高灵敏度检测FLT3/D835Y基因突变的方法、系统和试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910853077.6 (22)申请日 2019.09.10 (71)申请人 中山大学附属第七医院 （深圳） 地址 518107 广东省深圳市光明区新湖街 道圳园路628号 (72)发明人 郭瑶潘逸航孙宏华张登央 陈韵 (74)专利代理机构 北京卓孚律师事务所 11821 代理人 谢梦欣 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 高灵敏度检测FLT3/。

2、D835Y基因突变的方法、 系统和试剂盒 (57)摘要 本发明涉及用于检测FLT3基因的D835Y突变 的方法和系统， 其中包括使用限制性内切酶进行 的酶切和等位基因特异性PCR。 本发明还涉及用 于所述方法和系统的试剂盒。 本发明还涉及所述 方法、 系统和试剂盒在急性髓系白血病(AML)的 诊断、 用药指导和预后判断中的用途。 权利要求书2页 说明书15页 序列表10页 附图4页 CN 110592198 A 2019.12.20 CN 110592198 A 1.一种检测样本中是否存在基因的突变型的方法， 所述方法包括： (a)从所述样本获得核苷酸片段， 所述核苷酸片段包含导致所述突变型的。

3、突变核苷酸 所在的位点； (b)通过限制性内切酶消化步骤(a)中获得的核苷酸片段以获得消化产物， 所述限制性 内切酶仅切割待检测基因的野生型， 而突变型因存在所述突变核苷酸而不被所述限制性内 切酶切割； (c)通过等位基因特异性PCR扩增步骤(b)中获得的所述消化产物， 所述等位基因特异 性PCR使用第一等位基因特异性引物和第一普通引物， 其中所述第一等位基因特异性引物 3 最末端的碱基对应于突变核苷酸所在的位置， 并且所述第一等位基因特异性引物特异性 结合突变型的序列， 使得所述等位基因特异性PCR仅在存在突变型时能够生成突变型等位 基因特异性扩增产物； 和 (d)检测步骤(c)中的扩增产物。

4、， 当存在所述突变型等位基因特异性扩增产物时， 说明 存在所述基因的突变型。 2.权利要求1中所述的方法， 其中步骤(c)的等位基因特异性PCR进一步使用第二普通 引物， 其具有如下特征： 所结合的模板区段中不包含所述突变核苷酸所在的位置， 并且 所述第二普通引物能够与所述第一普通引物一起扩增出长度不同于所述突变型等位 基因特异性扩增产物的普通扩增产物。 3.权利要求2中所述的方法， 其中步骤(c)的等位基因特异性PCR进一步使用第二等位 基因特异性引物， 其具有如下特征： 与所述第一等位基因特异性引物的方向相反， 3 最末端的碱基对应于突变核苷酸所在的位置， 并且特异性结合野生型的序列， 并。

5、且 能够与所述第二普通引物一起扩增出长度不同于所述突变型等位基因特异性扩增产 物和所述普通扩增产物的野生型等位基因特异性扩增产物。 4.限制性内切酶和引物组在制备用于检测受试者样本中FLT3/D835Y突变的试剂盒中 的用途， 其中所述限制性内切酶为EcoRV或XhoI， 所述引物组包含第一等位基因特异性引物和第一普通引物， 其中所述第一等位基因特 异性引物3 最末端的碱基对应于导致FLT3/D835Y的点突变所在的位置， 并且所述第一等位 基因特异性引物特异性结合突变型的序列， 使得所述等位基因特异性PCR仅在存在FLT3/ D835Y突变时能够生成突变型等位基因特异性扩增产物。 5.权利要。

6、求4中所述的用途， 其中所述引物组进一步包含第二普通引物， 其具有如下特 征： 所结合的模板区段中不包含所述突变核苷酸所在的位置， 并且 所述第二普通引物能够与所述第一普通引物一起扩增出长度不同于所述突变型等位 基因特异性扩增产物的普通扩增产物。 6.权利要求5中所述的用途， 其中所述引物组进一步包含第二等位基因特异性引物， 其 具有如下特征： 与所述第一等位基因特异性引物的方向相反， 3 最末端的碱基对应于导致FLT3/D835Y的点突变所在的位置， 并且特异性结合野生型 权利要求书 1/2 页 2 CN 110592198 A 2 的序列， 并且 能够与所述第二普通引物一起扩增出长度不同于。

