耐硫酸钠的木糖苷酶突变体T326D及其制备和用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911268839.2 (22)申请日 2019.12.11 (71)申请人 云南师范大学 地址 650500 云南省昆明市呈贡区聚贤街 768号 (72)发明人 周峻沛黄遵锡张蕊李娜 韩楠玉唐湘华 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 邹仕娟 (51)Int.Cl. C12N 9/42(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C02F 3。

2、/34(2006.01) C02F 103/24(2006.01) C02F 103/28(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 耐硫酸钠的木糖苷酶突变体T326D及其制备 和用途 (57)摘要 本发明公开了一种耐硫酸钠的木糖苷酶突 变体T326D及其制备和用途， 该突变体T326D的氨 基酸序列由野生木糖苷酶HJ14GH43第326位的苏 氨酸突变为天冬氨酸获得， 其序列如SEQID NO.1所示。 与野生酶HJ14GH43相比， 本发明的突 变酶T326D在高浓度Na2SO4中的稳定性得到了增 强。 经10.030.0(w/v)的Na2SO4处理60mi。

3、n 后， 野生酶HJ14GH43的活性为4778， 突变酶 T326D的活性为101120。 因此， 本发明的耐硫 酸钠的木糖苷酶突变体T326D可应用于制革、 造 纸、 污水处理等行业。 权利要求书1页 说明书4页 序列表6页 附图2页 CN 110846298 A 2020.02.28 CN 110846298 A 1.一种耐硫酸钠的木糖苷酶突变体T326D， 其特征在于， 该突变体T326D的氨基酸序列 由野生木糖苷酶HJ14GH43第326位的苏氨酸突变为天冬氨酸获得， 其序列如SEQ ID NO.1所 示。 2.一种编码如权利要求1所述的木糖苷酶突变体T326D的基因t326d， 其。

4、特征在于， 该基 因t326d的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 3.一种含有如权利要求2所述的基因t326d的重组载体。 4.根据权利要求3所述的重组载体， 其特征在于， 所述重组载体采用pEasy-E1。 5.一种含有如权利要求2所述的基因t326d的重组菌。 6.根据权利要求5所述的重组菌， 其特征在于， 所述重组菌采用的宿主细胞包含： 大肠 杆菌BL21。 7.如权利要求1所述的木糖苷酶突变体T326D在制革、 造纸和污水处理中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述木糖苷酶突变体T326D用于在含硫酸 钠的液体中对木聚糖或/和含木糖基的物质进行降解。 9.。

5、根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述硫酸钠的浓度为3.030.0。 10.一种如权利要求1所述的木糖苷酶突变体T326D的制备方法， 其特征在于， 该方法包 含： 将如权利要求2所述的基因t326d与表达载体相连接， 获得重组载体； 将所述重组载体 转化宿主细胞， 获得重组菌； 培养所述重组菌株， 诱导木糖苷酶突变体T326D表达， 回收并纯 化表达的木糖苷酶突变体T326D。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110846298 A 2 耐硫酸钠的木糖苷酶突变体T326D及其制备和用途 技术领域 0001 本发明涉及一种木糖苷酶突变体， 具体涉及一种耐硫酸钠的木糖苷酶突变体 T32。

6、6D及其制备和用途。 背景技术 0002 木糖存在于木聚糖、 植物的糖蛋白和动物体内的蛋白聚糖中， 木糖苷酶( -D- xylosidase， EC 3.2.1.37)可将低聚木糖水解为木糖(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews,2005,29:323.)， 也可切除植物糖蛋白和动物体内蛋白聚糖中的木糖(Leszczuk et al.Plant Physiology and Biochemistry,2019,139:681690； Takagaki et al.The Journal of Biological Chemistry,1990,265:。

