猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911046379.9 (22)申请日 2019.10.30 (71)申请人 广西大学 地址 530004 广西壮族自治区南宁市西乡 塘区大学东路100号 (72)发明人 欧阳康杨春杰刘雪婷程振孔 米雪陈樱韦祖樟黄伟坚 (74)专利代理机构 广西南宁公平知识产权代理 有限公司 45104 代理人 杨立华 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006。

2、.01) (54)发明名称 猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测引物 及其试剂盒 (57)摘要 本发明公开了猪肠病毒G型的实时荧光定量 PCR检测引物， 包括上游引物qEV-G-F和下游引物 qEV-G-R， 它们分别具有序列表的SEQ.ID.NO.1和 SEQ.ID.NO.2的碱基序列。 据此， 发明人建立了相 应EV-G实时荧光定量PCR检测方法。 研究表明， 本 发明具有较好的特异性、 敏感性和重复性， 检测 只需在3小时内即可完成， 快捷省时， 成本低， 用 于临床样品中可实现EV-G的快速检测， 对该病的 监控和检测具有重要意义。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 C。

3、N 110607404 A 2019.12.24 CN 110607404 A 1.猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测引物， 其特征在于： 包括上游引物qEV-G-F和下 游引物qEV-G-R， 它们分别具有以下碱基序列： 上游引物qEV-G-F： 5 -CTTGTGCATCCGGTTATGCC-3 ； 下游引物qEV-G-R： 5 -GCAAGCAGGCACAGAGAACGC-3 。 2.权利要求1所述的PCR检测引物在扩增猪肠病毒G型的ORF基因中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述扩增反应条件为95预变性120s； 再 以40个循环进行扩增， 每循环以9515s。

4、变性， 64延伸60s。 4.一种猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于含有上游引物qEV-G- F和下游引物qEV-G-R， 它们分别具有以下碱基序列： 上游引物qEV-G-F： 5 -CTTGTGCATCCGGTTATGCC-3 ； 下游引物qEV-G-R： 5 -GCAAGCAGGCACAGAGAACGC-3 。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于包括以下试剂： 阳性对照标准品、 PCR反应 液、 阴性对照； 所述阳性对照标准品为含有猪肠病毒G型基因序列的重组质粒， PCR反应液包 括上游引物qEV-G-F和下游引物qEV-G-R、 (2x)TB GreenT。

5、MPremix Ex TaqTMII， 阴性对照为 双蒸水。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于： 所述重组质粒以pMD18-T为载体。 7.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于： 所述上游引物qEV-G-F和下游引物qEV- G-R的摩尔比为1： 1。 8.权利要求4所述的试剂盒用于荧光定量PCR测定猪肠病毒G型的含量。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110607404 A 2 猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒 技术领域 0001 本发明属于病毒核酸检测技术领域， 尤其涉及猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检 测引物及其试剂盒。 背景技术 0002 近年来，。

6、 伴随着我国生猪养殖业的快速发展， 规模化程度不断提高， 新的腹泻类病 毒在我国猪群中不断被发现， 其造成的危害也日趋严重。 猪肠病毒G型(Porcine Enterovirus G， EV-G)， 是猪群中普遍存在的一种肠道病毒， 猪是EV-G唯一的自然宿主， 不 同日龄的猪均对该病毒有易感性且感染后有多种不同的临床表现， 如腹泻、 脑脊髓灰质炎、 生殖障碍等。 Yang等人， 2008年3月至2009年5月从我国14个养猪场采集的447份粪便样本进 行RT-PCR检测， 结果显示， 被检猪群中普遍存在EV-G的感染， 且10-15周龄猪的阳性率达 10.1， 该病毒给我国猪群健康造成很大的。

7、潜在威胁。 0003 EV-G属于小RNA病毒科， 肠道病毒属， 为单股正链RNA病毒， 无囊膜， 病毒粒子直径 22-30nm， 呈球形， EV-G的基因组全长约7.3kb， 整个基因组只有一个开放阅读框， 3 端有 polyA尾， 5 端有一个由共价相连接的小蛋白VPg。 在临床表现中， EV-G与猪流行性腹泻病毒 (PEDV)以及猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)的症状相似， 临床上对其难以进行区分， 并且猪群中常同时存在几个肠病毒血清型， 任何年龄猪在感染某一血清型毒株后， 常可见 再感染其他血清型毒株。 目前实验室对该病的检测一般采取普通RT-PCR方法， 但是普通PCR 的灵。