7、所述突变型等位基因特异性扩增产 物和所述普通扩增产物的野生型等位基因特异性扩增产物。 7.一种引物组， 其包含如下引物： 序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物； 和 以SEQ ID NO:9的序列为模板时， 能够与SEQ ID NO:5的引物扩增出150bp至1000bp的 FLT3/D835Y突变型扩增产物的反向引物。 8.权利要求7所述的引物组， 其进一步包含如下引物： 序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物， 和 以SEQ ID NO:9的序列为模板时， 能够与SEQ ID NO:6的序列扩增出长度与FLT3/D835Y 突变型扩增产物相比相差20的扩增产物的正向引物。 9.包。

8、含权利要求7或8的引物组的试剂盒。 10.权利要求9的试剂盒， 其进一步包含限制性内切酶EcoRV或XhoI。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110592198 A 3 高灵敏度检测FLT3/D835Y基因突变的方法、 系统和试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及FLT3基因的D835Y突变的检测方法和检测系统， 以及用于这种方法和 系统的试剂组合和引物组， 以及将其用于诊断、 预后、 指导用药的用途。 背景技术 0002 Fms样酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase)， 即FLT3， 是III型受体酪氨酸激 酶家族成员。 研究发现， FLT3编码基因的突变在急性。

9、髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)的发生、 进展和预后中具有临床意义。 0003 在约三分之一的AML患者中存在FLT3基因的突变。 FLT3基因突变最常见的两种形 式是内部串联重复(ITD)以及酪氨酸激酶结构域(TKD)中的点突变， 后者以发生在第835位 的天冬氨酸(D835)处的突变最为常见， 并且该氨基酸通常突变为酪氨酸(Y)， 因此将这种突 变类型简称为FLT3/D835Y。 FLT3/D835Y是AML致病性单点突变， 其中在人FLT3基因的核苷酸 序列第835位的天冬氨酸被酪氨酸取代， 约7到10的AML病人为此突变阳性(Estey E, Dohn。

10、er H.Acute myeloid leukaemiaJ.Lancet,2006,368(9550):1894-907)。 该突变可 以使FLT3过度活化(Chen Y,Guo Y,Han J,et al.Generation and characterization of a highly effective protein substrate for analysis of FLT3 activityJ.J Hematol Oncol,2012,5:39.)， 从而导致白血病的发生。 针对该突变的检测尤为重要， 原因 在于可以基于是否具有该突变来对AML患者进行分型， 从而确定治疗方案、。

11、 判断预后。 0004 目前， 并没有成熟稳定的方法检测FLT3/D835Y突变， 临床上多依赖第二代基因测 序技术对AML常见基因突变进行检测， 其中包括FLT3/D835Y。 这种方法以第二代测序为基 础， 虽然可以一次性检测多种突变， 但是价格昂贵， 而且耗时长， 从送检到返回报告往往需 要两周以上， 不利于病人的及时治疗。 另外， 其价格和耗时也不利于对AML病人的持续追踪 检测和对人群的大规模筛查。 除第二代测序外， 也有文献报道了其他方法可以检测FLT3/ D835Y突变。 例如， 有研究者采用PCR扩增目的片段配合EcoRV酶切进行传统测序的方法检测 该突变(Wang L H,W。

12、ang M,Zhou C L,et al.Detection of point mutation at second tyrosine kinase domain of FLT3 gene in acute myeloid leukemiaJ.ZhonghuaXue Ye Xue Za Zhi,2005,26(6):335-8； Nasiri N,Shaikhy M,Zaker F,et al.Detection and biological characteristic of FLT3gene mutations in children with acute leukemiaJ.Arch I。

13、ran Med,2014,17(4):258-61)。 这种方法是一种定性的检测方法， 虽 然易于操作， 但无法用于判断突变率， 并且也不够灵敏。 另外， 由于临床上观察到的FLT3/ D835Y突变均为等位基因杂合型突变， 因此即使在存在突变的患者中也会同时存在大量的 野生型等位基因， 再加上限制酶的效率问题， 使得限制酶检测的结果灵敏度不够高、 特异性 不强。 国外的研究者们也采用单细胞测序或高效液相色谱的方法来检测FLT3/D835Y突变 (Smith C C,Wang Q,Chin C S,et al.Validation of ITD mutations in FLT3 as a t。

14、herapeutic target in human acute myeloid leukaemiaJ.Nature,2012,485(7397): 260-3； Ali A,Gale R E,Shakoori A R.Detection of FLT3/TKD and IDH1 Mutations in 说明书 1/15 页 4 CN 110592198 A 4 Pakistani Acute Myeloid Leukemia Patients by Denaturing HPLCJ.J Cell Biochem,2017,118(5):1174-1181)， 这样的方法虽然灵敏， 但费用昂。