7、854860.)。 木糖可作为原料， 用于生产乙 醇、 乳酸、 木糖醇等。 0003 盐对酶的性质能产生巨大的影响。 在中性盐中， 酶会发生盐析作用， 导致大部分的 酶在高盐浓度下不具有良好的催化活性。 盐广泛存在于在自然界和各种生产实践中， 包括 污水、 洗涤、 制革、 食品、 造纸等。 具有耐盐性的酶可更好地应用于高盐环境生物技术领域， 例如， 在皮革软化过程中， 需要添加硫酸钠， 在此过程中加入木聚糖酶， 可达到促进皮纤维 松散， 提高成品革的柔软度、 手感和物理机械性能的效果(如中国专利ZL201710574969.3公 开的一种基于木聚糖酶作用的动物皮纤维松散方法)。 0004 因此。

8、， 为了使酶在高盐环境生物技术领域具有更好的应用性， 需要提高酶在盐中 的稳定性。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种耐硫酸钠的木糖苷酶突变体T326D及其制备和用途， 该 突变体解决了现有酶在含硫酸钠液体中不具有良好的稳定性的问题， 经高浓度的硫酸钠处 理后仍具有很好的酶活性。 0006 为了达到上述目的， 本发明提供了一种耐硫酸钠的木糖苷酶突变体T326D， 该突变 体T326D的氨基酸序列由野生木糖苷酶HJ14GH43第326位的苏氨酸突变为天冬氨酸获得， 其 序列如SEQ ID NO.1所示。 0007 本发明还提供了一种编码所述的木糖苷酶突变体T326D的基因t326d， 该。

9、基因 t326d的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0008 本发明还提供了一种含有所述的基因t326d的重组载体。 0009 优选地， 所述重组载体采用pEasy-E1。 0010 本发明还提供了一种含有所述的基因t326d的重组菌。 0011 优选地， 所述重组菌采用的宿主细胞包含： 大肠杆菌BL21。 0012 本发明还提供了所述的木糖苷酶突变体T326D在制革、 造纸和污水处理中的应用。 0013 优选地， 所述木糖苷酶突变体T326D用于在含硫酸钠的液体中对木聚糖或/和含木 糖基的物质进行降解。 说明书 1/4 页 3 CN 110846298 A 3 0014 优选地， 所。

10、述硫酸钠的浓度为3.030.0。 0015 本发明还提供了一种所述的木糖苷酶突变体T326D的制备方法， 该方法包含： 0016 将如权利要求2所述的基因t326d与表达载体相连接， 获得重组载体； 将所述重组 载体转化宿主细胞， 获得重组菌； 培养所述重组菌株， 诱导木糖苷酶突变体T326D表达， 回收 并纯化表达的木糖苷酶突变体T326D。 0017 本发明的耐硫酸钠的木糖苷酶突变体T326D及其制备和用途， 解决了现有酶在含 硫酸钠液体中不具有良好的稳定性的问题， 具有以下优点： 0018 与野生酶HJ14GH43相比， 本发明的突变酶T326D在高浓度Na2SO4中的稳定性得到了 增强。

11、。 经10.030.0(w/v)的Na2SO4处理60min后， 野生酶HJ14GH43的活性为4778， 突 变酶T326D的活性为101120。 因此， 本发明的耐硫酸钠的木糖苷酶突变体T326D可应用 于制革、 造纸、 污水处理等行业。 附图说明 0019 图1为野生酶HJ14GH43和突变酶T326D的SDS-PAGE分析结果。 0020 图2为纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶T326D在NaCl中的稳定性结果。 0021 图3为纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶T326D在KCl中的稳定性结果。 0022 图4为纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶T326D在Na2SO4中的稳。

12、定性结果。 具体实施方式 0023 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范 围。 0024 本发明实验例中的实验材料和试剂如下： 0025 菌株及载体： 大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)和表达载体pEasy-E1均购自 北京全式金生物技术有限公司； 0026 酶类及其它生化试剂： pNP(p-nitrophenol)和pNPX(p-nitrophenyl- -d。

13、- xylopyranoside)均购自Sigma公司， 其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得 到)； 0027 LB培养基： Peptone 10g， Yeast extract 5g， NaCl 10g， 加蒸馏水至1000mL， pH自 然(约为7)。 固体培养基在此基础上加2.0(w/v)琼脂。 0028 以下实验例中未作具体说明的分子生物学实验方法， 均参照 分子克隆实验指南 (第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行， 或者按照试剂盒和产品说明书进行。 0029 实验例1表达载体的构建和转化 0030 根据GenBank记录的木糖苷酶核苷酸序列KY391885(SE。

