双特异性嵌合抗原受体及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910163481.0 (22)申请日 2019.03.05 (71)申请人 南京市第一医院 地址 210006 江苏省南京市秦淮区长乐路 68号 (72)发明人 赵薇冯振卿朱进唐奇 贾立周章明炯黄骁辰 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 唐循文 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/867(2006.01) A61K。

2、 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种双特异性嵌合抗原受体及其应用 (57)摘要 一种双特异性嵌合抗原受体及其应用， 该双 特异性嵌合抗原受体由CD8， 人源化抗Trop2和 抗PD-L1单链抗体， 跨膜区CD8TM， 以及胞内区 CD28， CD137， 和CD3串联构成。 本发明提供的嵌 合抗原受体CD8-Trop2/PD-L1scFv-CD8TM- CD28-CD137-CD3采用了逆转录病毒技术， 可体 外感染人T淋巴细胞， 所获得的CAR-T细胞可以通 过CAR的单链抗体部分特异性的识别同时表达 Trop2和PD-L1抗原的肿瘤。

3、细胞， 同时激活CAR-T 细胞， 使其释放多种细胞因子， 实现对肿瘤细胞 的特异性杀伤作用。 权利要求书1页 说明书6页 序列表11页 附图4页 CN 109748975 A 2019.05.14 CN 109748975 A 1.一种双特异性嵌合抗原受体， 其特征在于该双特异性嵌合抗原受体由CD8 ， 人源化 抗Trop2和抗PD-L1单链抗体， 跨膜区CD8TM， 以及胞内区CD28， CD137， 和CD3 串联构成。 2.根据权利要求1所述双特异性嵌合抗原受体， 其特征在于编码所述双特异性嵌合抗 原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 3.根据权利要求1所述双特异性嵌合抗原。

4、受体， 其特征在于含有编码双特异性嵌合抗 原受体的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。 4.根据权利要求1所述双特异性嵌合抗原受体， 其特征在于编码所述人抗Trop2单链抗 体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示， 轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示； 编码所述 人抗PD-L1单链抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示， 轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。 5.根据权利要求4所述双特异性嵌合抗原受体， 其特征在于编码所述人抗Trop2单链抗 体的重链核酸序列如SEQ ID NO.5所示， 轻链核酸序列如SEQ ID NO.6所示； 编码所述人抗 PD-L1。

5、单链抗体的重链核酸序列如SEQ ID NO.9所示， 轻链核酸序列如SEQ ID NO.10所示。 6.根据权利要求1所述双特异性嵌合抗原受体， 其特征在于所述CD8 ， 跨膜区CD8TM， 以 及胞内区CD28， CD137， 和CD3 的胞内区串联构成的结果为信号转导结构域， 其中氨基酸序 列分别如SEQ ID NO.11、 SEQ ID NO.13、 SEQ ID NO.15、 SEQ ID NO.17、 SEQ ID NO.19所示。 7.根据权利要求6所述双特异性嵌合抗原受体， 其特征在于编码所述信号转导结构域 的核酸序列分别如SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.14、 。

6、SEQ ID NO.16、 SEQ ID NO.18、 SEQ ID NO.20所示。 8.权利要求1-7任一项所述双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。 9.权利要求8所述双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞在制备抗肿瘤药物中的应 用。 10.一种抗胃癌药物， 其特征在于有效成分为权利要求8所述双特异性嵌合抗原受体修 饰的T淋巴细胞。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109748975 A 2 一种双特异性嵌合抗原受体及其应用 0001 技术领域 0002 本发明属于细胞免疫技术， 具体涉及一种Trop2/PD-L1双特异性嵌合抗原受体及 其应用。 背景技术 0003 嵌合抗原受体T细胞免。

7、疫治疗 （Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy, CAR-T） 用于肿瘤免疫细胞治疗己经取得很大的进展， 特别是在血液系统 肿瘤治疗方面取得了令人振奋的疗效。 CAR-T细胞是将抗体的高亲和性和T淋巴细胞的杀伤 作用相结合， 通过构建特异性嵌合抗原受体载体， 经基因修饰使T细胞表达这种嵌合抗原受 体， 即可特异性识别靶抗原从而杀伤肿瘤细胞。 CAR的结构包括能够识别肿瘤抗原的单链抗 体序列 （scFv） 和胞内免疫受体酪氨酸活化基序 （ITMA， 通常为CD3 ） 以及共刺激分子信号 （CM， 通常为CD28、 CD134、 CD137等。