15、贵， 且需要特殊仪器， 同基于第二代测序的检测方法一样， 不适用于患者的持续追踪检测和针对人群的大规模筛 查。 0005 因此， 本领域需要一种能够高效、 准确检测FLT3/D835Y突变的便捷、 廉价的方法。 发明内容 0006 本发明的发明人设计并开发了一种检测FLT3/D835Y的方法， 具体而言在本文中称 为 “联合限制性内切酶的等位基因特异性PCR法” ， 其灵敏度高、 易于操作而且价格便宜， 由 此解决了上述问题。 本发明的方法可以检测出总DNA中最低0.001的FLT3/D835Y突变， 而 且只需要常规PCR仪和DNA凝胶电泳， 操作简单成本低廉， 其高灵敏度可满足临床上对该突。

16、 变的检测要求， 低廉的成本也适用于实验室大规模筛查。 0007 本发明的发明人发现， 编码FLT3中D835这个潜在可能突变位点的核苷酸与其相邻 的核苷酸刚好构成了限制酶的识别位点， 这使得特定的限制酶只会识别并切割野生型等位 基因， 而不会切割发生了FLT3/D835Y突变的序列。 本发明的发明人巧妙地利用了这一序列 特征， 将使用限制酶的酶切反应与针对突变型和野生型区别化设计引物的PCR扩增反应相 结合， 通过限制酶切割使得野生型等位基因变为更短的片段， 提高其后进行的等位基因特 异性PCR的扩增效率， 由此利用两种机理不同但均能对突变型和野生型加以区别的反应的 结合来提高检测方法的灵敏。

17、度、 保证准确性。 另一方面， 虽然包括两种反应， 但无论是限制 酶切， 还是PCR扩增， 都属于分子生物学常规实验， 对实验材料、 设备要求低， 因此能够实现 方便快捷、 成本低廉的检测。 0008 因此， 第一方面， 本发明涉及一种检测样本中是否存在基因的突变型的方法， 所述 方法包括： 0009 (a)从所述样本获得核苷酸片段， 所述核苷酸片段包含导致所述突变型的突变核 苷酸所在的位点； 0010 (b)通过限制性内切酶消化步骤(a)中获得的核苷酸片段以获得消化产物， 所述限 制性内切酶仅切割待检测基因的野生型， 而突变型因存在所述突变核苷酸而不被所述限制 性内切酶切割； 0011 (c。

18、)通过等位基因特异性PCR扩增步骤(b)中获得的所述消化产物， 所述等位基因 特异性PCR使用第一等位基因特异性引物和第一普通引物， 其中所述第一等位基因特异性 引物3 最末端的碱基对应于突变核苷酸所在的位置， 并且所述第一等位基因特异性引物特 异性结合突变型的序列， 使得所述等位基因特异性PCR仅在存在突变型时能够生成突变型 等位基因特异性扩增产物； 和 0012 (d)检测步骤(c)中的扩增产物， 当存在所述突变型等位基因特异性扩增产物时， 说明存在所述基因的突变型。 0013 第二方面， 本发明涉及一种检测样本中是否存在基因的突变型的系统， 所述系统 包括： 0014 (a)从所述样本获。

19、得核苷酸片段的装置， 所述核苷酸片段包含导致所述突变型的 突变核苷酸所在的位点； 说明书 2/15 页 5 CN 110592198 A 5 0015 (b)进行限制性内切酶消化的装置， 其中消化(a)中获得的核苷酸片段以获得消化 产物， 所述限制性内切酶仅切割待检测基因的野生型， 而突变型因存在所述突变核苷酸而 不被所述限制性内切酶切割； 0016 (c)进行等位基因特异性PCR的装置， 其中扩增(b)中获得的所述消化产物， 所述等 位基因特异性PCR使用第一等位基因特异性引物和第一普通引物， 其中所述第一等位基因 特异性引物3 最末端的碱基对应于突变核苷酸所在的位置， 并且所述第一等位基因。

20、特异性 引物特异性结合突变型的序列， 使得所述等位基因特异性PCR仅在存在突变型时能够生成 突变型等位基因特异性扩增产物； 和 0017 (d)检测装置， 其检测(c)中的扩增产物， 当存在所述突变型等位基因特异性扩增 产物时， 说明存在所述基因的突变型。 0018 在第一和第二方面优选的实施方案中， (c)中的等位基因特异性PCR进一步使用第 二普通引物， 其具有如下特征： 所结合的模板区段中不包含所述突变核苷酸所在的位置， 并 且所述第二普通引物能够与所述第一普通引物一起扩增出长度不同于所述突变型等位基 因特异性扩增产物的普通扩增产物。 0019 在第一和第二方面优选的实施方案中， (c)。