14、Q ID NO.4)， 合成野生木糖 苷酶HJ14GH43的编码基因hJ14GH43； 另合成突变酶T326D的编码基因t326d(SEQ ID NO.2)。 0031 将合成的木糖苷酶核苷酸和突变酶T326D核苷酸序列分别和表达载体pEasy-E1相 连接， 获得包含hJ14GH43和t326d的表达载体， 将连接产物分别转化大肠杆菌BL21(DE3)， 获 得分别表达野生酶HJ14GH43和突变酶T326D的重组菌株。 说明书 2/4 页 4 CN 110846298 A 4 0032 实验例2野生酶HJ14GH43和突变酶T326D的制备 0033 将含hJ14GH43和t326d的重组。

15、菌株以0.1的接种量分别接种于LB(含100 g mL- 1Amp)培养液中， 37快速振荡16h。 0034 然后， 将此活化的菌液以1接种量接种到新鲜的LB(含100 g mL-1Amp)培养液中， 快速振荡培养约23h(OD600达到0.6-1.0)后， 加入终浓度0.1mM的IPTG进行诱导， 于20继 续振荡培养约20h。 0035 12000rpm离心5min， 收集菌体。 用适量的pH7.0 TrisHCl缓冲液悬浮菌体后， 于 低温水浴下超声波破碎菌体。 0036 以上胞内浓缩的粗酶液经12 ,000rpm离心10min后， 吸取上清并用Nickel- NTAAgarose和0。

16、500mM的咪唑分别亲和和洗脱目的蛋白， 获得纯化的目的蛋白。 0037 如图1所示， 为野生酶HJ14GH43和突变酶T326D的SDS-PAGE分析结果(M： 蛋白质 Marker； W： HJ14GH43)， 表明野生酶HJ14GH43和突变酶T326D在大肠杆菌中都得到了表达， 经 纯化后， 产物均为单一条带。 0038 实验例3纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶T326D的性质测定 0039 采用pNP法测定纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶T326D的活性， 具体如下： 0040 将pNPX溶于缓冲液中， 使其终浓度为2mM； 反应体系含50 L适量酶液， 450 L的2mM 。

17、底物； 底物在反应温度下预热5min后， 加入酶液再反应适当时间， 然后加2mL 1M Na2CO3终止 反应， 冷却至室温后在405nm波长下测定释放出的pNP； 1个酶活单位(U)定义为每分钟分解 底物产生1 mo l pNP所需的酶量。 0041 1、 纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶T326D在NaCl中的稳定性 0042 将纯化的酶液置于3.030.0(w/v)NaCl水溶液中， 在20下处理60min， 然后在 pH7.0及20下进行酶促反应， 以未处理的酶液作为对照。 以pNPX为底物， 反应10min， 测定 纯化的HJ14GH43以及突变酶T326D的酶学性质。 0043。

18、 如图2所示， 纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶T326D在NaCl中的稳定性结果， 表明 野生酶HJ14GH43和突变酶T326D在NaCl中都不太稳定， 经3.030.0(w/v)的NaCl处理 60min后， 野生酶HJ14GH43活性剩余2044， 经5.025.0(w/v)的NaCl处理60min后， 突 变酶T326D活性剩余916。 0044 2、 纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶T326D在KCl中的稳定性 0045 将纯化的酶液置于3.030.0(w/v)KCl水溶液中， 在20下处理60min， 然后在 pH7.0及20下进行酶促反应， 以未处理的酶液作为对照。 以。

19、pNPX为底物， 反应10min， 测定 纯化的HJ14GH43以及突变酶T326D的酶学性质。 0046 如图3所示， 为纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶T326D在KCl中的稳定性结果， 表明 野生酶HJ14GH43和突变酶T326D在KCl中的稳定性比较相似， 经3.030.0(w/v)的KCl处 理60min后， 野生酶HJ14GH43的活性从114降至28， 经5.025.0(w/v)的KCl处理 60min后， 突变酶T326D活性剩余3485。 0047 3、 纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶T326D在Na2SO4中的稳定性 0048 将纯化的酶液置于3.030.0(w。