8、） ， 这样制备的CAR-T细胞一方面可以通过scFv靶向肿瘤细 胞， 另一方面通过胞内分子激活T细胞对肿瘤细胞的杀伤力。 T细胞作为肿瘤免疫细胞治疗 的效应细胞， 主要原因有T细胞反应具有特异性， 分泌各种细胞因子， 杀伤肿瘤细胞； CAR-T 细胞在体内可增殖， 一旦被活化可进行1000倍的克隆扩增； CAR-T细胞可到达抗原所在位点 并清除癌灶； CAR-T细胞反应具有记忆性， 可较长时间维持治疗效果等。 目前临床上采用的 CAR-T细胞为各种T细胞的混合细胞群， 包括CD4+， CD8+， 记忆T细胞， 效应T细胞等， 不同的T 细胞亚群可能在T细胞过继治疗过程中起着协同作用。 000。

9、4 虽然CD19-CAR-T细胞治疗急性白血病已取得重大突破， 但对实体瘤的治疗仍存在 很多问题， 从而导致疗效不佳。 CAR-T嵌合的理想目标抗原是仅在肿瘤细胞高表达， 而在正 常组织中不表达。 CAR-T细胞利用靶向抗原的单链抗体分子能特异性识别肿瘤细胞， 进而通 过免疫共刺激信号分子刺激， 特异性地杀伤肿瘤细胞， 并避免杀伤正常组织， 减少毒副作 用。 一个单链抗体的CAR-T细胞仍然存在on-target/off tumor toxicity的风险， 双特异性 单链抗体则可大大降低这种风险。 另外， 抗原特异性T细胞在患者体内会受到负性调节因子 的调控， 使其抗肿瘤效应丧失或被削弱。 。

10、经研究发现， 体内的这种免疫抑制性环境主要来自 肿瘤微环境， 大量免疫抑制性分子和细胞可部分或完全抑制肿瘤特异性T细胞的增殖活化， 发挥抗肿瘤效应， 进而使抗原特异性T细胞回输治疗的效果被显著削弱， 如目前研究较多的 是程序性死亡受体-1 （programmed death-1， PD-1） 及其配体PD-L1 （programmed death ligand 1， PD-L1） 。 0005 PD-1为负性协同刺激分子受体， 其胞浆区含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序 （ITIM） 和一个免疫受体酪氨酸转换基序 （ITSM） 。 PD-1主要在活化的T、 B和NK细胞上诱导表 达。 PD-1有P。

11、D-L1和PD-L2两个配体， PD-L1广泛表达于多种类型肿瘤细胞上， 而PD-L2仅表达 于活化的巨噬细胞、 树突状细胞、 骨髓来源的基质细胞和个别肿瘤细胞株。 研究表明， PD-1 随T细胞活化程度而逐渐上调， PD-1和PD-L1相互结合后引发抑制信号的产生， 在肿瘤微环 说明书 1/6 页 3 CN 109748975 A 3 境中发挥着关键作用， 不但能阻断T细胞活化第一、 二信号， 阻止效应性T细胞活化增殖， 发 挥抗肿瘤效应， 而且还能辅助调节性T细胞 （reg Latory cell, Treg） 发挥抑制性功能， 甚 至诱导辅助性T细胞 （T helper cells， T。

12、h） 向Treg转化。 PD-1/PD-L1在多种实体瘤中广泛存 在， 可能是CAR-T技术在实体瘤中效果不佳的主要原因之一。 PD-1/PD-L1单克隆抗体在治疗 实体瘤的临床试验中已经取得非常显著的疗效。 有报道称， PD-L1在胃癌组织及胃癌转移淋 巴组织中显著高表达， 并与患者的生存预后相关。 0006 人滋养层细胞表面抗原2 （human trophoblast cell surface antigen 2， TACSTD2/Trop2/M1S1/GA733-1) 是一个膜表面抗原， 位于染色体1q32。 Trop2最早发现在人 滋养层细胞表面， 分子量约为36 kDa， 是单跨膜蛋。

