钙卫蛋白异二聚体检测试剂盒及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911056313.8 (22)申请日 2019.10.31 (71)申请人 苏州普瑞森基因科技有限公司 地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区 星湖街218号生物纳米园A5楼505单元 (72)发明人 朱浩朱永亮张荃铭穆延召 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332 代理人 巩克栋 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 33/574(2006.01) G01N 33/577(2006.01) (54)发明名称 一。

2、种钙卫蛋白异二聚体检测试剂盒及其应 用 (57)摘要 本发明提供了一种钙卫蛋白异二聚体检测 试剂盒及其应用， 所述试剂盒包括包被抗体， 所 述包被抗体包括抗髓样相关蛋白8/14抗体。 本发 明的试剂盒采用抗髓样相关蛋白8/14抗体作为 包被抗体， 对样本中微量的钙卫蛋白异二聚体实 现了富集作用， 后续再采用钙卫蛋白单克隆抗体 抗体作为检测抗体进行钙卫蛋白的检测， 基本排 除了其他类型钙卫蛋白抗原对结果的干扰， 提高 了检测灵敏度和结果准确性。 权利要求书2页 说明书6页 CN 110609143 A 2019.12.24 CN 110609143 A 1.一种检测钙卫蛋白异二聚体的试剂盒， 其。

3、特征在于， 所述试剂盒包括包被抗体， 所述 包被抗体包括抗髓样相关蛋白8/14抗体。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述抗髓样相关蛋白8/14抗体的包被浓 度为0.015 g/mL。 3.根据权利要求1或2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述包被抗体直接和/或间接包被在 固相载体上； 优选地， 所述固相载体为酶标板、 磁珠、 微球、 亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少 两种的组合。 4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述抗髓样相关蛋白8/14抗体 标记有生物素。 5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括第一抗体； 优选地。

4、， 所述第一抗体为钙卫蛋白单克隆抗体； 优选地， 所述第一抗体的浓度为0.015 g/mL。 6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括酶标二抗； 优选地， 所述酶标二抗包括HRP标记的羊抗鼠IgG1和/或HRP标记的羊抗兔IgG1； 优选地， 所述酶标二抗的浓度为0.015 g/mL。 7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括阳性对照 品、 阴性对照品、 抗体稀释液、 显色液、 终止液、 封闭液或洗涤液中的任意一种或至少两种的 组合。 8.根据权利要求1-7任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照品为钙卫蛋白标 准品；。

5、 优选地， 所述阳性对照品的浓度为50100ng/mL； 优选地， 所述阴性对照品为牛血清白蛋白； 优选地， 所述阴性对照品的浓度为50100ng/mL。 9.一种如权利要求1-8任一项所述的试剂盒的使用方法， 其特征在于， 所述方法包括以 下步骤： (1)向酶标板中加入待测样本， 同时设置阳性对照组和阴性对照组， 孵育、 洗涤； (2)加入第一抗体， 孵育、 洗涤； (3)加入酶标二抗， 孵育、 洗涤； (4)加入显色液， 孵育， 加入终止液， 检测450nm处的光吸收值； 优选地， 所述待测样本来源于粪便、 体液、 血液或组织中的任意一种或至少两种的组 合， 优选为粪便； 优选地， 所述待。

6、测样本的结果判定为： 所述待测样本的光吸收值/阳性样品的光吸收值小于0.20， 样品判定为钙卫蛋白阴性； 所述待测样本的光吸收值/阳性样品的光吸收值在0.20-0.25之间， 样品判定为可疑样 品； 所述待测样本的光吸收值/阳性样品的光吸收值大于0.25， 样品判定为阳性。 10.一种如权利要求1-8任一项所述的试剂盒在制备肠道疾病检测试剂和/或检测药物 中的应用； 权利要求书 1/2 页 2 CN 110609143 A 2 优选地， 所述肠道疾病包括溃疡性结肠炎、 炎性肠病或结直肠癌中的任意一种或至少 两种的组合。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110609143 A 3 一种钙卫蛋白。