20、/v)Na2SO4水溶液中， 在20下处理60min， 然后 在pH7.0及20下进行酶促反应， 以未处理的酶液作为对照。 以pNPX为底物， 反应10min， 测 定纯化的HJ14GH43以及突变酶T326D的酶学性质。 说明书 3/4 页 5 CN 110846298 A 5 0049 如图4所示， 为纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶T326D在Na2SO4中的稳定性结果， 表 明野生酶HJ14GH43和突变酶T326D在Na2SO4中的稳定性不同， 经3.030.0(w/v)的Na2SO4 处理60min后， 野生酶HJ14GH43的酶活基本呈下降趋势， 酶活剩余4786， 突变酶T。

21、326D的 酶活则呈现先下降后上升的趋势， 酶活从49可升至120。 0050 尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍， 但应当认识到上述的 描述不应被认为是对本发明的限制。 在本领域技术人员阅读了上述内容后， 对于本发明的 多种修改和替代都将是显而易见的。 因此， 本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。 说明书 4/4 页 6 CN 110846298 A 6 序列表 云南师范大学 耐硫酸钠的木糖苷酶突变体T326D及其制备和用途 4 SIPOSequenceListing 1.0 1 535 PRT Artificial Sequence 1 Met Lys Ile Thr。

22、 Asn Pro Val Leu Lys Gly Phe Asn Pro Asp Pro Ser 1 5 10 15 Ile Cys Arg Val Gly Glu Asp Tyr Tyr Met Ala Val Ser Thr Phe Glu 20 25 30 Trp Phe Pro Gly Val Gln Ile Tyr His Ser Lys Asp Leu Val His Trp 35 40 45 Arg Leu Ala Ala Arg Pro Leu Gln Lys Thr Ser Gln Leu Asp Met Lys 50 55 60 Gly Asn Pro Asp Ser Gl。

23、y Gly Val Trp Ala Pro Cys Leu Ser Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Gly Gln Phe Trp Leu Ile Tyr Ser Asp Ile Lys Val Val Asp Gly 85 90 95 Pro Phe Lys Asp Gly His Asn Tyr Leu Val Thr Ala Ser Glu Val Asp 100 105 110 Gly Asp Trp Ser Glu Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Gly Phe Asp Pro 115 120 125 Ser Leu Phe His Asp H。

24、is Ser Gly Lys Lys Tyr Val Leu Asn Met Leu 130 135 140 Trp Asp His Arg Glu Lys His His Ser Phe Ala Gly Ile Ala Leu Gln 145 150 155 160 Glu Tyr Ser Val Ala Glu Lys Lys Leu Ile Gly Gln Arg Lys Val Ile 165 170 175 Phe Lys Gly Thr Pro Ile Lys Leu Thr Glu Ala Pro His Leu Tyr His 180 185 190 Ile Gly Asp T。

25、yr Tyr Tyr Leu Leu Thr Ala Glu Gly Gly Thr Arg Tyr 195 200 205 Glu His Ala Ala Thr Ile Ala Arg Ser Ser His Ile Glu Gly Pro Tyr 210 215 220 序列表 1/6 页 7 CN 110846298 A 7 Glu Val His Pro Asp Asn Pro Ile Val Ser Ala Phe His Val Pro Glu 225 230 235 240 His Pro Leu Gln Lys Cys Gly His Ala Ser Ile Val Gln 。

26、Thr His Thr 245 250 255 Asn Glu Trp Tyr Leu Ala His Leu Thr Gly Arg Pro Ile Gln Ser Ser 260 265 270 Lys Glu Ser Ile Phe Gln Gln Arg Gly Trp Cys Pro Leu Gly Arg Glu 275 280 285 Thr Ala Ile Gln Lys Leu Glu Trp Lys Asp Gly Trp Pro Tyr Val Val 290 295 300 Gly Gly Lys Glu Gly Thr Leu Glu Val Glu Ala Pro 。

