胎儿游离DNA的富集方法.pdf
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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911204455.4 (22)申请日 2019.11.29 (71)申请人 北京科迅生物技术有限公司 地址 100195 北京市海淀区四季青杏石口 路65号益园创新产业基地C7 (72)发明人 赵军方楠林少航贾晋红 王伟伟伍启熹王建伟刘倩 唐宇 (74)专利代理机构 北京康信知识产权代理有限 责任公司 11240 代理人 路秀丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) (54)发明名称 胎儿游离DNA的富集方法 (57)摘要 本发明提供了一种胎儿。
2、游离DNA的富集方 法。 该富集方法包括: 采用2033bp的Y型接头与 游离DNA进行连接, 得到总游离DNA的连接片段; 采用磁珠对总游离DNA的连接片段进行纯化并回 收50-150bp的游离DNA对应的连接片段, 得到富 集的胎儿游离DNA。 该富集方法针对游离DNA中胎 儿游离DNA集中在50-150bp这一特点, 通过对二 代测序文库构建过程中的操作步骤进行调整, 对 接头进行截短, 并去除大于150bp的游离DNA片 段, 富集50-150bp的游离DNA片段, 从而实现对于 胎儿游离DNA的富集。 权利要求书2页 说明书27页 序列表3页 附图6页 CN 110846382 A 。
3、2020.02.28 CN 110846382 A 1.一种胎儿游离DNA的富集方法, 其特征在于, 所述富集方法包括: 采用2033bp的Y型接头与游离DNA进行连接, 得到总游离DNA的连接片段; 采用磁珠对所述总游离DNA的所述连接片段进行纯化并回收50-150bp的所述游离DNA 对应的所述连接片段, 得到富集的所述胎儿游离DNA。 2.根据权利要求1所述的富集方法, 其特征在于, 对所述总游离DNA的所述连接片段进 行纯化并回收50-150bp的所述游离DNA对应的所述连接片段, 得到富集的所述胎儿游离DNA 包括: 向所述总游离DNA的所述连接片段中加入0.8-1.2倍所述连接片段。
4、体积的磁珠去除长 度大于150bp的游离DNA对应的所述连接片段, 得到第一纯化片段; 向所述第一纯化片段中加入所述磁珠及异丙醇, 并通过控制两次加入所述磁珠的总量 达到所述第一纯化片段的体积的1.2-1.8倍, 加入的所述异丙醇的体积为所述第一纯化片 段体积的0.2-2.0倍, 优选0.5-0.9倍, 从而回收50-150bp的所述游离DNA对应的所述连接片 段, 得到富集的所述胎儿游离DNA。 3.根据权利要求1所述的富集方法, 其特征在于, 对所述连接片段进行纯化, 并回收50- 150bp的所述游离DNA对应的所述连接片段, 得到富集的所述胎儿游离DNA包括: 对所述总游离DNA的所述。
5、连接片段进行全部回收, 得到回收产物; 对所述回收产物中的大于150bp的所述游离DNA对应的所述连接片段进行去除, 得到第 二纯化片段; 回收所述第二纯化片段中50-150bp的所述游离DNA对应的所述连接片段, 得到富集的 所述胎儿游离DNA。 4.根据权利要求3所述的富集方法, 其特征在于, 对所述总游离DNA的所述连接片段进 行全部回收, 得到所述回收产物包括: 通过向所述总游离DNA的所述连接片段中加入1.0-2.0倍, 优选1.2-1.8倍所述总游离 DNA的所述连接片段体积的磁珠和0.2-2.0倍, 优选0.5-1.0倍所述总游离DNA的所述连接片 段体积的异丙醇, 从而对所述总。
6、游离DNA的所述连接片段进行全部回收, 得到所述回收产 物。 5.根据权利要求3所述的富集方法, 其特征在于, 对所述回收产物中的大于150bp的所 述游离DNA对应的所述连接片段进行去除, 得到所述第二纯化片段包括: 通过向所述回收产物中加入1.0-1.5倍, 优选1.1-1.2倍所述回收产物体积的磁珠, 从 而选去除大于150bp的所述游离DNA对应的所述连接片段, 得到所述第二纯化片段。 6.根据权利要求5所述的富集方法, 其特征在于, 回收所述第二纯化片段中50-150bp的 所述游离DNA对应的所述连接片段, 得到富集的所述胎儿游离DNA包括: 向所述第二纯化片段中再次加入磁珠, 并。