7、异二聚体检测试剂盒及其应用 技术领域 0001 本发明属于医学检验技术领域， 涉及一种钙卫蛋白异二聚体检测试剂盒及其应 用。 背景技术 0002 钙卫蛋白(也称钙防蛋白)是一种来源于中性粒细胞和巨噬细胞的异二聚体蛋白， 具有调节免疫、 诱导细胞凋亡、 抑制细菌生长等功能， 最近， 钙卫蛋白与溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis， UC)、 炎性肠病(inflammatory bowel disease， IBD)和肿瘤关系的 研究也逐渐成为热点。 研究发现， 钙卫蛋白在溃疡性结肠炎、 炎性肠病和肿瘤患者的体液和 排泄物中的含量有所变化， 可以作为肿瘤标志物用于肿瘤的早期诊断。 。

8、0003 钙卫蛋白(calprotectin)由2条重链MRP14和1条轻链MRP8非共价结合形成异二聚 体， 在不同的分化阶段存在不同的形式， 在中性粒细胞和单核细胞的细胞质内表达MRP8和 MRP14单体。 在循环的单核细胞向巨噬细胞随机转化的过程中， MRP8和MRP14表达量呈下调 趋势。 在早期炎症浸润阶段， 活化的中性粒细胞和单核细胞的细胞膜和细胞质中出现MRP8 和MRP14的杂聚体MRP8/14， 即钙卫蛋白。 钙卫蛋白是一种重要的炎症反应性蛋白， 在粪便中 稳定存在。 研究表明， 钙卫蛋白的含量变化能动态反映溃疡性结肠炎的活动性。 UC是一种慢 性非特异性结肠炎症， 患病原因。

9、尚不明确， 病程漫长， 病情轻重不一， 常反复发作， 在我国的 诊断率不断增加。 因此， 维持治疗和预防复发成为治疗的关键。 0004 CN108333368A公开了一种检测人粪便中钙卫蛋白的试剂盒及制备方法， 所述试剂 盒包括盒体本身和位于试剂盒中的检测试纸条； 所述检测试纸条包括底板以及依次设置在 底板上的样品垫、 结合垫1、 结合垫2、 反应膜和吸水纸； 所述结合垫1包被有第一抗钙卫蛋白 抗体-荧光微球偶联物和生物素标记的第二抗钙卫蛋白抗体； 所述结合垫2包被有亲和素； 所述反应膜上按层析方向依次设置检测T线和质控C线， 所述反应膜上T线位置所述检测T线 包被生物素-牛血清白蛋白偶联物或。

10、生物素-鸡卵清白蛋白偶联物， 所述质控C线上包被羊 抗鼠IgG抗体； 所述第一抗钙卫蛋白抗体荧光微球偶联物由如下方法制备得到： 将活化的荧 光微球与第一抗钙卫蛋白抗体偶联， 然后用封闭剂封闭， 获得所述第一抗钙卫蛋白抗体荧 光微球偶联物， 所述封闭剂为包含13wt明胶、 24wtNH2-PEG和0.51wt海藻糖的 2550mM MES缓冲液。 但是所述试剂盒不能用于钙卫蛋白的定量或半定量检测。 0005 因此， 提供一种钙卫蛋白的检测方法及相关试剂盒， 以实现快速、 准确、 灵敏诊断 钙卫蛋白的目的， 具有巨大的应用价值和市场前景。 发明内容 0006 针对现有技术的不足及实际需求， 本发明。

11、提供了一种钙卫蛋白异二聚体检测试剂 盒及其应用， 所述试剂盒采用抗髓样相关蛋白8/14抗体作为包被抗体， 实现了对钙卫蛋白 异二聚体的特异性检测， 检测灵敏度高， 操作简单快速。 0007 为达此目的， 本发明采用以下技术方案： 说明书 1/6 页 4 CN 110609143 A 4 0008 第一方面， 本发明提供了一种检测钙卫蛋白异二聚体的试剂盒， 所述试剂盒包括 包被抗体， 所述包被抗体包括抗髓样相关蛋白8/14抗体。 0009 本发明中， 采用抗髓样相关蛋白8/14抗体(抗MRP8/MRP14抗体)作为包被抗体， 对 样本中微量的钙卫蛋白异二聚体实现了富集作用， 后续再采用钙卫蛋白单。