27、Lys Ile Glu Glu 305 310 315 320 Lys Val Phe Ala Pro Asp Tyr His Thr Val Asp Glu Phe Lys Glu Ser 325 330 335 Thr Leu Asn Arg His Phe Gln Thr Leu Arg Ile Pro Phe Thr Asp Gln 340 345 350 Ile Gly Ser Leu Thr Glu Lys Pro Gln His Leu Arg Leu Phe Gly Arg 355 360 365 Glu Ser Leu Thr Ser Lys Phe Thr Gln Ala 。

28、Phe Val Ala Arg Arg Trp 370 375 380 Gln Ser Phe Tyr Phe Glu Ala Glu Thr Ala Val Ser Phe Phe Pro Glu 385 390 395 400 Asn Phe Gln Gln Ala Ala Gly Leu Val Asn Tyr Tyr Asn Thr Glu Asn 405 410 415 Trp Thr Ala Leu Gln Val Thr Tyr Asp Glu Glu Leu Gly Arg Thr Leu 420 425 430 Glu Leu Ser Val Cys Gln Asn Leu 。

29、Ala Phe Ser Gln Pro Leu Thr His 435 440 445 Lys Ile Ile Ile Pro Asp Glu Val Thr Tyr Val Tyr Leu Lys Val Thr 450 455 460 Val Arg Lys Glu Thr Tyr Lys Tyr Ser Tyr Ser Phe Asp Gln Lys Glu 465 470 475 480 Trp Lys Glu Ile Asp Val Pro Phe Glu Ser Ile His Leu Ser Asp Asp 485 490 495 Phe Ile Arg Gly Gly Gly 。

30、Phe Phe Thr Gly Ala Phe Val Gly Met Gln 500 505 510 Cys Gln Asp Thr Ser Gly Glu Arg Leu Pro Ala Asp Phe His Tyr Phe 515 520 525 Arg Tyr Glu Glu Thr Asp Glu 序列表 2/6 页 8 CN 110846298 A 8 530 535 2 1608 DNA Artificial Sequence 2 atgaagatta ccaatccagt gctcaaaggg tttaatcctg atccaagtat ttgccgtgta 60 ggaga。

31、agatt attatatggc cgtctctaca tttgaatggt ttccaggggt gcaaatttat 120 cattcaaagg atctcgtcca ttggcgtctt gctgcgcgtc cattgcaaaa aacgtcgcag 180 ctggatatga aggggaatcc tgactctggc ggggtatggg cgccgtgctt aagctatgct 240 gatgggcagt tttggcttat ttattcagat atcaaagtag tggatggccc atttaaagac 300 ggtcataatt atttggtcac ggc。

32、aagcgag gtggacggcg attggagtga accgatcctg 360 ctcaacagct ctggctttga tccatcttta ttccatgatc acagcgggaa gaaatacgtc 420 ttaaatatgc tgtgggatca tagggaaaag catcattcgt ttgcaggtat tgccttgcag 480 gaatatagtg tggctgaaaa gaagctcatc ggtcaaagga aggtcatttt taaaggcaca 540 ccgattaaac tgacagaagc gccgcatctg tatcatatcg g。

33、tgactacta ctatttatta 600 acggcagaag gaggtacccg gtatgagcat gcagcaacga tcgcccggtc ctcgcatatt 660 gaagggcctt atgaggttca tcctgataac ccgattgtaa gtgccttcca tgtgcctgaa 720 catccgcttc aaaaatgcgg gcatgcttca atcgttcaaa cgcatacaaa tgaatggtat 780 ctcgctcatc tcactggccg cccgattcaa tccagcaagg aatcgatttt tcaacagaga。

34、 840 gggtggtgcc ctttaggaag agaaacagcg atccaaaagc ttgaatggaa ggatggatgg 900 ccttatgttg taggcggaaa agaggggacg ctagaggttg aagcgccaaa gatcgaagaa 960 aaggtttttg caccagatta tcatacagtc gatgaattta aagaatcaac tctaaataga 1020 cactttcaaa cattaagaat tccgtttacc gatcagattg gttcgttaac ggagaaacct 1080 cagcatttaa gg。