13、白， 分为膜外区、 跨膜区、 膜内区和一个磷 酸化的胞质尾。 Trop2被TNF- 转化酶裂解为胞外域和胞内域， 胞内域离开跨膜区后可以进 入胞浆或者核内发挥作用。 Trop2常过表达于不同的上皮组织肿瘤， 特别是胃腺癌细胞膜表 面， 对肿瘤的恶性生物学行为有促进作用。 可以作为许多恶性肿瘤靶向治疗的靶点。 0007 发明内容 0008 解决的技术问题： 基于背景技术存在的技术问题， 本发明的目的在于提供一种双 特异性嵌合抗原受体及其应用。 0009 技术方案： 一种双特异性嵌合抗原受体， 该双特异性嵌合抗原受体由CD8 ， 人源化 抗Trop2和抗PD-L1单链抗体， 跨膜区CD8TM， 以。

14、及胞内区CD28， CD137， 和CD3 串联构成。 0010 编码上述双特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0011 含有编码双特异性嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0012 编码上述人抗Trop2单链抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示， 轻链氨基酸 序列如SEQ ID NO.4所示。 0013 编码上述人抗Trop2单链抗体的重链核酸序列如SEQ ID NO.5所示， 轻链核酸序列 如SEQ ID NO.6所示。 0014 编码上述人抗PD-L1单链抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示， 轻链氨基酸 序列如SEQ 。

15、ID NO.8所示。 0015 编码上述人抗PD-L1单链抗体的重链核酸序列如SEQ ID NO.9所示， 轻链核酸序列 如SEQ ID NO.10所示。 0016 上述CD8 ， 跨膜区CD8TM， 以及胞内区CD28， CD137， 和CD3 的胞内区串联构成的结 果为信号转导结构域， 其中氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11、 SEQ ID NO.13、 SEQ ID NO.15、 SEQ ID NO.17、 SEQ ID NO.19所示。 0017 编码上述信号转导结构域的核酸序列分别如SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.14、 SEQ ID NO.16、 SEQ ID。

16、 NO.18、 SEQ ID NO.20所示。 0018 上述双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。 0019 上述双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。 0020 一种抗胃癌药物， 有效成分为上述双特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。 0021 有益效果： 本发明根据本实验室从全人源抗体库筛选出的抗Trop2抗体Fab和抗 PD-L1抗体的Fab， 经过密码子优化， 在5 段加上信号肽， 全基因合成嵌合抗原受体CD8 - 说明书 2/6 页 4 CN 109748975 A 4 Trop2/PD-L1 scFv-CD8TM- CD28-CD137-CD3 ， 并将该合。

17、成的序列克隆到逆转录病毒载体 中， 构建出抗人Trop2/PD-L1 CAR表达质粒， 即获得本发明的嵌合抗原受体CD8 -Trop2/PD- L1 scFv-CD8TM- CD28-CD137-CD3 。 0022 利用该嵌合抗原受体与逆转录病毒的包装质粒RD114env在293T细胞中对病毒进 行包装， 利用此逆转录病毒感染T淋巴细胞， 使T细胞表达该嵌合抗原受体。 将获得的CAR-T 细胞在体外与肿瘤细胞共培养， 通过流式细胞术检测CAR-T细胞表面抗原表达情况， CCK-8 法检测该CAR-T细胞对Trop2/PD-L1不同表达水平的胃癌细胞的特异性杀伤作用， 以证实该 双特异性嵌合抗。

18、原受体修饰的T淋巴细胞对胃癌细胞的特异性杀伤作用， 且效应细胞 （E） 和 靶细胞 （T） 在20:1时， 双特异性Trop2/PD-L1 CAR-T细胞杀伤能力(88.12%6.08)高于单特 异性CAR-T细胞(Trop2 CAR-T(67.07%6.05)和PD-L1 CAR-T(51.03%2.99)和独立对照 组(CD19-CAR-T(36.97% 4.07) 和CIK(33.12%3.15)。 因此本发明所述的嵌合抗原受 体CD8 -Trop2/PD-L1 scFv-CD8TM- CD28- CD137- CD3 可以在相关肿瘤治疗中得到应用。 0023 本发明提供的嵌合抗原受体C。