12、克隆抗体抗体作 为检测抗体进行钙卫蛋白的检测， 基本排除了其他类型钙卫蛋白抗原对结果的干扰， 准确 度更高， 避免了假阴性结果。 0010 优选地， 所述抗髓样相关蛋白8/14抗体的包被浓度为0.015 g/mL， 例如可以是 0.01 g/mL、 0.1 g/mL、 0.5 g/mL、 1 g/mL、 1.5 g/mL、 2 g/mL、 2.5 g/mL、 3 g/mL、 3.5 g/mL、 4 g/mL、 4.5 g/mL或5 g/mL。 0011 优选地， 所述包被抗体直接和/或间接包被在固相载体上， 优选为间接包被。 0012 根据本发明， 所述间接包被为通过生物素与链霉亲和素间的特异。

13、性亲和反应将包 被抗体固定在固相载体上。 0013 优选地， 所述固相载体为酶标板、 磁珠、 微球、 亲和膜或液相芯片中的任意一种或 至少两种的组合， 优选为链霉亲和素酶标板。 0014 优选地， 所述抗髓样相关蛋白8/14抗体标记有生物素。 0015 本发明中， 酶标板采用包被抗体抗MRP8/MRP14抗体进行包被， 方法为： 向至少8孔 的酶标板中加入包被液， 每孔100 L， 包被液所含抗体的浓度为0.015 g/mL， 4包被过 夜； 采用PBST洗涤液(250 L/孔)洗涤3次后拍干， 用封闭液(150 L/孔)37封闭1h， 用PBST 洗涤液(250 L/孔)洗涤3次后拍干， 放。

14、入真空袋中， 加入干燥剂， 抽至真空， 4保存； 包被液 的配制方法为： 将1.5g Na2CO3和2.92g NaHCO3溶于800mL双蒸水中， 调节pH至9.6， 定容至 1000mL。 0016 优选地， 所述试剂盒还包括第一抗体。 0017 优选地， 所述第一抗体为钙卫蛋白单克隆抗体。 0018 优选地， 所述第一抗体的浓度为0.015 g/mL， 例如可以是0.01 g/mL、 0.1 g/mL、 0.5 g/mL、 1 g/mL、 1.5 g/mL、 2 g/mL、 2.5 g/mL、 3 g/mL、 3.5 g/mL、 4 g/mL、 4.5 g/mL或5 g/mL。 0019。

15、 优选地， 所述试剂盒还包括酶标二抗。 0020 优选地， 所述酶标二抗包括HRP标记的羊抗鼠IgG1和/或HRP标记的羊抗兔IgG1。 0021 优选地， 所述酶标二抗的浓度为0.015 g/mL， 例如可以是0.01 g/mL、 0.1 g/mL、 0.5 g/mL、 1 g/mL、 1.5 g/mL、 2 g/mL、 2.5 g/mL、 3 g/mL、 3.5 g/mL、 4 g/mL、 4.5 g/mL或5 g/mL。 。 0022 本发明中， 酶标二抗采用HRP保护液按照酶标二抗与保护液的体积比为1:(2000- 10000)的比例稀释， 酶标二抗的规格为每瓶12mL； 所述HRP保。

16、护液的配制方法如下： 向1g BSA和2.5g EDTA中加入800mL 1PBS， 定容至1000mL。 0023 优选地， 所述试剂盒还包括阳性对照品、 阴性对照品、 抗体稀释液、 显色液、 终止 液、 封闭液或洗涤液中的任意一种或至少两种的组合。 0024 优选地， 所述阳性对照品为钙卫蛋白标准品。 0025 优选地， 所述阳性对照品的浓度为50100ng/mL， 例如可以是50ng/mL、 60ng/mL、 70ng/mL、 80ng/mL、 90ng/mL或100ng/mL。 说明书 2/6 页 5 CN 110609143 A 5 0026 优选地， 所述阴性对照品为牛血清白蛋白。。