8、敏性较低， 操作繁琐， 耗时较长。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供特异性强、 灵敏度高、 重复性好且操作便捷的猪 肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒。 0005 为解决上述技术问题， 本发明采用以下技术方案： 0006 猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测引物， 包括上游引物qEV-G-F和下游引物 qEV-G-R， 它们分别具有以下碱基序列： 0007 上游引物qEV-G-F： 5 -CTTGTGCATCCGGTTATGCC-3 ； 0008 下游引物qEV-G-R： 5 -GCAAGCAGGCACAGAGAACGC-3 。 0009 上述PCR检测引物在扩增。

9、猪肠病毒G型的ORF基因中的应用。 0010 扩增反应条件为95预变性120s； 再以40个循环进行扩增， 每循环以9515s变 性， 64延伸60s。 0011 猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测试剂盒， 含有上游引物qEV-G-F和下游引物 qEV-G-R， 它们分别具有以下碱基序列： 0012 上游引物qEV-G-F： 5 -CTTGTGCATCCGGTTATGCC-3 ； 0013 下游引物qEV-G-R： 5 -GCAAGCAGGCACAGAGAACGC-3 。 0014 上述试剂盒， 包括以下试剂： 阳性对照标准品、 PCR反应液、 阴性对照； 阳性对照标 说明书 1/4 页 3。

10、 CN 110607404 A 3 准品为含有猪肠病毒G型基因序列的重组质粒， PCR反应液包括上游引物qEV-G-F和下游引 物qEV-G-R、 (2x)TB GreenTM Premix Ex TaqTM II， 阴性对照为双蒸水。 0015 重组质粒以pMD18-T为载体。 0016 上游引物qEV-G-F和下游引物qEV-G-R的摩尔比为1： 1。 0017 上述试剂盒用于荧光定量PCR测定猪肠病毒G型的含量。 0018 发明人在比较NCBI上多条EV-G序列的基础上， 根据ORF基因， 设计了猪肠病毒G型 的实时荧光定量PCR检测引物， 包括上游引物qEV-G-F和下游引物qEV-G。

11、-R， 它们分别具有序 列表的SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的碱基序列。 据此， 发明人采用荧光染料法， 经过对引物 的筛选和反应条件的优化， 建立了相应EV-G实时荧光定量PCR检测方法。 该法通过PCR扩增、 克隆获得阳性重组质粒， 然后以已知浓度的目的基因作为模板梯度稀释后进行荧光定量反 应， 绘制标准曲线图以及标准曲线， 用于计算待测样品中的病毒含量。 将样品检测结果与标 准曲线对比， 确定样品中的目的基因拷贝数， 同时也可以作为实验室检测病毒复制增殖曲 线的一种方法。 研究表明， 该法检测的灵敏度为2.92*10copies/ L， Cq值与质粒拷贝数的对 数之间呈现。

12、很好的线性关系， 相关系数R20.998， 具有很好的重复性； 检测灵敏度比常规 PCR高100倍。 用不同的病毒(包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、 猪轮状病毒(PoRV)、 猪伪狂犬 病毒(PRV)、 猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)、 猪星状病毒(Pastv)、 A型塞内卡病毒 (SVA)、 猪瘟病毒(CSFV)作为模板， 同时设阴性和阳性对照， 进行荧光定量检测， 结果显示， 只有阳性对照出现扩增曲线， 其他均未出现扩增曲线， 表明该方法特异性强。 重复性实验结 果显示， 该方法的变异系数在0.26-1.57之间， 表明该方法的重复性良好。 本发明用于 临床样品中可实现EV-G。

13、的快速检测， 对该病的监控和检测具有重要意义。 附图说明 0019 图1是本发明荧光定量PCR扩增动力学曲线示意图。 0020 图2是本发明荧光定量PCR标准曲线示意图。 0021 图3是本发明荧光定量PCR熔解曲线示意图。 0022 图4是EV-G阳性样品普通PCR检测的电泳图， 图中泳道从左至右依次为： M： DL2000DNA Marker； 1阴性对照； 2阳性。 0023 图5是普通PCR检测灵敏度电泳图， 图中泳道从左至右依次为： M： DL2000 DNA Marker； 1： 2.92*106copies/ L； 2： 2.92*105copies/ L； 3： 2.92*10。

14、4copies/ L； 4： 2.92* 103copies/ L； 5： 2.92*102copies/ L； 6： 2.92*10copies/ L； 7： 阳性对照； 8： 阴性对照。 0024 图6是本发明荧光定量PCR特异性检测结果图， 图中： 1： 阴性对照； 2： PEDV； 3： PoRV； 4： PRV； 5： PRRSV； 6： Pastv； 7： SVA； 8： CSFV； 9： EV-G。 具体实施方式 0025 实施例1、 猪肠病毒G型荧光定量PCR方法的建立 0026 (1)引物的设计与合成 0027 根据GenBank登录的猪肠病毒毒株的ORF基因序列， 应用Pr。