19、D8 -Trop2/PD-L1 scFv-CD8TM- CD28- CD137-CD3 采用了逆转录病毒技术， 体外感染人T淋巴细胞， ELISA实验检测该双特异性Trop2/PD-L1 CAR-T细胞在杀伤表达的Trop2和PD-L1的胃癌细胞时， 释放出IFN-和IL- 2， 且相比于单 特异性CAR-T细胞组和独立对照组， 双特异性的CAR-T细胞在杀伤过程中， 能释放出最多的 细胞因子 （IFN-和IL- 2） 。 0024 本发明提供的嵌合抗原受体CD8 -Trop2/PD-L1 scFv-CD8TM- CD28- CD137-CD3 采用了逆转录病毒技术， 可体外感染人T淋巴细胞，。

20、 所获得的CAR-T细胞可以通过CAR的单链 抗体部分特异性的识别表达同时Trop2和PD-L1的肿瘤细胞， 同时激活CAR-T细胞， 使其释放 多种细胞因子， 实现对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。 0025 附图说明 0026 图1是本发明所述的合成Trop2， PD-L1 scFv及跨膜区和胞内区序列条带的电泳 图， A图泳道1为10000bp核酸分子量标准， 泳道2为Trop2 scFv， 泳道3为跨膜区和胞内信号 区； B图泳道1为PD-L1 scFv， 泳道2为2000bp核酸分子量标准。 0027 图2是本发明所述的Trop2/PD-L1 CAR克隆到逆转录病毒载体中， 用BamH I。

21、和Xho I双酶切鉴定， 释放片段为CD8 -Trop2/PD-L1 scFv-CD8TM-CD28-CD137-CD3 ， 大小约为 1.8kb， 泳道1为2000bp的核酸分子量标准， 泳道2为未酶切的CAR质粒， 泳道3为经BamH I和 Xho I双酶切的质粒。 0028 图3是western blot检测本发明构建的CD8 -Trop2/PD-L1 scFv- CD8TM- CD28- CD137-CD3 转染293T细胞后的表达图， 用抗人CD3 单克隆抗体检测。 泳道1为转染了Trop2/ PD-L1-CAR载体的293T细胞； 泳道2为转染了CD19-CAR载体的293T细胞；。

22、 泳道3为未转染CAR 载体的293T细胞。 0029 图4是流式检测本发明构建的Trop2/PD-L1-CAR修饰的T细胞中CAR分子的表达图。 0030 图5是western blot检测胃癌细胞株BGC823上Trop2和PD-L1的表达图， 正常胃上 皮细胞株GES-1为对照细胞株。 0031 图6是本发明Trop2/PD-L1-CAR双特异性嵌合抗原受体修饰T细胞对Trop2和PD-L1 说明书 3/6 页 5 CN 109748975 A 5 不同表达水平的胃癌细胞的杀伤作用检测图。 将转染后的细胞转入无IL-12培养基中24h， 分别与表达Trop2+和PD-L1+的BGC823。

23、、 BGC823 shRNA-Trop2和shRNA-PD-L1、 BGC823-shRNA- Trop2、 BGC823-shRNA-PD-L1细胞单独孵育4h。 均值标准差由三个独立的实验计算。 (A)以 表达Trop2和PD-L1细胞的BGC823细胞作为CCK-8检测的靶细胞 （T） 。 按x轴上指示的比例添 加效应器细胞(E)。 在各E： T比值上， 不同组间的差异均有统计学意义(P0.0 5)。 (2)以 Trop2+/PD-L1-BGC823细胞作为CCK-8检测的靶细胞。 按x轴上指示的比例添加效应器细胞。 (C)以Trop2-/PD-L1+BGC823细胞作为CCK-8检测的。

24、靶细胞。 按x轴上指示的比例添加效应器 细胞。 (D)以Trop2-/PD-L1-BGC823细胞作为CCK-8检测的靶细胞。 按x轴上指示的比例添加效 应器细胞。 *与单特异性CAR-T组比较， #与双特异性CAR-T组比较， P0.001。 0032 图7是本发明Trop2/PD-L1-CAR双特异性嵌合抗原受体修饰T细胞在对Trop2和PD- L1不同表达水平的胃癌细胞杀伤过程中细胞因子释放的检测图。 (A) ELISA检测Trop2/PD- L1双特异性CAR-T细胞与Trop2+/PD-L1+BGC823细胞以10： 1的比例孵育24h后产生的干扰素- ， 并与其他类型的CAR-T细。