17、 0027 优选地， 所述阴性对照品的浓度为50100ng/mL， 例如可以是50ng/mL、 60ng/mL、 70ng/mL、 80ng/mL、 90ng/mL或100ng/mL。 0028 本发明中， 阳性对照品采用抗体稀释液按照体积比为1:(20-100)的比例稀释钙卫 蛋白标准品， 规格为每管1mL； 阴性对照品采用抗体稀释液按照体积比为1:(20-100)的比例 稀释阴性蛋白， 规格为每管1mL。 0029 本发明中， 抗体稀释液的配制方法为： 向1g BSA中加入800mL 1PBS， 定容至 1000mL， 抗体稀释液的规格为每瓶12mL； 显色液的配制方法为： 向50mg 3。

18、,3,5,5-四甲基 联苯胺(TMB)、 10mL DMSO、 9.8g柠檬酸和1.2mL 30H2O2中加入800mL 1PBS， 定容至 1000mL， 显色液的规格为每瓶12mL； 终止液的配制方法为： 向10mL 98浓硫酸中加入60mL 双蒸水中， 定容至100mL， 终止液的规格为每瓶6mL； 洗涤液的配制方法为： 将0.2g KH2PO4、 2.9g Na2HPO412H2O、 8.0g NaCl、 0.2g KCl和0.5mL tween 20(0.05V/V)加入到180mL双 蒸水中， 调节pH为7.4， 定容至100mL。 0030 第二方面， 本发明提供了一种如第一方面。

19、所述的试剂盒的使用方法， 所述方法包 括以下步骤： 0031 (1)向酶标板中加入待测样本， 同时设置阳性对照组和阴性对照组， 孵育、 洗涤； 0032 (2)加入第一抗体， 孵育、 洗涤； 0033 (3)加入酶标二抗， 孵育、 洗涤； 0034 (4)加入显色液， 孵育， 加入终止液， 检测450nm处的光吸收值。 0035 优选地， 所述待测样本来源于粪便、 体液、 血液或组织中的任意一种或至少两种的 组合， 优选为粪便。 0036 优选地， 所述待测样本的结果判定为： 0037 所述待测样本的光吸收值/阳性样品的光吸收值小于0.20， 样品判定为钙卫蛋白 阴性； 0038 所述待测样本。

20、的光吸收值/阳性样品的光吸收值在0.20-0.25之间， 样品判定为可 疑样品； 0039 所述待测样本的光吸收值/阳性样品的光吸收值大于0.25， 样品判定为阳性。 0040 第三方面， 本发明提供了一种如第一方面所述的试剂盒在制备肠道疾病检测试剂 和/或检测药物中的应用。 0041 优选地， 所述肠道疾病包括溃疡性结肠炎、 炎性肠病或结直肠癌中的任意一种或 至少两种的组合。 0042 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 0043 (1)本发明的钙卫蛋白异二聚体检测试剂盒选择抗MRP8/MRP14抗体作为包被抗 体， 对样本中微量的钙卫蛋白异二聚体实现了富集作用， 显著提高检测的敏感。

21、性和特异性， 人粪便样本中钙卫蛋白异二聚体的检出率高达90， 为肠道疾病的临床诊断提供了一种灵 敏准确的检测工具； 0044 (2)本发明的试剂盒使用方法简便， 快速高效， 应用范围广泛， 具有巨大的市场价 值。 说明书 3/6 页 6 CN 110609143 A 6 具体实施方式 0045 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果， 以下结合实施例对本发明作进 一步地说明。 可以理解的是， 此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明， 而非对本发 明的限定。 0046 实施例中未注明具体技术或条件者， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件， 或者按照产品说明书进行。 所用试剂或仪器未注明。