7、控制所述磁珠的总体积达到所述第二纯化片 段体积的1.5-2.0倍, 优选1.7-1.9倍; 之后继续加入0.2-2.0倍, 优选0.5-0.9倍所述第二纯化片段体积的异丙醇, 或者0.5- 4.0倍所述第二纯化片段体积的无水乙醇, 从而完成对50-150bp的所述游离DNA对应的所述 连接片段的回收, 得到富集的所述胎儿游离DNA。 7.根据权利要求1至6中任一项所述的富集方法, 其特征在于, 所述富集方法还包括: 对 富集的所述胎儿游离DNA进行PCR扩增构建成胎儿游离DNA文库。 权利要求书 1/2 页 2 CN 110846382 A 2 8.根据权利要求7所述的富集方法, 其特征在于,。
8、 采用单端带有index的扩增引物, 对富集的所述胎儿游离DNA进行PCR扩增, 得到扩增文 库; 对所述扩增文库进行纯化回收, 得到所述胎儿游离DNA文库。 9.根据权利要求8所述的富集方法, 其特征在于, 对所述扩增文库进行纯化回收包括: 采用1.0-2.0倍, 优选1.7-1.9倍所述扩增文库体积的磁珠及0.2-2.0倍, 优选0.5-0.9 倍所述扩增文库体积的异丙醇对所述扩增文库进行纯化回收; 或者 采用1.0-2.0倍, 优选1.7-1.9倍所述扩增文库体积的磁珠及0.5-4.0倍述扩增文库体 积的无水乙醇对所述扩增文库进行纯化回收。 10.根据权利要求1至6中任一项所述的富集方法。
9、, 其特征在于, 所述2033bp的Y型接 头为Illumina测序平台的不含index序列的Y型接头。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110846382 A 3 胎儿游离DNA的富集方法 技术领域 0001 本发明涉及产前筛查领域, 具体而言, 涉及一种胎儿游离DNA的富集方法。 背景技术 0002 产前筛查对于降低出生缺陷具有重要的意义。 它不仅可以筛查21、 18和13染色体 三体, 它还可以对染色体非整倍体(微缺失、 微重复)引起的疾病进行筛查。 此外, 它也有助 于单基因病(罕见病)的预防也有重要的意义。 提高胎儿游离DNA在总游离DNA中所占比例, 对于提高产前筛查的准确性具有。
10、重要的意义。 0003 现有针对外周血中胎儿游离DNA的富集方法有很多中, 总结起来有以下几类: 0004 第一类: 通过分离有核红细胞实现对胎儿DNA的富集 0005 成人的红细胞中无细胞核, 不含有DNA。 胎儿的红细胞中含有细胞核, 存在基因组 DNA序列。 通过从母体血液中分离有核红细胞, 可以实现对胎儿游离DNA的富集。 0006 该方法的局限性在于: 1.技术要求高; 2.样品体积需求较大, 孕妇难于接受; 3.分 离有核红细胞周期长, 难于实现自动化; 4.成功率低; 5.成本高。 0007 第二类: 通过甲基化实现对cffDNA的富集 0008 与成人相比, 胎儿游离DNA中含。
11、有较多的甲基化修饰。 通过对甲基化的DNA的捕获, 可以富集胎儿游离DNA。 0009 该方法的局限性在于: 1.技术繁琐、 难度大; 2.胎儿游离DNA筛选成本高; 3.难于实 验自动化。 0010 第三类: 基于cffDNA大小的筛选方案 0011 母亲来源的cfDNA的峰值在160170bp之间, 小于150bp的游离DNA中, 胎儿来源的 游离DNA所占比例较高。 通过对小于150bp游离DNA的筛选, 可以提高胎儿游离DNA在总游离 DNA中所占的比例, 从而实现对胎儿游离DNA的富集。 0012 人们通常采用两种方案对较小的游离DNA进行筛选。 0013 1.对游离DNA或游离DN。
12、A文库进行琼脂糖电泳, 之后通过切胶对小于150bp的游离 DNA片段进行筛选; 0014 2.通过选择性纯化回收磁珠对游离DNA或游离DNA文库进行筛选, 去除大于150bp 的游离DNA文库, 回收较小的游离DNA片段; 0015 这类筛选方案的局限性在于: 0016 1.通过切胶回收对DNA片段进行筛选回收时, DNA大小判断不准确、 技术可重复性 差; 0017 2.通过选择性纯化回收磁珠对游离DNA或文库进行筛选时, 在Illumina测序建库 体系中会产生大量的接头二聚体污染, 降低测序质量以及reads的有效利用率。 0018 目前二代测序领域, illumina测序仪器市场占比。