35、ttattcgg ccgtgaatct ttaacgtcta agtttaccca agcatttgtt 1140 gcaagacgct ggcaaagctt ttattttgaa gcagagacag ctgtttcgtt cttcccagaa 1200 aactttcagc aagccgcagg tcttgtgaat tattataata cggaaaactg gacagcactc 1260 caggtgacat atgatgagga acttggccgc acgcttgaac tatccgtctg tcaaaacctt 1320 gccttttctc agccgttgac acataaa。

36、atc atcattcctg acgaggtcac ttatgtctat 1380 ttaaaagtga ccgttcggaa agagacatat aaatattctt attcatttga tcagaaagag 1440 tggaaggaaa ttgatgtacc gtttgaatcc atccatttat ccgatgattt cattcgaggt 1500 gggggttttt ttacaggggc atttgtcggt atgcagtgcc aagatacgag cggcgagcgt 1560 cttcctgctg attttcacta ttttcgctat gaggaaacag a。

37、cgaataa 1608 3 535 PRT HJ14GH43 3 Met Lys Ile Thr Asn Pro Val Leu Lys Gly Phe Asn Pro Asp Pro Ser 序列表 3/6 页 9 CN 110846298 A 9 1 5 10 15 Ile Cys Arg Val Gly Glu Asp Tyr Tyr Met Ala Val Ser Thr Phe Glu 20 25 30 Trp Phe Pro Gly Val Gln Ile Tyr His Ser Lys Asp Leu Val His Trp 35 40 45 Arg Leu Ala Ala A。

38、rg Pro Leu Gln Lys Thr Ser Gln Leu Asp Met Lys 50 55 60 Gly Asn Pro Asp Ser Gly Gly Val Trp Ala Pro Cys Leu Ser Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Gly Gln Phe Trp Leu Ile Tyr Ser Asp Ile Lys Val Val Asp Gly 85 90 95 Pro Phe Lys Asp Gly His Asn Tyr Leu Val Thr Ala Ser Glu Val Asp 100 105 110 Gly Asp Trp Ser Glu。

39、 Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Gly Phe Asp Pro 115 120 125 Ser Leu Phe His Asp His Ser Gly Lys Lys Tyr Val Leu Asn Met Leu 130 135 140 Trp Asp His Arg Glu Lys His His Ser Phe Ala Gly Ile Ala Leu Gln 145 150 155 160 Glu Tyr Ser Val Ala Glu Lys Lys Leu Ile Gly Gln Arg Lys Val Ile 165 170 175 Phe Lys Gly。

40、 Thr Pro Ile Lys Leu Thr Glu Ala Pro His Leu Tyr His 180 185 190 Ile Gly Asp Tyr Tyr Tyr Leu Leu Thr Ala Glu Gly Gly Thr Arg Tyr 195 200 205 Glu His Ala Ala Thr Ile Ala Arg Ser Ser His Ile Glu Gly Pro Tyr 210 215 220 Glu Val His Pro Asp Asn Pro Ile Val Ser Ala Phe His Val Pro Glu 225 230 235 240 His。

41、 Pro Leu Gln Lys Cys Gly His Ala Ser Ile Val Gln Thr His Thr 245 250 255 Asn Glu Trp Tyr Leu Ala His Leu Thr Gly Arg Pro Ile Gln Ser Ser 260 265 270 Lys Glu Ser Ile Phe Gln Gln Arg Gly Trp Cys Pro Leu Gly Arg Glu 275 280 285 Thr Ala Ile Gln Lys Leu Glu Trp Lys Asp Gly Trp Pro Tyr Val Val 290 295 300。

42、 Gly Gly Lys Glu Gly Thr Leu Glu Val Glu Ala Pro Lys Ile Glu Glu 305 310 315 320 序列表 4/6 页 10 CN 110846298 A 10 Lys Val Phe Ala Pro Thr Tyr His Thr Val Asp Glu Phe Lys Glu Ser 325 330 335 Thr Leu Asn Arg His Phe Gln Thr Leu Arg Ile Pro Phe Thr Asp Gln 340 345 350 Ile Gly Ser Leu Thr Glu Lys Pro Gln 。