21、中的等位基因特异性PCR进一步使用第 二等位基因特异性引物， 其具有如下特征： 与所述第一等位基因特异性引物的方向相反， 3 最末端的碱基对应于突变核苷酸所在的位置， 并且特异性结合野生型的序列， 并且能够与 所述第二普通引物一起扩增出长度不同于所述突变型等位基因特异性扩增产物和所述普 通扩增产物的野生型等位基因特异性扩增产物。 0020 在第一和第二方面优选的实施方案中， 所述普通扩增产物与所述突变型等位基因 特异性扩增产物的长度相差至少10， 至少20， 优选至少30， 更优选至少40， 甚至更 优选至少50或更多。 0021 在第一和第二方面优选的实施方案中， 所述野生型等位基因特异性扩。

22、增产物与所 述突变型等位基因特异性扩增产物和所述普通扩增产物的长度相差至少10， 至少20， 优选至少30， 更优选至少40， 甚至更优选至少50或更多。 0022 在第一和第二方面优选的实施方案中， (d)通过凝胶电泳来检测扩增产物。 优选 地， 所述凝胶电泳为琼脂糖凝胶电泳。 0023 在第一和第二方面优选的实施方案中， 所述基因为FLT3的编码基因， 并且所述突 变为FLT3/D835Y点突变。 0024 在第一和第二方面优选的实施方案中， 所述限制性内切酶为EcoRV或XhoI。 0025 在第一和第二方面的具体实施方案中， 所述第一等位基因特异性引物是正向引物 或反向引物。 所述第一。

23、等位基因特异性引物为正向引物时， 3 末端最后一位为T； 为反向引 物时， 3 末端最后一位为A。 任选地， 所述第一等位基因特异性引物包含一个错配， 优选所述 错配不位于3 末端最后一位， 更优选所述错配位于3 末端倒数第3位。 优选地， 所述第一等 位基因特异性引物为正向引物。 更优选地， 所述第一等位基因特异性引物的序列如SEQ ID NO:5所示。 0026 在第一和第二方面的具体实施方案中， 所述第二等位基因特异性引物是正向引物 或反向引物。 所述第二等位基因特异性引物为正向引物时， 3 末端最后一位为G； 为反向引 物时， 3 末端最后一位为C。 任选地， 所述第二等位基因特异性引。

24、物包含一个错配， 优选所述 说明书 3/15 页 6 CN 110592198 A 6 错配不位于3 末端最后一位， 更优选所述错配位于3 末端倒数第3位。 优选地， 所述第二等 位基因特异性引物为反向引物。 更优选地， 所述第二等位基因特异性引物的序列如SEQ ID NO:6所示。 0027 在第一和第二方面优选的实施方案中， 所述第一普通引物的序列如SEQ ID NO:8 所示。 0028 在第一和第二方面优选的实施方案中， 所述第二普通引物的序列如SEQ ID NO:7 所示。 0029 在最优选的实施方案中， 所述限制性内切酶为EcoRV， 并且使用了序列分别为SEQ ID NO:5、。

25、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的四个引物。 0030 在第一和第二方面优选的实施方案中， 所述样本为血液。 优选地， 所述血液来自人 受试者。 更优选来自年龄在60周岁以上的老年受试者。 或者， 所述血液来自确诊为AML的患 者。 优选所述确诊为AML的患者已经经历过化疗治疗。 0031 在第一方面和第二方面的优选实施方案中， (a)中通过PCR扩增获得所述核苷酸片 段。 在优选的实施方案中， 所述核苷酸片段的长度为300bp至2000bp， 优选400至1500bp， 可 以是400bp、 500bp、 600bp、 700bp、 800bp、 9。

26、00bp、 1000bp、 1100bp、 1200bp、 1300bp、 1400bp、 1500bp， 也可以是由这些点值中的任意两个组成的长度范围以及落入这些长度范围中的 值。 在优选的方面， 待检测的突变位点距离PCR获得的核苷酸片段的3 末端和5 末端的距离 各自都不短于所述核苷酸片段总长度的十分之一， 例如不短于所述核苷酸片段总长度的九 分之一、 不短于所述核苷酸序列长度的八分之一、 不短于所述核苷酸序列长度的七分之一、 不短于所述核苷酸序列长度的六分之一， 优选不短于所述核苷酸片段总长度的五分之一， 更优选不短于所述核苷酸片段总长度的四分之一， 更优选不短于所述核苷酸片段总长度的。