13、大于70, 居于统治地位。 基于 Illumina测序仪的文库构建时会产生长度为120bp的接头二聚体。 在进行胎儿游离DNA富集 时需要回收较小的游离DNA片段(50-150bp), 加入120bp的接头后, 170bp的文库片段与 说明书 1/27 页 4 CN 110846382 A 4 120bp的接头二聚体难以用选择性纯化磁珠区分, 会造成文库中残留大量接头二聚体或小 的游离DNA片段, 未能得到充分的富集。 0019 综上可知, 现有的富集方法存在效率低的缺陷。 发明内容 0020 本发明的主要目的在于提供一种胎儿游离DNA的富集方法, 以解决现有技术中胎 儿游离DNA富集效率低的。
14、问题。 0021 为了实现上述目的, 根据本发明的一个方面, 提供了一种胎儿游离DNA的富集方 法, 该富集方法包括: 采用2033bp的Y型接头与游离DNA进行连接, 得到总游离DNA的连接 片段; 采用磁珠对总游离DNA的连接片段进行纯化并回收50-150bp的游离DNA对应的连接片 段, 得到富集的胎儿游离DNA。 0022 进一步地, 对总游离DNA的连接片段进行纯化并回收50-150bp的游离DNA对应的连 接片段, 得到富集的胎儿游离DNA包括: 向总游离DNA的连接片段中加入0.8-1.2倍连接片段 体积的磁珠去除长度大于150bp的游离DNA对应的连接片段, 得到第一纯化片段;。
15、 向第一纯 化片段中加入磁珠及异丙醇, 并通过控制两次加入磁珠的总量达到第一纯化片段的体积的 1.2-1.8倍, 加入的异丙醇的体积为第一纯化片段体积的0.2-2.0倍, 优选0.5-0.9倍, 从而 回收50-150bp的游离DNA对应的连接片段, 得到富集的胎儿游离DNA。 0023 进一步地, 对连接片段进行纯化, 并回收50-150bp的游离DNA对应的连接片段, 得 到富集的胎儿游离DNA包括: 对总游离DNA的连接片段进行全部回收, 得到回收产物; 对回收 产物中的大于150bp的游离DNA对应的连接片段进行去除, 得到第二纯化片段; 回收第二纯 化片段中50-150bp的游离DN。
16、A对应的连接片段, 得到富集的胎儿游离DNA。 0024 进一步地, 对总游离DNA的连接片段进行全部回收, 得到回收产物包括: 通过向总 游离DNA的连接片段中加入1.0-2.0倍, 优选1.2-1.8倍总游离DNA的连接片段体积的磁珠和 0.2-2.0倍, 优选0.5-1.0倍总游离DNA的连接片段体积的异丙醇, 从而对总游离DNA的连接 片段进行全部回收, 得到回收产物。 0025 进一步地, 对回收产物中的大于150bp的游离DNA对应的连接片段进行去除, 得到 第二纯化片段包括: 通过向回收产物中加入1.0-1.5倍, 优选1.1-1.2倍回收产物体积的磁 珠, 从而选去除大于150。
17、bp的游离DNA对应的连接片段, 得到第二纯化片段。 0026 进一步地, 回收第二纯化片段中50-150bp的游离DNA对应的连接片段, 得到富集的 胎儿游离DNA包括: 向第二纯化片段中再次加入磁珠, 并控制磁珠的总体积达到第二纯化片 段体积的1.5-2.0倍, 优选1.7-1.9倍; 之后继续加入0.2-2.0倍, 优选0.5-0.9倍第二纯化片 段体积的异丙醇, 或者0.5-4.0倍第二纯化片段体积的无水乙醇, 从而完成对50-150bp的游 离DNA对应的连接片段的回收, 得到富集的胎儿游离DNA。 0027 进一步地, 富集方法还包括: 对富集的胎儿游离DNA进行PCR扩增构建成胎。
18、儿游离 DNA文库。 0028 进一步地, 采用单端带有index的扩增引物, 对富集的胎儿游离DNA进行PCR扩增, 得到扩增文库; 对扩增文库进行纯化回收, 得到胎儿游离DNA文库。 0029 进一步地, 对扩增文库进行纯化回收包括: 采用1.0-2.0倍, 优选1.7-1.9倍扩增文 库体积的磁珠及0.2-2.0倍, 优选0.5-0.9倍扩增文库体积的异丙醇对扩增文库进行纯化回 说明书 2/27 页 5 CN 110846382 A 5 收; 或者采用1.0-2.0倍, 优选1.7-1.9倍扩增文库体积的磁珠及0.5-4.0倍述扩增文库体积 的无水乙醇对扩增文库进行纯化回收。 0030 。
19、进一步地, 2033bp的Y型接头为Illumina测序平台的不含index序列的Y型接头。 0031 应用本发明的技术方案, 该富集方法针对游离DNA中胎儿游离DNA集中在50-150bp 这一特点, 通过对二代测序文库构建过程中的操作方法进行调整, 对接头进行截短, 并去除 大于150bp的游离DNA片段, 富集50-150bp的游离DNA片段, 从而实现对于胎儿游离DNA的富 集。 附图说明 0032 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解, 本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明, 并不构成对本发明的不当限定。 在附图中: 0033 图1示出了产前诊断过程中采。