43、His Leu Arg Leu Phe Gly Arg 355 360 365 Glu Ser Leu Thr Ser Lys Phe Thr Gln Ala Phe Val Ala Arg Arg Trp 370 375 380 Gln Ser Phe Tyr Phe Glu Ala Glu Thr Ala Val Ser Phe Phe Pro Glu 385 390 395 400 Asn Phe Gln Gln Ala Ala Gly Leu Val Asn Tyr Tyr Asn Thr Glu Asn 405 410 415 Trp Thr Ala Leu Gln Val Thr 。

44、Tyr Asp Glu Glu Leu Gly Arg Thr Leu 420 425 430 Glu Leu Ser Val Cys Gln Asn Leu Ala Phe Ser Gln Pro Leu Thr His 435 440 445 Lys Ile Ile Ile Pro Asp Glu Val Thr Tyr Val Tyr Leu Lys Val Thr 450 455 460 Val Arg Lys Glu Thr Tyr Lys Tyr Ser Tyr Ser Phe Asp Gln Lys Glu 465 470 475 480 Trp Lys Glu Ile Asp 。

45、Val Pro Phe Glu Ser Ile His Leu Ser Asp Asp 485 490 495 Phe Ile Arg Gly Gly Gly Phe Phe Thr Gly Ala Phe Val Gly Met Gln 500 505 510 Cys Gln Asp Thr Ser Gly Glu Arg Leu Pro Ala Asp Phe His Tyr Phe 515 520 525 Arg Tyr Glu Glu Thr Asp Glu 530 535 4 1608 DNA KY391885 4 atgaagatta ccaatccagt gctcaaaggg t。

46、ttaatcctg atccaagtat ttgccgtgta 60 ggagaagatt attatatggc cgtctctaca tttgaatggt ttccaggggt gcaaatttat 120 cattcaaagg atctcgtcca ttggcgtctt gctgcgcgtc cattgcaaaa aacgtcgcag 180 ctggatatga aggggaatcc tgactctggc ggggtatggg cgccgtgctt aagctatgct 240 gatgggcagt tttggcttat ttattcagat atcaaagtag tggatggccc 。

47、atttaaagac 300 ggtcataatt atttggtcac ggcaagcgag gtggacggcg attggagtga accgatcctg 360 序列表 5/6 页 11 CN 110846298 A 11 ctcaacagct ctggctttga tccatcttta ttccatgatc acagcgggaa gaaatacgtc 420 ttaaatatgc tgtgggatca tagggaaaag catcattcgt ttgcaggtat tgccttgcag 480 gaatatagtg tggctgaaaa gaagctcatc ggtcaaagga 。

48、aggtcatttt taaaggcaca 540 ccgattaaac tgacagaagc gccgcatctg tatcatatcg gtgactacta ctatttatta 600 acggcagaag gaggtacccg gtatgagcat gcagcaacga tcgcccggtc ctcgcatatt 660 gaagggcctt atgaggttca tcctgataac ccgattgtaa gtgccttcca tgtgcctgaa 720 catccgcttc aaaaatgcgg gcatgcttca atcgttcaaa cgcatacaaa tgaatggta。

49、t 780 ctcgctcatc tcactggccg cccgattcaa tccagcaagg aatcgatttt tcaacagaga 840 gggtggtgcc ctttaggaag agaaacagcg atccaaaagc ttgaatggaa ggatggatgg 900 ccttatgttg taggcggaaa agaggggacg ctagaggttg aagcgccaaa gatcgaagaa 960 aaggtttttg caccaaccta tcatacagtc gatgaattta aagaatcaac tctaaataga 1020 cactttcaaa ca。

50、ttaagaat tccgtttacc gatcagattg gttcgttaac ggagaaacct 1080 cagcatttaa ggttattcgg ccgtgaatct ttaacgtcta agtttaccca agcatttgtt 1140 gcaagacgct ggcaaagctt ttattttgaa gcagagacag ctgtttcgtt cttcccagaa 1200 aactttcagc aagccgcagg tcttgtgaat tattataata cggaaaactg gacagcactc 1260 caggtgacat atgatgagga acttggc。