25、胞进行比较。 (B)用ELISA法检测Trop2/PD-L1 CAR-T细胞与 Trop2+/PD-L1-BGC823细胞按E:T=10:1的比例培养24h后产生的IFN-， 并与其他类型的 CAR-T细胞进行比较。 (C)用ELISA法检测双特异性Trop2/PD-L1 CAR-T细胞与Trop2-/PD-L1+ BGC823细胞在E:T=10:1的条件下培养24h后产生的IFN-， 并与其它类型的CAR-T细胞进行 比较。 (D)用ELISA法检测Trop2/PD-L1-CAR-T细胞与Trop2-/PD-L1-BGC823细胞按E:T=10:1 的比例培养24h后产生的IFN-， 并与其。

26、他类型的CAR-T细胞进行比较。 (5)双特异性Trop2/ PD-L1 CAR-T细胞与Trop2+/PD-L1+BGC823细胞按E:T=10:1的比例培养24h后， 用ELISA法检 测其释放的IF-2， 并与其它类型的CAR-T细胞进行比较。 (F)双特异性Trop2/PD-L1 CAR-T细 胞与Trop2+/PD-L1-BGC823细胞按E:T=10:1的比例孵育24h后， 用ELISA法检测IF-2的释放， 并与其它类型的CAR-T细胞进行比较。 (G)双特异性Trop2/PD-L1 CAR-T细胞与Trop2-/PD- L1+BGC823细胞按E:T=10:1的比例孵育24h后。

27、， 用ELISA法检测IF-2的释放， 并与其它类型的 CAR-T细胞进行比较。 (H)双特异性Trop2/PD-L1 CAR-T细胞与Trop2-/PD-L1-BGC823细胞按 E:T=10:1的比例孵育24h后， 用ELISA法检测IF-2的释放， 并与其它类型的CAR-T细胞进行比 较。 *与单特异性CAR-T组比较， #与双特异性CAR-T组比较， P0.001。 0033 具体实施方式 0034 下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。 0035 实施例1 Trop2/PD-L1双特异性嵌合抗原受体逆转录病毒质粒的构建： 1. 根据本实验室噬菌体展示技术筛选到的抗Trop。

28、2及抗PD-L1胞外区的人Fab序列的 VH和VL的氨基酸序列， Trop2 ： VH（SEQ ID NO.3） 、 VL（SEQ ID NO.4） ； PD-L1： VH（SEQ ID NO.7） 、 VL（SEQ ID NO.8） ， 利用Optimum Gene TM基因设计软件优化密码子序列， 在不改变 氨基酸序列的情况下使其更适合人的表达系统。 在VH和VL之间加入连接肽(G4S)3， 前面加上 信号肽CD8 ， 构建获得的双特异性嵌合抗原受体的scFv部分结构为CD8 -Trop2 VH-(G4S)3- Trop2VL-(G4S)3-PD-L1 VH-(G4S)3- Trop2VL。

29、， 连接处引入BamH I和Xho I酶切位点。 同样的 方法酶切Psfg- CD8TM- CD28-CD137-CD3 载体， 用琼脂糖凝胶电泳， 回收目的条带， 结果如 说明书 4/6 页 6 CN 109748975 A 6 图1所示。 0036 2. 回收的片段与酶切后的载体通过In-Fusion PCR （Takara公司） 进行连接， 连接 体系如下， 目的基因酶切产物 100ng、 载体酶切产物 300ng、 In-Fusion 1 L， 加水补足至20 L体系， 37 15min， 50 15min， 连接产物转化， 取10 L产物加入DH5 感受态细胞中， 37 培养过夜， 。

30、挑取单个菌落， 扩大培养， 用质粒提取试剂盒 （Axygene公司） 提取阳性克隆质粒， 经酶切和测序检测， 将正确的载体命名为CD8 -Trop2/PD-L1 scFv-CD8TM-CD28-CD137-CD3 。 核酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0037 双特异性嵌合抗原受体逆转录病毒质粒用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶 切， 酶切体系如下，BamH I 2 L、Xho I 2 L、 10K buffer 5 L、 BSA 5 L、 CAR质粒 5 g， 加 水补足到20 L， 37水浴过夜， 酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳， 在紫外下切取目的条带， 采 用DNA凝胶回。