20、用通用建库方法对胎儿游离DNA进行富集的流程图: 0034 图2示出了本申请改进的建库方法对胎儿游离DNA进行富集的流程图: 0035 图3示出了Illumina测序平台对胎儿游离DNA进行富集的方法中的Y型接头的序列 及其结构示意图; 0036 图4A至图4H示出了本申请实施例1中的不同的回收方案所得到的DNA分布范围图; 0037 图5A至图5B示出了本申请实施例2中的全长接头(图5A)与短接头(图5B)建库所得 到的DNA分布范围图; 0038 图6A至图6D示出了本申请实施例3中不同选择性纯化回收方案所得文库中DNA片 段的分布范围图; 0039 图7A至图7F示出了本申请实施例4中不。
21、同选择性纯化回收方案所得文库中DNA片 段的分布范围图; 0040 图8示出了本申请实施例5中采用本申请的富集方法及现有通用建库方法所得的 38个文库经测序及数据分析之后, 得到的胎儿游离DNA浓度图。 具体实施方式 0041 需要说明的是, 在不冲突的情况下, 本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。 下面将结合实施例来详细说明本发明。 0042 如背景技术中提到的, 孕妇来源的血浆中提取得到的游离DNA用毛细管电泳检测 (Agilent 2100或类似仪器)发现游离DNA的峰值在160-170bp之间。 提取得到的游离DNA中 既含有母亲来源的游离DNA, 又含有胎儿来源的游离DN。
22、A。 与母亲来源的游离DNA相比, 胎儿 来源的游离DNA较小, 分布范围主要在60-150bp之间。 现有技术对游离DNA中胎儿来源的游 离DNA的富集方法, 如图1所示, 主要是利用通用文库构建流程来进行富集, 并在接头连接和 PCR扩增后进行纯化回收(主要是磁珠纯化回收)。 0043 在现有的富集方案中, 研究人员通常只关注游离DNA的主峰160-170bp。 在 Illumina测序系统中, 游离DNA连接接头后的主峰在290bp左右。 Illumina测序体系在建库 过程中通常会产生长度为120bp的接头二聚体, 接头二聚体的存在会对测序效果造成较大 的影响。 由于120bp的接头二。
23、聚体与290bp的文库主峰在长度上存在加大差距, 通常可以通 过选择性纯化磁珠, 选择性地将接头二聚体去除。 说明书 3/27 页 6 CN 110846382 A 6 0044 本申请中, 为了提高总的游离DNA中胎儿游离DNA的比例, 需要去除长度大于150bp 的游离DNA片段, 回收50-150bp的游离DNA片段。 然而实验中发现: 50bp的游离DNA连接接头 后长度为170bp, 与120bp的接头二聚体长度, 在采用磁珠纯化时很难在不损失50bp游离DNA 片段的情况下, 将接头二聚体去除。 0045 为了尽可能最大限度地在回收50-150bp的较小的游离DNA片段的同时, 又。
24、能将接 头二聚体去除, 发明人尝试用长度在20-33bp的短接头(如图3所示)替换原有全长接头。 短 接头形成的接头二聚体(40-66bp)长度与连接接头后的短游离DNA片段(90-110bp)在长度 上虽然同样是50bp的差别, 但由于片段越短就越难以回收, 因而通过选择性纯化回收磁珠 可将二者进行较好的区分, 得到无明显接头污染的文库。 0046 当用选择性纯化磁珠(AMPure XP或类似产品)进行DNA片段纯化回收时, 通常DNA 片段越小, 需要用到的磁珠用量越大; 相同试剂用量的条件下, DNA片段越小, 回收效率越 低。 进一步地, 为了提高小片段DNA(主要是50-150bp)。
25、的回收效率, 在回收体积中加入了 0.2-2.0(优选0.5-1.0)倍样品体积的异丙醇。 0047 进一步地, 发明人研究还发现: 在文库构建的过程中, 在连接短接头后, 首先对连 接产物DNA全纯化回收(比如, 加入1.8倍体积的纯化磁珠和0.7倍体积的异丙醇), 之后对回 收产物进行选择性纯化回收, 去除大片段(比如, 加入1.0-1.5倍样品体积的纯化磁珠)回收 小片段(比如补足至1.8倍样品体积的纯化磁珠和0.7倍样品体积的异丙醇), 不仅能提高选 择性回收纯化的稳定性, 同时也能提高本申请改进的胎儿游离DNA富集方案的通用性。 0048 在上述研究结果的基础上, 申请人提出了本申请。