27、 三分之一。 0032 在第一和第二方面优选的具体实施方案中， (a)中的核苷酸片段通过PCR获得。 具 体来说， 可以通过序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的引物获得。 0033 在第一方面和第二方面的具体实施方案中， 步骤(d)通过凝胶电泳来检测步骤(c) 中的产物。 所述凝胶电泳优选琼脂糖凝胶电泳， 优选以1、 1.5、 2、 2.5、 3、 3.5、 4、 4.5、 5浓度的琼脂糖凝胶进行。 在具体的实施方案中， 通过凝胶电泳结果中是否存 在特征性条带来确定是否存在所述基因的突变型。 0034 在第三方面， 本发明涉及限制性内切酶和引物组在制备用于检测受试者样本中。

28、 FLT3/D835Y突变的试剂盒中的用途， 其中所述限制性内切酶为EcoRV或XhoI， 所述引物组包 含第一等位基因特异性引物和第一普通引物， 其中所述第一等位基因特异性引物3 最末端 的碱基对应于导致FLT3/D835Y的点突变所在的位置， 并且所述第一等位基因特异性引物特 异性结合突变型的序列， 使得所述等位基因特异性PCR仅在存在FLT3/D835Y突变时能够生 成突变型等位基因特异性扩增产物。 0035 在第三方面的优选实施方案中， 所述引物组进一步包含第二普通引物， 其具有如 下特征： 所结合的模板区段中不包含所述突变核苷酸所在的位置， 并且所述第二普通引物 能够与所述第一普通引。

29、物一起扩增出长度不同于所述突变型等位基因特异性扩增产物的 普通扩增产物。 0036 在第三方面的优选实施方案中， 所述引物组进一步包含第二等位基因特异性引 说明书 4/15 页 7 CN 110592198 A 7 物， 其具有如下特征： 与所述第一等位基因特异性引物的方向相反， 3 最末端的碱基对应于 导致FLT3/D835Y的点突变所在的位置， 并且特异性结合野生型的序列， 并且能够与所述第 二普通引物一起扩增出长度不同于所述突变型等位基因特异性扩增产物和所述普通扩增 产物的野生型等位基因特异性扩增产物。 0037 在第三方面的优选实施方案中， 所述第一等位基因特异性引物是正向引物或反向 。

30、引物。 所述第一等位基因特异性引物为正向引物时， 3 末端最后一位为T； 为反向引物时， 3 末端最后一位为A。 任选地， 所述第一等位基因特异性引物包含一个错配， 优选所述错配不 位于3 末端最后一位， 更优选所述错配位于3 末端倒数第3位。 优选地， 所述第一等位基因 特异性引物为正向引物。 更优选地， 所述第一等位基因特异性引物的序列如SEQ ID NO:5所 示。 0038 在第三方面的优选实施方案中， 所述第二等位基因特异性引物是正向引物或反向 引物。 所述第二等位基因特异性引物为正向引物时， 3 末端最后一位为G； 为反向引物时， 3 末端最后一位为C。 任选地， 所述第一等位基因。

31、特异性引物包含一个错配， 优选所述错配不 位于3 末端最后一位， 更优选所述错配位于3 末端倒数第3位。 优选地， 所述第二等位基因 特异性引物为反向引物。 更优选地， 所述第二等位基因特异性引物的序列如SEQ ID NO:6所 示。 0039 在第三方面的优选实施方案中， 所述第一普通引物的序列如SEQ ID NO:8所示。 0040 在第三方面的优选实施方案中， 所述第二普通引物的序列如SEQ ID NO:7所示。 0041 在第三方面的最优选的实施方案中， 所述限制性内切酶为EcoRV， 并且使用了序列 分别为SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:7和S。

32、EQ ID NO:8的四个引物。 0042 在第四方面， 本发明涉及引物组， 其包含： 序列如SEQ ID NO:5所示的第一正向引 物； 和以SEQ ID NO:9的序列为模板时， 能够与SEQ ID NO:5的引物扩增出150bp至1000bp的 FLT3/D835Y突变型扩增产物的第一反向引物。 0043 在第四方面的优选实施方案中， 所述第一反向引物的序列如SEQ ID NO:8所示。 0044 在第四方面的优选实施方案中， 所述引物组进一步包含： 序列如SEQ ID NO:6所示 的第二反向引物， 和以SEQ ID NO:9的序列为模板时， 能够与SEQ ID NO:6的序列扩增出长。