31、收试剂盒 （Axygene公司） 回收目的片段， 其结果如图2所示。 0038 实施例2 双特异性嵌合抗原受体CD8 -Trop2/PD-L1 scFv-CD8TM- CD28- CD137- CD3 表达鉴 定： 参照无内毒素质粒大提试剂盒内 （天根生物） 的操作说明书提取该双特异性嵌合抗原 受体逆转录病毒质粒， 用PI转染试剂转染到人胚肾细胞293T细胞中， 48h后， 用PBS洗一遍， 用细胞蛋白提取试剂RIPA裂解细胞， 提取转染后的293T细胞的蛋白经10%的SDS-PAGE进行 凝胶电泳， 转膜， 用鼠抗人CD3 抗体孵育4过夜， 再用辣根过氧酶标记的抗小鼠的二抗孵 育1h， EC。

32、L显色。 结果如图3所示， 抗人CD3 抗体能检测到CAR分子表达， 蛋白分子大小与理论 相符， 为75kDa （如图3） 。 0039 实施例3 双特异性嵌合抗原受体CD8 -Trop2/PD-L1 scFv-CD8TM- CD28- CD137- CD3 修饰的 T淋巴细胞的制备： 1. 表达CAR分子的逆转录病毒的包装制备 质粒提取试剂盒提取逆转录病毒的包装质粒pRD114和Peg-pam3质粒， 与CD8 -Trop2/ PD-L1 scFv-CD8TM- CD28-CD137-CD3 逆转录病毒质粒共转染293T细胞， 孵育48h后收集细 胞上清， 4000rpm离心10min， 然。

33、后用0.45 m的滤膜过滤， -80分装冻存。 0040 2. T淋巴细胞的制备 采取30mL健康志愿者的新鲜的抗凝血， 用淋巴细胞分离液 （GE公司） 分离外周血单核细 胞 （PBMC） 。 分离的细胞用包被过CD3和CD28的孔板刺激48h， 用T淋巴细胞培养基GT-T551 （Takara公司） 加3%自身血浆进行诱导培养， 得到T淋巴细胞。 0041 3. CAR-T细胞的制备 用50 g/mL 的RetroNectin （购自Takara 公司） 包被非组织培养24 孔板， 每孔500 L， 4 过夜， 然后每孔加入1.5mL 逆转录病毒， 32放置1h， 弃上清， 再次加入1.5m。

34、L 的逆转录 病毒， 32放置1h， 弃去上清后再孔内加入T 淋巴细胞及逆转录病毒， 从而获得表达CD8 - Trop2/PD-L1 scFv-CD8TM- CD28- CD137- CD3 T 细胞即CAR-T 细胞。 0042 4. 流式检测CAR-T细胞中CAR分子的表达 将表达CD8 -Trop2/PD-L1 scFv-CD8TM- CD28-CD137-CD3 T 细胞即CAR-T 细胞用PE 标记的抗人Fc抗体 （购自Jackson公司） 37孵育1h后， 进行流式检测， 检测结果如图4， 结果 说明书 5/6 页 7 CN 109748975 A 7 表明本方法制备的CAR-T细。

35、胞效率大于90%。 0043 实施例4 嵌合抗原受体CD8 -Trop2/PD-L1 scFv-CD8TM- CD28-CD137-CD3 修饰的T淋巴细胞 对表达Trop2和PD-L1的胃癌细胞的杀伤作用： 1. Western blot检测胃癌细胞中Trop2和PD-L1的表达 BGC823为胃癌细胞， 人胃粘膜上皮细胞GES-1 （凯基公司） ， 细胞用RIPA 细胞裂解液 （已 加Roche 的蛋白酶抑制剂Cocktail Tablets） 冰上裂解30 min后， 提取细胞蛋白， 进行 western blot 检测， 检测结果如图5。 0044 3. CAR-T细胞对胃癌细胞杀伤力。