26、的技术方案。 在本申请一种典型 的实施方式中, 提供了一种胎儿游离DNA的富集方法, 该富集方法包括: 采用2033bp的Y型 接头与游离DNA进行连接, 得到总游离DNA的连接片段; 采用磁珠对总游离DNA的连接片段进 行纯化并回收50-150bp的游离DNA对应的连接片段, 得到富集的胎儿游离DNA。 0049 在一种优选的实施例中, 如图2所示, 采用磁珠对总游离DNA的连接片段进行纯化 并回收50-150bp的游离DNA对应的连接片段, 得到富集的胎儿游离DNA包括: 向总游离DNA的 连接片段中加入0.8-1.2倍连接片段体积的磁珠去除长度大于150bp游离DNA对应的连接片 段, 。
27、得到第一纯化片段; 向第一纯化片段中加入磁珠及异丙醇, 并通过控制两次加入磁珠的 总量达到第一纯化片段的体积的1.2-1.8倍, 加入的异丙醇的体积为第一纯化片段体积的 0.2-2.0倍, 优选0.5-0.9倍, 从而回收50-150bp的游离DNA对应的连接片段, 得到富集的胎 儿游离DNA。 0050 在一种优选的实施例中, 如图2所示, 采用磁珠对连接片段进行纯化并回收50- 150bp的游离DNA的连接片段, 得到富集的胎儿游离DNA包括: 对总游离DNA的连接产物进行 全部回收, 得到回收产物; 对回收产物中的大于150bp的游离DNA对应的连接片段进行去除, 得到第二纯化片段; 回。
28、收第二纯化片段中50-150bp的游离DNA对应的连接片段, 得到富集的 胎儿游离DNA。 0051 在一种优选的实施例中, 对总游离DNA的连接片段进行全部回收, 得到回收产物包 括: 通过向总游离DNA的连接片段中加入1.0-2.0倍, 优选1.2-1.8倍总游离DNA的连接片段 体积的磁珠和0.2-2.0倍, 优选0.5-1.0倍总游离DNA的连接片段体积的异丙醇, 从而对总游 离DNA的连接片段进行全部回收, 得到回收产物。 0052 在一种优选的实施例中, 对回收产物中的大于150bp的游离DNA对应的连接片段进 说明书 4/27 页 7 CN 110846382 A 7 行去除, 。
29、得到第二纯化片段包括: 通过向回收产物中加入1.0-1.5倍, 优选1.1-1.2倍游离 DNA对应的连接片段体积的磁珠, 从而选去除大于150bp的游离DNA对应的连接片段, 得到第 二纯化片段。 0053 在一种优选的实施例中, 回收第二纯化片段中50-150bp的游离DNA对应的连接片 段, 得到富集的胎儿游离DNA包括: 向第二纯化片段中再次加入磁珠, 并控制磁珠的总体积 达到第二纯化片段体积的1.5-2.0倍, 优选1.7-1.9倍; 之后继续加入0.2-2.0倍, 优选0.5- 0.9倍第二纯化片段体积的异丙醇, 或者0.5-4.0倍第二纯化片段体积的无水乙醇, 从而完 成对50-。
30、150bp游离DNA对应的连接片段的回收, 得到富集的胎儿游离DNA。 0054 在一种优选的实施例中, 如图2所示, 上述富集方法还包括: 对富集的胎儿游离DNA 进行PCR扩增构建成胎儿游离DNA文库。 0055 在一种优选的实施例中, 如图2所示, 采用单端带有index的扩增引物, 对富集的胎 儿游离DNA进行PCR扩增, 得到扩增文库; 对扩增文库进行纯化回收, 得到胎儿游离DNA文库。 0056 在一种优选的实施例中, 对扩增文库进行纯化回收包括: 采用1.0-2.0倍, 优选 1.7-1.9倍扩增文库体积的磁珠及0.2-2.0倍, 优选0.5-0.9倍扩增文库体积的异丙醇对扩 增。
31、文库进行纯化回收; 或者采用1.0-2.0倍, 优选1.7-1.9倍扩增文库体积的磁珠及0.5-4.0 倍述扩增文库体积的无水乙醇对扩增文库进行纯化回收。 0057 在一种优选的实施例中, 2033bp的Y型接头为Illumina测序平台的不含index序 列的Y型接头。 0058 上述接头连接的步骤中, 所采用的接头为不带index或barcode等标签序列的接 头, 需要说明的是, 本申请中并不局限于应用illumina平台进行文库测序。 0059 上述富集方法中, PCR扩增的循环数根据实际需要合理设定。 在本申请一种优选的 实施例中, 进行115轮, 优选512轮PCR扩增, 得到胎儿。