33、 度与FLT3/D835Y突变型扩增产物相比相差20的扩增产物的第二正向引物。 0045 在第四方面的优选实施方案中， 所述第二正向引物的序列如SEQ ID NO:7所示。 0046 第五方面， 本发明涉及包含第四方面的引物组的试剂组合。 在优选的方面， 所述试 剂组合进一步包含限制性内切酶EcoRV或XhoI。 0047 第六方面， 本发明涉及第四方面的引物组和第五方面的试剂组合用于制备检测 FLT3/D835Y基因突变的产品的用途， 其中通过先使用限制性内切酶切割之后， 再使用所述 引物进行等位基因特异性扩增的方法以获得产物， 如果产物中存在突变型等位基因特异性 产物， 则确认存在所述FL。

34、T3/D835Y基因突变。 0048 第七方面， 本发明涉及第四方面的引物组和第五方面的试剂组合在制备预先判断 AML患者治疗预后的产品中的用途， 其中通过先使用限制性内切酶切割之后， 再使用所述引 物进行等位基因特异性扩增的方法以获得产物， 如果所述产物中存在突变型等位基因特异 性产物， 则存在所述FLT3/D835Y基因突变。 在第七方面的优选方面， 所述预后判断有助于指 导用药和调整治疗方案。 优选地， 进一步包括检测NPM1突变的试剂。 优选地， 当确认存在 说明书 5/15 页 8 CN 110592198 A 8 FLT3/D835Y基因突变且存在NPM1突变时， 为患者建议诱导治。

35、疗和/或巩固治疗。 0049 第八方面， 本发明涉及第四方面的引物组和第五方面的试剂组合在制备诊断产品 中的用途， 所述诊断产品用于在经历过化疗的AML患者中诊断微小残留病变(minimal residual disease， MRD)， 其中通过先使用限制性内切酶切割之后， 再使用所述引物进行等 位基因特异性扩增的方法以获得产物， 如果所述产物中存在突变型等位基因特异性产物， 则确认存在所述FLT3/D835Y基因突变， 并确认所述AML患者存在微小残留病变。 0050 附图简述 0051 图1描述了本发明的检测方法的一个实施方案的流程， 在该实施方案中， 以外周血 作为检验样本， 以Eco。

36、RV作为限制酶， 检测对象为FLT3/D835Y突变。 0052 图2A-B描述了使用等位基因特异性PCR检测FLT3/D835Y突变的本发明方法的一个 实施方案中的引物设计。 图2A以示意图的方式表示了第一等位基因特异性引物F1_mut(SEQ ID NO:5)、 第二等位基因特异性引物F1_wt(SEQ ID NO:6)、 第二普通引物F1_5(SEQ ID NO: 7)和第一普通引物F1_3(SEQ ID NO:8)这四个引物相对于所要扩增的模板基因片段的相对 位置关系， 并列出了扩增得到的不同片段的长度。 图2B中详细列出了第一等位基因特异性 引物F1_mut(SEQ ID NO:5)。

37、和第二等位基因特异性引物F1_wt(SEQ ID NO:6)与模板DNA的 碱基互补关系。 带有阴影的碱基是对应于GT单点突变的位置， G:T代表同一个位点具有两 种多态性， 在FLT3野生型中为G， 在FLT3/D835Y突变型中为T； 互补链中的C:A也具有相同含 义。 带有外框的碱基是引物序列中特别引入的错配碱基。 0053 图3为凝胶电泳图， 展示了本发明的检测方法的检测灵敏度， 其中使用了不同浓度 的浓度已知的质粒标准品(实施例2)。 在电泳结果中， 287bp的条带指示FLT3/D835Y突变的 存在， 说明该样品为FLT3/D835Y突变阳性； 在野生型样品(最右泳道)中， 相应。

38、的FLT3/WT条 带为164bp。 根据该凝胶电泳结果， 发现本发明的方法能够检出最低0.001的FLT3/D835Y 突变， 框线中标识出了0.001的标准品的电泳结果， 其中阳性287bp条带清晰可见。 0054 图4为凝胶电泳和测序图， 展示了使用本发明的检测方法在AML临床样本中检测 FLT3/D835Y突变的结果(实施例3)。 图4中的上部小图为电泳图， 显示了使用本发明的检测 方法检测13例AML患者外周血DNA样本(AML1-13)的电泳结果， 其中样本AML11带有明显的高 亮287bp条带， 说明为FLT3/D835Y突变阳性。 图4中的下部小图是样本AML11的Sange。