22、生产厂商者， 均为可通过正规渠道商购 获得的常规产品。 0047 实施例1试剂盒的组装 0048 1、 主要试剂 0049 (1)包被液： 将1.5g Na2CO3和2.92g NaHCO3溶于800mL双蒸水中， 调节pH至9.6， 定 容至1000mL； 0050 (2)酶标二抗： 酶标二抗采用HRP保护液按照酶标二抗与保护液的体积比为1: (2000-10000)的比例稀释， 酶标二抗的规格为每瓶12mL； 0051 (3)阳性对照品： 采用抗体稀释液按照体积比为1:(20-100)的比例稀释钙卫蛋白 标准品， 规格为每管1mL； 0052 (4)阴性对照品： 采用抗体稀释液按照体积比为。

23、1:(20-100)的比例稀释阴性蛋白， 规格为每管1mL； 0053 (5)抗体稀释液； 向1g BSA中加入800mL 1PBS， 定容至1000mL， 抗体稀释液的规 格为每瓶12mL； 0054 (6)HRP保护液： 向1g BSA和2.5g EDTA中加入800mL 1PBS， 定容至1000mL； 0055 (7)显色液： 向50mg 3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)、 10mL DMSO、 9.8g柠檬酸和 1.2mL 30H2O2中加入800mL 1PBS， 定容至1000mL， 显色液的规格为每瓶12mL； 0056 (8)终止液： 向10mL 98浓硫酸中加入60mL。

24、双蒸水中， 定容至100mL， 终止液的规 格为每瓶6mL； 0057 (9)洗涤液： 将0.2g KH2PO4、 2.9g Na2HPO412H2O、 8.0g NaCl、 0.2g KCl和0.5mL tween 20(0.05V/V)加入到180mL双蒸水中， 调节pH为7.4， 定容至100mL。 0058 2、 酶标板的制备 0059 酶标板采用包被抗体抗MRP8/MRP14抗体进行包被， 方法为： 向至少8孔的酶标板中 加入包被液， 每孔100 L， 包被液所含抗体的浓度为0.015 g/mL， 4包被过夜； 采用PBST 洗涤液(250 L/孔)洗涤3次后拍干， 用封闭液(150。

25、 L/孔)37封闭1h， 用PBST洗涤液(250 L/孔)洗涤3次后拍干， 放入真空袋中， 加入干燥剂， 抽至真空， 4保存； 包被液的配制方法 为： 将1.5g Na2CO3和2.92g NaHCO3溶于800mL双蒸水中， 调节pH至9.6， 定容至1000mL。 0060 3、 包被抗体的生物素标记 0061 选择纯化的抗MRP8/MRP14抗体， 进行生物素标记， 步骤如下： 长链活化生物素按浓 度为1mg/mL溶解于二甲基亚砜中； 将待偶联且已经纯化的抗体按浓度为5 g/mL溶解于 0.1mol/L pH9.0的碳酸氢纳溶液中； 将活化生物素液与待偶联的抗体溶液按1:8混合， 在 。

26、室温下温育4h； 在4下在0.05mol/L pH7.2的PBS缓冲液中透析24h， 其中换液4次， 以除 去未结合的游离生物素， 标记好的抗体按比例混合好， 形成包被抗体。 0062 实施例2钙卫蛋白异二聚体的ELISA检测 说明书 4/6 页 7 CN 110609143 A 7 0063 (1)试剂盒在室温中平衡0.5-1h， 用样品稀释液稀释钙卫蛋白； 0064 (2)在96孔酶标板相对应的孔中各加入100 L已稀释好的待测样品、 阴性对照品和 阳性对照品， 封板， 37孵育30min， 去上清； 0065 (3)洗涤液洗涤96孔板， 250 L/孔， 洗涤3次， 丢弃洗涤液， 用力扣。