32、游离DNA文库。 0060 在本申请第二种典型的实施例中, 提供了一种胎儿游离DNA文库, 该胎儿游离DNA 文库通过上述富集方法构建而成。 通过采用较短的接头与游离DNA片段进行连接, 然后采用 选择性纯化回收磁珠(含异丙醇)对连接接头后的游离DNA片段进行选择性纯化回收。 因短 接头形成的接头二聚体长度较短, 在采用磁珠选择形纯化回收时, 更不容易回收, 相应地, 连接短接头后的游离DNA的长度虽仅长50bp, 但在采用磁珠选择性纯化回收时, 更容易回收 回来。 进而可以从一定程度上避免接头二聚体的污染, 实现对胎儿游离DNA进行有效的富 集。 即采用上述方法所构建的文库中胎儿游离DNA的。
33、目的片段富集程度高, 测序后所得数据 中的有效数据率也较高。 0061 下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。 0062 实施例1 0063 1.样品准备: 0064 1)将50bp的DNA marker与去离子水按照5:45的比例混合, 之后充分混匀。 50bp的 DNA marker中含有以下长度的片段: 50bp、 100bp、 150bp、 200bp、 250bp、 300bp、 350bp、 400bp 和500bp。 0065 2)取50 L混合液加入到1.5mL的离心管中, 之后按照下表向离心管中加入试剂: 0066 表1: 说明书 5/27 页 8 CN 110。
34、846382 A 8 0067 0068 0069 3)将离心管涡旋震荡混匀, 之后室温静置5min。 0070 4)将离心管放置于磁力架上静置5min, 之后用移液器弃去溶液。 0071 5)向离心管中加入200 L 80的乙醇, 之后用移液器弃去溶液。 说明书 6/27 页 9 CN 110846382 A 9 0072 6)重复步骤4。 0073 7)保持离心管固定于磁力架上静置2-10min, 使乙醇充分挥发。 0074 8)向离心管中加入50 L去离子水, 涡旋震荡使磁珠充分混匀, 之后室温放置5min。 0075 9)将离心管放置于磁力架上, 静置5min, 之后将溶液转移至新的离。
35、心管中。 0076 10)用Qubit对纯化产物进行浓度测定, 浓度如下表: 0077 表2: 0078 说明书 7/27 页 10 CN 110846382 A 10 0079 0080 11)用Qseq 100进行DNA片段分布检测, DNA分布如图4A至图4H所示。 0081 图4A至图4H示出了不同回收方案所得到的DNA分布范围。 其中, 图4A显示的是用 1.0倍样品体积的AMPure XP磁珠进行纯化回收, 可以回收得到200bp以上的DNA片段, 250bp 以上的DNA片段回收效果良好。 图4B显示的是用1.8倍样品体积的AMPure XP磁珠进行纯化 回收, 可以回收得到10。
36、0bp以上的DNA片段, 150bp以上的DNA片段回收效果良好。 图4C显示的 是2.5倍样品体积的AMPure XP磁珠进行纯化回收, 100bp DNA片段的回收效果优于4B图, 150bp以上DNA片段回收效果良好。 图4D显示的是1.8倍样品体积的AMPure XP磁珠与0.2倍 体积的异丙醇进行纯化回收, 回收效果优于图4A、 图4B中所示方案, 与图4C方案中回收效果 相似。 图4E显示的是1.8倍样品体积的AMPure XP磁珠与0.5倍体积的异丙醇进行纯化回收, 回收效果优于图4A、 4B、 4C、 4D中所示方案, 100bp DNA片段的回收效果良好。 图4F显示的是 1。
37、.8倍样品体积的AMPure XP磁珠与0.7倍体积的异丙醇进行纯化回收, 回收效果优于4A、 4B、 4C、 4D和4E中所示方案, 100bp DNA片段的回收效果良好, 50bp DNA片段开始出现。 图4G 显示的是1.8倍样品体积的AMPure XP磁珠与1.0倍体积的异丙醇进行纯化回收, 回收效果 优于4A、 4B、 4C、 4D、 4E和4F中所示方案, 有明显的50bp的DNA片段。 图4H显示的是1.8倍样品 体积的AMPure XP磁珠与2.0倍体积的异丙醇进行纯化回收, 回收效果优于4A、 4B、 4C、 4D、 4E、 4F和图4G中所示方案, 50bp DNA片段的回。
38、收效果良好。 0082 上述结果表明: 单纯用磁珠进行回收难于回收得到小于150bp的DNA片段。 此外, 加 入异丙醇后不但可以提高小于150bp的DNA片段回收效率, 而且可以降低成本。 0083 实施例2: 0084 1.样品: 怀孕9-16周的孕妇血浆, 用游离DNA提取试剂盒从血浆中提取游离DNA。 0085 2.文库构建: 0086 2.1末端修复与加A: 0087 2.1.1按照下表在PCR管中配置末端修复体系: 0088 表3: 说明书 8/27 页 11 CN 110846382 A 11 0089 0090 2.1.2涡旋震荡10秒钟使溶液充分混匀, 之后将PCR管固定于P。
