括小鼠三阴性4T1细胞和人。

31、三 阴性MDA-MB-231细胞。 用含有相同浓度的羧基酞菁锌和MS2-CPZ纳米粒的培养液培养细胞 24小时， 进行光照或不光照操作， 然后加入JC-1线粒体凋亡探针， 并在指定的时间点进行高 内涵系统荧光测定。 在线粒体膜电位较高时， JC-1聚集在线粒体的基质中， 形成聚合物(J- aggregates)， 可以产生红色荧光； 在线粒体膜电位较低时， JC-1不能聚集在线粒体的基质 中， 此时JC-1为单体(monomer)， 可以产生绿色荧光。 测定结果显示， 4T1和MDA-MB-231两种 细胞中， 相同给药浓度下， 两种细胞MS2-CPZ组光照时线粒体凋亡程度均强于CPZ组， 不。

32、光照 组线粒体凋亡程度均弱于CPZ组。 0034 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰， 皆应属本发明的涵盖范围。 说明书 6/6 页 8 CN 110841073 A 8 图1 图2 说明书附图 1/7 页 9 CN 110841073 A 9 图3 说明书附图 2/7 页 10 CN 110841073 A 10 图4 说明书附图 3/7 页 11 CN 110841073 A 11 图5 图6A 图6B 说明书附图 4/7 页 12 CN 110841073 A 12 图6C 图7A 说明书附图 5/7 页 13 CN 110841073 A 13 图7B 图7C 说明书附图 6/7 页 14 CN 110841073 A 14 图7D 说明书附图 7/7 页 15 CN 110841073 A 15 。