39、r测序结 果， 灰色柱状标注为编码D835位点的核苷酸密码子中的一个核苷酸， 结果显示存在约50 的D835Y突变， 表明存在D835Y杂合突变。 0055 图5为凝胶电泳图， 展示了本发明的检测方法的检测灵敏度， 其中使用了不同浓度 的浓度已知的基因组DNA标准品(实施例4)。 在电泳结果中， 287bp的条带指示FLT3/D835Y突 变的存在， 说明该样品为FLT3/D835Y突变阳性； 在野生型样品(最右泳道)中， 相应的FLT3/ WT条带为164bp。 根据该凝胶电泳结果， 发现本发明的方法能够检出最低0.001的FLT3/ D835Y突变， 框线中标识出了0.001的标准品的电泳。

40、结果， 其中阳性287bp条带清晰可见。 0056 图6比较了本发明方法和对比实验的灵敏度， 其中使用质粒标准品比较了不使用 (上图)和使用(下图)EcoRV消化时， 通过同样的等位基因PCR扩增获得扩增结果。 0057 图7展示了本发明方法和对比实验的灵敏度， 其中使用人基因组DNA标准品比较了 使用(下图)和不使用(上图)EcoRV消化时， 通过同样的等位基因PCR扩增获得扩增结果。 0058 发明详述 说明书 6/15 页 9 CN 110592198 A 9 0059 在本发明的上下文中，“基因” 与其在本领域公知的含义一致， 意指具有蛋白质编 码功能的一段核苷酸。 在本申请具体的实施。

41、方案中， 所述基因指FLT3基因， 即Fms样酪氨酸 激酶3(Fms-like tyrosine kinase)的基因。“等位基因” 指占据染色体相同位置的基因的 两种或多种不同形式中的一种， 这些不同因突变造成。 0060 基因的 “野生型” 指在自然界中占大多数的等位基因基因型。 相对而言， 基因的 “突 变型” 在本文的上下文中指由于突变的发生而具有不同于野生型基因的核苷酸序列的基 因。 基因的 “突变型” 相对于 “野生型” 而言可以具有碱基的缺失、 添加、 取代而导致的变化。 由于密码子的简并性， 有些基因的突变型不会产生不同于野生型的多肽序列， 因此被称为 “沉默突变” 。 在本文。

42、的上下文中， 导致基因的 “突变型” 产生的具体核苷酸被称为 “突变核苷 酸” 或 “突变碱基” ， 即相对于 “野生型” 基因的序列而言有所不同的具体核苷酸。 0061 “FLT3/D835Y突变” 指FLT3基因第835位的天冬氨酸突变为酪氨酸的突变， 其因核 苷酸中的单点突变导致。 FLT3基因的cDNA序列参见序列表中的SEQ ID NO:1， 其编码获得的 氨基酸序列参见序列表中的SEQ ID NO:2。 具体来说， 对于发生了FLT3/D835Y突变的个体， 原先编码天冬氨酸的密码子 “GAT” 变为了编码酪氨酸的密码子 “TAT” 。 FLT3/D835Y是AML致 病性突变， 。

43、约7到10的AML病人为此突变阳性， 并且在临床上观察到的病例基本都为杂 合型突变， 即两个等位基因中只有一个发生了突变。 0062 在本发明的上下文中， 将对应于FLT3/D835Y突变的野生型称为 “FLT3/WT” 或 “FLT3/D835” 或 “FLT3野生型” ， 其中第835位为天冬氨酸， 并且对应的核苷酸编码序列为 GAT。 0063 本发明的方法是一种结合了限制性酶切和等位基因特异性PCR的检测方法。 这种 方法通过使用限制性内切酶对突变型和野生型产生不同的切割结果， 在此之后再进行等位 基因特异性扩增， 针对野生型和突变型获得不同长度的片段， 通过对片段长度的检测来确 定是。

44、否存在突变型。 这种方法通过区别性酶切提高了后续PCR步骤的扩增效率， 改进了对野 生型和突变型的识别灵敏度， 能够实现对突变型更加准确、 灵敏的检测。 本发明的方法可以 用于诊断或非诊断性目的。 0064 图1中以FLT3/D835Y和EcoRV的组合示例了本发明的方法和系统的整个流程。 其中 第一轮PCR反应是常规PCR， 旨在扩增目标基因组区段， 即包括编码FLT3的D835位点的密码 子在内的基因组区段。 第一轮PCR反应的扩增产物的长度可以为任意长度并且能够由本领 域技术人员来决定。 人FLT3的DNA序列是已知的， 参见GeneBank登录号NG_007066.1， 本发明 的SE。