27、拍到吸水纸上， 避 免包被孔干燥； 0066 (4)将100 L生物素标记的钙卫蛋白单克隆抗体加入酶标板中， 封板， 37孵育 60min， 洗涤液洗涤3次， 然后用力扣拍到吸水纸上， 避免包被孔干燥； 0067 (5)将100 L HRP标记的羊抗鼠IgG1加入酶标板中， 37孵育30min； 0068 (6)加入100 L TMB溶液， 37避光显色10min， 加入50 L终止液， 终止反应， 温和震 荡酶标板， 混匀反应液； 0069 (7)使用酶标仪测定并记录样品的A450吸光值， 5分钟内完成测定. 0070 检测结果应符合下列条件： 0071 钙卫蛋白阳性对照的平均值(P)减去阴。

28、性对照的平均值(N)必须大于0.15， 阴性对 照平均值(N)必须小于或等于0.15， 钙卫蛋白样品的阳性/阴性通过计算样品与阳性对照 (S/P)比值进行判断， 具体计算方法如下： 0072 1)如果S/P值小于0.20， 样品应判定为钙卫蛋白阴性(-)； 0073 2)如果S/P值在0.20-0.25之间， 判断为可疑样品(+/-)， 如果S/P值大于0.25， 判断 为阳性样品(+)。 0074 对比例1 0075 与实施例1相比， 酶标板采用钙卫蛋白单克隆抗体进行包被， 其他条件与实施例1 相同。 0076 对比例2 0077 与实施例1相比， 酶标板采用抗MRP8抗体进行包被， 其他条。

29、件与实施例1相同。 0078 对比例3 0079 与实施例1相比， 酶标板采用抗MRP14抗体进行包被， 其他条件与实施例1相同。 0080 实施例3准确性实验 0081 采用实施例1、 对比例1-3的试剂盒对623名健康捐献者的粪便进行钙卫蛋白异二 聚体的测定， 结果如表1所示。 0082 表1试剂盒的临床诊断结果统计表 0083 编号阳性阴性准确性() 实施例1661799.0 对比例11760697.3 对比例24557892.8 对比例34158293.4 0084 可以看出， 本申请的采用抗MRP8/MRP14抗体作为包被抗体制备的试剂盒在准确性 方面由于其他采用单一抗体作为包被抗体。

30、制备的试剂盒， 本申请的试剂盒在特异性和灵敏 度方面均优于对比例的试剂盒。 0085 实施例4灵敏度实验 0086 采用本发明的试剂盒对钙卫蛋白异二聚体零标准溶液进行20次重复测试， 测定结 说明书 5/6 页 8 CN 110609143 A 8 果取平均值加2倍标准偏差， 即为试剂盒的灵敏度。 0087 结果显示： 本试剂盒对钙卫蛋白异二聚体的灵敏度为0.35 g/mL。 0088 实施例5 0089 采用本发明的试剂盒对100例炎症性肠病(IBD)患者的粪便样本进行钙卫蛋白异 二聚体的测定， 91例为钙卫蛋白阳性， 临床临床灵敏度为91， 表明本发明的试剂盒灵敏度 强， 可以用于临床样本。

31、检测。 0090 综上所述， 本发明的钙卫蛋白异二聚体检测试剂盒选择抗MRP8/MRP14抗体作为包 被抗体， 对样本中微量的钙卫蛋白异二聚体实现了富集作用， 显著提高检测的敏感性和特 异性， 人粪便样本中钙卫蛋白异二聚体的检出率高达90， 为肠道疾病的临床诊断提供了 一种灵敏准确的检测工具； 所述试剂盒使用方法简便， 快速高效， 应用范围广泛， 具有巨大 的市场价值。 0091 申请人声明， 本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法， 但本发明并不局 限于上述详细方法， 即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。 所属技术领域的 技术人员应该明了， 对本发明的任何改进， 对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的 添加、 具体方式的选择等， 均落在本发明的保护范围和公开范围之内。 说明书 6/6 页 9 CN 110609143 A 9 。