39、CR仪中, 按照下表中 条件进行反应: 0091 表4: 0092 0093 2.2接头连接: 0094 2.2.1按下表配制连接反应工作液: 0095 表5: 0096 0097 全长接头序列如下: 0098 5-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3(SEQ ID NO:1: ) 0099 5-gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacnnnnnnnnatctcgtatgccgtcttctgcttg- 3(SEQ ID NO:2)。 0100 短接头序列如下: 0101 5 -gatc。
40、ggaagagcacacgtctgaactccagtc-3 (SEQ ID NO:3); 0102 5 -acactctttccctacacgacgctcttccgatct-3 (SEQ ID NO:4)。 0103 2.2.2涡旋震荡10秒钟使溶液充分混匀, 之后将PCR管固定于PCR仪中按照下表进 行PCR仪程序设置: 0104 表6: 说明书 9/27 页 12 CN 110846382 A 12 0105 0106 2.3接头连接产物的纯化: 0107 2.3.1向1.5ml离心管中加入70 L接头连接产物, 126 L AMPure XP纯化磁珠和49 L异丙醇, 涡旋震荡10秒钟充。
41、分混匀, 之后室温放置5分钟; 0108 2.3.2将离心管固定于磁力架上静置5min, 之后用移液器充分弃去溶液; 0109 2.3.3保持离心管固定于磁力架上, 向离心管中加入300 L 80乙醇, 之后用移液 器充分弃去溶液; 0110 2.3.4重复2.3.3步骤1次; 0111 2.3.5短暂离心后将离心管重新固定于磁力架上, 用移液器充分弃去管底溶液; 0112 2.3.6室温放置5-10min, 使乙醇充分挥发; 0113 2.3.7向离心管中加入23 L去离子水, 涡旋震荡使磁珠充分悬浮于溶液中, 之后室 温放置5min; 0114 2.3.8将离心管固定于磁力架上静置5min。
42、, 之后用移液器转移20 L溶液至PCR管 中。 0115 2.4 PCR扩增: 0116 2.4.1按下表配置PCR扩增体系: 0117 表7: 0118 0119 通用引物的序列如下: 0120 5-aatgatacggcgaccaccgagatctacac-3 (SEQ ID NO:5) 0121 5-caagcagaagacggcatacgagat-3(SEQ ID NO:6). 0122 Index引物的序列如下: 0123 5-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatcT-3 (SEQ ID NO:7); 01。
43、24 5-caagcagaagacggcatacgagnnnnnnnngtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3 (SEQ ID NO:8)。 0125 2.4.2将PCR管放入PCR仪中, 按下表设置反应程序: 0126 表8: 说明书 10/27 页 13 CN 110846382 A 13 0127 0128 2.5PCR扩增产物的纯化: 0129 2.5.1向1.5ml离心管中加入50 L PCR扩增产物, 90 L AMPure XP纯化磁珠和35 L 异丙醇, 涡旋震荡10秒钟充分混匀, 之后室温放置5分钟; 0130 2.5.2将离心管固定于磁力架上。
44、静置5min, 之后用移液器充分弃去溶液; 0131 2.5.3保持离心管固定于磁力架上, 向离心管中加入300 L 80乙醇, 之后用移液 器充分弃去溶液; 0132 2.5.4重复2.5.3步骤1次; 0133 2.5.5短暂离心后将离心管重新固定于磁力架上, 用移液器充分弃去管底溶液; 0134 2.5.6室温放置5-10min, 使乙醇充分挥发; 0135 2.5.7向离心管中加入25 L去离子水, 涡旋震荡使磁珠充分悬浮于溶液中, 之后室 温放置5min; 0136 2.5.8将离心管固定于磁力架上静置5min, 之后用移液器将溶液转移至新的1.5ml 离心管中。 0137 2.6文。