36、检测 将肿瘤细胞用培养基调整到4106/mL， 冰上放置30min， 用PBS洗涤三遍后， 用1640培 养基重悬细胞， 计数。 分别调整胃癌细胞 （Trop2+/PD-L1+、 Trop2+/PD-L1-、 Trop2-/PD-L1+、 Trop2-/PD-L1-） 至4106/mL， 取250 L 加入到24孔板内， 按E:T为20:1； 10:1； 5:1； 2:1 分别 加入CAR-T细胞5105； 2105； 1105； 5104， 共培养4h， 每孔设置3个复孔， 细胞混匀后， 置于96孔板内放入37， 5%CO2的培养箱中孵育24小时。 吸去细胞上清， 使用PBS溶液清洗3 遍，。

37、 清洗掉孔中未贴壁的细胞， 每孔加入10 L CCK-8溶液+90 L RPMI 1640培养基的混合 液， 37， 5%CO2的培养箱中孵育4小时。 CCK-8检测结果 （如图6） 表明CAR-T细胞对Trop2/PD- L1表达较高的BGC823细胞有较好的杀伤力， 且杀伤能力高于单特异性CAR-T细胞(Trop2 CAR-T和PD-L1 CAR-T)和独立对照组(CD19-CAR-T和CIK)。 0045 4. ELISA检测CAR-T胞在杀伤过程中细胞因子IFN-和IL-2的释放情况。 0046 用无菌包被液来稀释 IFN-抗体 （1:250稀释） 和IL-2 （1:250稀释） , 。

38、在ELISA板 上加入每孔100 L， 放在4冰箱过夜， 进行包被。 第二天从板上吸掉包被液。 用PBS 洗板两 次， 200 L/ 孔。 每孔加入200 L含ELISA Dliuent， 在37放置1小时。 吸去上清， 用PBS再洗 3次。 0047 按E:T=10:1， 将效应细胞 （E） 和靶细胞 （T） 加入24孔板中， 置于37 ， 5%CO2 培养 24 小时。 24 小时后， 洗掉细胞， 用PBS洗板三次。 稀释生物素标记的抗IFN-抗体和IL-2抗 体， 每孔加100 L， 室温孵育1小时。 洗掉抗体， 再用PBS洗4 次。 准备Avidin-HRP， 加100 L 进 每孔。。

39、 室温放置1小时。 洗掉Avidin-HRP， 用PBS-tween20 洗3次， 然后用PBS洗3次。 准备TMB 溶液， 加入100 L 每孔， 室温15分钟， 加入50 L 1M H3PO4溶液终止反应。 酶标仪测定各孔于 450nm 处吸光度值(结果如图7)， 结果表明双特异性Trop2/PD-L1 CAR-T细胞在杀伤表达的 Trop2和PD-L1的胃癌细胞株BGC823时， 释放出IFN-和IL- 2， 且相比于单特异性CAR-T细 胞组和独立对照组， 双特异性的CAR-T细胞在杀伤过程中， 能释放出最多的细胞因子 （IFN- 和IL- 2） 。 说明书 6/6 页 8 CN 10。

40、9748975 A 8 序列表 南京市第一医院 一种双特异性嵌合抗原受体及其应用 20 SIPOSequenceListing 1.0 1 826 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 1 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 20 25 30 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala。

41、 Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 。

42、Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Gly Trp Gly Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu 145 150 155 160 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 。

43、Ser Val Gly Asp Arg 165 170 175 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 180 185 190 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala 195 200 205 Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 210 215 220 序列表 1/11 页 9 CN 109748975 A 9 Ser Gly Th。

44、r Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 225 230 235 240 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe 245 250 255 Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 260 265 270 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala 275 280 285 Le。

45、u Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr 290 295 300 Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val 305 310 315 320 Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr 325 330 335 Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser 340 34。

46、5 350 Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu 355 360 365 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg 370 375 380 Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gl。

47、u 405 410 415 Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 420 425 430 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ile 435 440 445 Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 450 455 460 Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Va。

48、l Lys 465 470 475 480 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 485 490 495 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 500 505 510 Lys Asp Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 515 520 525 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Trp Val Leu Val Va。

49、l Val Gly Gly 序列表 2/11 页 10 CN 109748975 A 10 530 535 540 Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 545 550 555 560 Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn 565 570 575 Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr 580 585 590 Ala Pro Pr。

50、o Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Thr Thr Thr Pro Ala 595 600 605 Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 610 615 620 Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 625 630 635 640 Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 645 650 655 Gl。