45、Q ID NO:9为FLT3的外显子19至外显子21的DNA序列片段， 本发明关注的点突变位于 FLT3的第20外显子中。 因此， 本领域技术人员也完全有能力根据需要设计合适的引物来进 行所述第一轮PCR反应。 考虑到后续操作的便利性， 同时也考虑到本发明的方法的目的， 需 要使酶切反应和等位基因特异性PCR针对是否包含该突变位点的野生型和突变型产生易于 识别的、 长度不同的片段， 可以调整并设计所述第一轮PCR反应以获得具有所需长度且在恰 当位置包含该突变位点的扩增产物。 例如， 在扩增产物中， 在该突变位点的上游(即5 方向) 和下游(即3 方向)各具有多少bp的核苷酸， 决定了酶切步骤之。

46、后能够被切割的片段与未被 切割的片段的长度差异。 因此优选所述D835位点的密码子不处于第一轮PCR反应的扩增片 段中靠近末端的位置， 并且优选尽量居中。 因此， 在一些实施方案中， 所述扩增产物的长度 可以是300bp至2000bp， 优选400至1500bp， 可以是400bp、 500bp、 600bp、 700bp、 800bp、 说明书 7/15 页 10 CN 110592198 A 10 900bp、 1000bp、 1100bp、 1200bp、 1300bp、 1400bp、 1500bp， 也可以是由这些点值中的任意两 个组成的长度范围以及落入这些长度范围中的值。 0065。

47、 在通过第一轮PCR获得了包含D835位点的密码子的核苷酸片段之后， 是本发明的 方法中最关键的步骤之一限制性酶切步骤， 在图1中以 “EcoRV酶切反应” 为例， 通过限制酶 对第一步的PCR扩增产物进行酶切。 本发明的酶切步骤的特点在于使用的限制酶只能切割 不包含突变的核苷酸， 而突变型会因所发生的核苷酸突变而丧失该限制性内切酶的切割位 点， 因此不会被识别和切割。 通常来说， 限制性内切酶的识别位点都为几个核苷酸的长度， 相应地， 本发明的突变型与野生型的核苷酸序列的区别也在于少数几个核苷酸的不同， 并 且可能发生突变的核苷酸恰巧在野生型中构成了限制性内切酶识别位点的一部分。 在优选 的。

48、实施方案中， 所述突变型是由点突变， 即单一核苷酸的突变， 所导致的， 并且所述单一核 苷酸与邻近的其他核苷酸一起在野生型中构成了限制性内切酶识别位点的一部分。 0066 “限制性内切酶” 或 “限制酶” 为分子生物学领域常用的工具酶， 其能够识别特定排 列的核苷酸构成的位点， 并在该位点进行切割， 使核苷酸断裂。 在本发明的实施方案中， 优 选所述限制性内切酶是EcoRV或XhoI， 因为在野生型FLT3的核苷酸序列中， 编码D835的核苷 酸密码子中的一个或多个核苷酸恰巧与相邻核苷酸构成了这两种限制性内切酶的识别位 点。 0067 EcoRV是一种常用的源于大肠杆菌的二型限制性内切酶， 其。

49、识别并切割双链核苷 酸中如下位点， 并产生平末端。 0068 5 GATATC3 0069 3 CTATAG5 0070 在野生型FLT3中， 编码第835位的天冬氨酸和第836位的亮氨酸的密码子为 GATATC， 即EcoRV的识别序列。 在发生了FLT3/D835Y突变的基因组中， 与第835位和第836位 对应的核苷酸密码子变为TATATC， 突变之后的序列不会被EcoRV识别并切割。 本发明的方法 巧妙地利用了这一序列特点， 将限制酶切步骤与PCR扩增步骤相结合， 通过EcoRV限制酶切 割步骤和PCR扩增步骤两个步骤的组合， 借由酶切切割野生型片段减少了野生型等位基因 片段的存在， 。

50、提高了在后续PCR扩增步骤中扩增突变型的效率， 进而提高了检测方法相对于 单独采用PCR检测的灵敏度。 0071 基于同样的原理， 本发明的酶切步骤也可以使用限制酶XhoI， 其识别如下位点， 并 产生粘性末端。 0072 5 CTCGAG3 0073 5 GAGCTC3 0074 在野生型FLT3中， 编码第833位、 第834位和第835位的核苷酸密码子为GCT CGA GAT， 其中下划线部分即XhoI的限制位点， 包括可能发生导致FLT3/D835Y突变的点突变的核 苷酸G在内。 0075 尽管单独使用上述限制性内切酶也能够在FLT3的野生型和突变型之间产生不同 的产物片段长度谱， 由。