15、imer5.0软件设计出1对 特异引物， 扩增目的片段大小为104bp(SEQ.ID.NO.3)， 引物由杰李生物(上海)技术有限公 司合成， 具体序列如下： 说明书 2/4 页 4 CN 110607404 A 4 0028 上游引物qEV-G-F： 5 -CTTGTGCATCCGGTTATGCC-3 (SEQ.ID.NO.1)； 0029 下游引物qEV-G-R： 5 -GCAAGCAGGCACAGAGAACGC-3 (SEQ.ID.NO.2)。 0030 (2)ORF基因的克隆 0031 根据申请人保存的EV-G阳性样品， 按照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒， 进 行总R。

16、NA的提取， 反转录， 总cDNA样品保存至-80， 采用25 L的反应体系， 反应条件为94 预变性3min， 再以35个循环进行扩增， 每循环以94变性25s， 58延伸25s， 最后72延伸 10min。 扩增完成后， 取10 L产物用1.0琼脂糖凝胶电泳鉴定。 鉴定为阳性的PCR产物用 Omega Gel ExtractionKit(20)胶回收试剂盒进行纯化回收， 克隆到pMD18-T载体并转化到 DH5感受态细胞， 挑取阳性克隆， 并进行测序鉴定。 0032 (3)标准曲线的建立 0033 用质粒提取试剂盒提取重组质粒， 用紫外分光光度计测定OD260nm值， 标准质粒浓 度换算成。

17、copies/ L， 稀释的终浓度在2.92*108-2.92*102copies/ L。 0034 荧光定量反应体系总体积为20 L， 包括(2x)TB GreenTM Premix Ex TaqTM II 10 L、 10uM的上下游引物各1 L、 DNA模版2 L、 灭菌水6 L。 0035 反应条件如下： 95预变性120s； 再以40个循环进行扩增， 每循环以9515s变性， 64延伸60s。 并在每一循环的延伸温度结束时采集荧光信号进行实时检测， 最后进行熔解 曲线分析PCR扩增产物的特异性。 0036 如图2所示， 在稀释的线性浓度范围内， 模板量与对应的Cq值呈线性相关， 相关。

18、系 数为0.998。 标准曲线的斜率为-4.023， 截距为43.51， 直线方程： y-4.023x+43.51。 0037 其中y表示Cq值， x表示Log(病毒数量)， 单位为拷贝数/ L。 0038 (4)敏感性实验 0039 如图5所示， 常规PCR所能检测到的最低含量为2.92*103copies/ L， 而本发明荧光 定量PCR的最低检测量为2.92*10copies/ L。 因此， 本实验建立的荧光定量PCR具有较高的 敏感性， 比常规PCR敏感程度高100倍。 0040 (5)特异性实验 0041 对EV-G、 PEDV、 PoRV、 PRV、 PRRSV、 Pastv、 S。

19、VA、 CSFV进行常规RT-PCR检测， 确保其为 阳性样品后应用本发明荧光定量PCR扩增。 结果如图6所示， 只有EV-G扩增为阳性， Cq值为 20.08， 其他样品均无特异性扩增， 表明该方法具有较强的特异性。 0042 (6)重复性实验 0043 选取110-2-110-5这三个不同稀释度的阳性标准质粒分别进行组内与组间的 重复性试验， 扩增结果如表1， 变异系数在0.26-1.57之间， 说明该荧光定量PCR检测方 法具有良好的重复性。 0044 表1荧光定量PCR的重复性试验结果 0045 说明书 3/4 页 5 CN 110607404 A 5 0046 实施例2 0047 应。

20、用本发明对广西地区采集的27份临床病料样品进行实时荧光定量PCR检测， 结 果如表2所示。 0048 表2应用本发明检测临床样品结果 0049 0050 结论： 在采集的27份临床阳性样品中， 用本发明建立的实时荧光定量PCR方法进行 检测， 其中5份样品为阳性， 阳性率18.52。 说明书 4/4 页 6 CN 110607404 A 6 序列表 广西大学 猪肠病毒G型的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒 3 SIPOSequenceListing 1.0 1 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 cttgtgcatc cggttatgcc 20 2 21 。

21、DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 gcaagcaggc acagagaacg c 21 3 104 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 3 cttgtgcatc cggttatgcc aatgaaggag attcacgaat ctatcaggtg gaccagggat 60 gcgcgcaaca cacaagacca cgtgcgttct ctgtgcctgc ttgc 104 序列表 1/1 页 7 CN 110607404 A 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 8 CN 110607404 A 8 图4 图5 图6 说明书附图 2/2 页 9 CN 110607404 A 9 。