45、库浓度测定: 0138 取1 L文库用Qubit进行浓度测定。 0139 3.文库中DNA片段分布范围检测: 0140 3.1根据2.6中浓度测定的结果用稀释液将文库稀释为浓度为1-2ng/ L, 体积为10 L的样品; 0141 3.2将稀释后文库放入Qseq100中, 进行DNA分部范围的检测, 检测结果见图5A和图 5B。 0142 图5A和图5B示出了全长接头与短接头建库效果的比较。 其中, 图5A为使用全长接 头、 通用引物建库所得的文库中DNA的分布, 从图中可以看出该方案所得的文库中含有大量 的接头二聚体与非特异片段的污染。 图5B为使用本申请的短接头和index引物建库所得的 。
46、文库中DNA的分布。 从图中可以看出, 该方案所得的文库中无明显接头二聚体污染。 0143 实施例3: 0144 1.样品: 怀孕9-16周的孕妇血浆, 用游离DNA提取试剂盒从血浆中提取游离DNA。 0145 2.文库构建: 0146 2.1末端修复与加A: 0147 2.1.1按照下表在PCR管中配置末端修复体系: 0148 表9: 说明书 11/27 页 14 CN 110846382 A 14 0149 0150 2.1.2涡旋震荡10秒钟使溶液充分混匀, 之后将PCR管固定于PCR仪中, 按照下表中 条件进行反应: 0151 表10: 0152 0153 2.2接头连接: 0154 。
47、2.2.1按下表配制连接反应工作液: 0155 表11: 0156 0157 2.2.2涡旋震荡10秒钟使溶液充分混匀, 之后将PCR管固定于PCR仪中按照下表进 行PCR仪程序设置: 0158 表12: 0159 0160 2.3接头连接产物直接进行选择性纯化回收: 0161 2.3.1向1.5ml离心管中加入70 L接头连接产物, 之后用去离子水补足至100ul; 0162 2.3.2按下表13向离心管中加入第一次选择性回收所需加入的磁珠用量: 0163 表13: 说明书 12/27 页 15 CN 110846382 A 15 0164 0165 2.3.3涡旋震荡10秒钟使溶液充分混匀。
48、, 之后将离心管室温放置5min; 0166 2.3.4将离心管固定于磁力架上静置5min, 之后用移液器将溶液转移至新的离心 管中, 此时可以弃去磁珠; 0167 2.3.5按照2.3.2表中的数据向离心管中加入AMPure XP磁珠和异丙醇, 涡旋震荡 使溶液充分混匀后室温放置5min; 0168 2.3.6将离心管固定于磁力架上静置5min, 之后用移液器弃去溶液; 0169 2.3.7保持离心管固定于磁力架上, 向离心管中加入300 L 80乙醇, 之后用移液 器充分弃去溶液; 0170 2.3.8重复2.3.5步骤1次; 0171 2.3.9短暂离心后将离心管重新固定于磁力架上, 用。
49、移液器充分弃去管底溶液; 0172 2.3.10室温放置5-10min, 使乙醇充分挥发; 0173 2.3.11向离心管中加入23 L去离子水, 涡旋震荡使磁珠充分悬浮于溶液中, 之后 室温放置5min; 0174 2.3.12将离心管固定于磁力架上静置5min, 之后用移液器转移将洗脱产物转移至 新的管中备用; 0175 2.4 PCR扩增: 0176 2.4.1按下表配置PCR扩增体系: 0177 表14: 0178 0179 2.4.2将PCR管放入PCR仪中, 按下表设置反应程序: 0180 表15: 说明书 13/27 页 16 CN 110846382 A 16 0181 018。
50、2 2.5 PCR扩增产物的纯化: 0183 2.5.1向1.5ml离心管中加入50 L PCR扩增产物, 90 L AMPure XP纯化磁珠和35 L 异丙醇, 涡旋震荡10秒钟充分混匀, 之后室温放置5分钟; 0184 2.5.2将离心管固定于磁力架上静置5min, 之后用移液器充分弃去溶液; 0185 2.5.3保持离心管固定于磁力架上, 向离心管中加入300 L 80乙醇, 之后用移液 器充分弃去溶液; 0186 2.5.4重复2.5.3步骤1次; 0187 2.5.5短暂离心后将离心管重新固定于磁力架上, 用移液器充分弃去管底溶液; 0188 2.5.6室温放置5-10min, 使。
- 内容关键字: 胎儿 游离 DNA 富集 方法
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