ROR1单克隆抗体、制备方法及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910929922.3 (22)申请日 2019.09.27 (71)申请人 安萌得医药科技 （上海） 有限公司 地址 201114 上海市闵行区新骏环路760号 8幢402室 (72)发明人 范国煌丁成立 (74)专利代理机构 上海领洋专利代理事务所 (普通合伙) 31292 代理人 罗晓鹏 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/13(2006.01) C12N 15/62(2006.01)。

2、 A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种ROR1单克隆抗体、 制备方法及其应用 (57)摘要 本发明提供一种ROR1单克隆抗体， 包括所述 ROR1单克隆抗体包括重链和轻链结构， 所述重链 的重链可变区和所述轻链的轻链可变区各自具 有3个互补决定区CDR， 并添加分泌优化的信号 肽， 能够高效表达ROR1单克隆抗体， 与ROR1受体 的Frizzled结构域特异性结合， 抑制相关通路的 传递， 有效治疗癌症， 特别是在治疗非小细胞肺 腺癌方面具有显著应用性。 权利要求书1页 说明书5页 序列表9页 附图3页 CN 1105909。

3、51 A 2019.12.20 CN 110590951 A 1.一种ROR1单克隆抗体， 其特征在于， 所述ROR1单克隆抗体包括重链和轻链结构， 所述 重链的重链可变区和所述轻链的轻链可变区各自具有3个互补决定区CDR， 其中： 重链可变 区的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.3， 重链可变区的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.4， 重链可变区的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.5， 轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.6， 轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.7， 轻链可变区的CDR3的氨基酸序 列为SEQ ID NO.8。 2。

4、.根据权利要求1所述ROR1单克隆抗体， 其特征在于， 所述重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示。 3.根据权利要求1所述ROR1单克隆抗体， 其特征在于， 所述轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示。 4.根据权利要求1所述ROR1单克隆抗体， 其特征在于， 所述重链可变区VH的N端包括针 对重链分泌表达优化的信号肽序列， VH的C端包括人IgG1恒定区序列CH1-CH3。 5.根据权利要求1所述ROR1单克隆抗体， 其特征在于， 轻链可变区VL的N端加上轻链分 泌表达优化的信号肽序列， 在VL的C端加上人Kappa恒定区序列。 6.根据权利要求1所述ROR1单。

5、克隆抗体， 其特征在于， 所述单克隆抗体的重链和轻链的 氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。 7.根据权利要求1所述ROR1单克隆抗体， 其特征在于， 所述单克隆抗体的重链和轻链的 核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。 8.一种权利要求1所述ROR1单克隆抗体， 其特征在于， 由以下步骤组成： 1)根据重链和轻链的核苷酸序列进行合成序列， 构建到表达抗体中； 2)按照重链和轻链比例进行真核细胞转染， 表达抗体进行蛋白纯化后得到相应ROR1单 克隆抗体。 9.一种权利要求1所述ROR1单克隆抗体在制备治疗癌症药物中的应用。 10.。

6、根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述癌症包括慢性粒细胞淋巴瘤、 套细胞 淋巴瘤、 非小细胞肺癌和乳腺癌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110590951 A 2 一种ROR1单克隆抗体、 制备方法及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域及抗体领域， 具体涉及一种ROR1单克隆抗体、 制备方法 及其应用。 背景技术 0002 受体酪氨酸激酶样孤儿受体-1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor， ROR1)是一个跨膜蛋白， 分子量大小约104kDa， 糖基化修饰后的大小约130kDa。 ROR1受体的胞外域由三个相异。

7、域组成： 膜远端的免疫球蛋白样(Ig-like)域； 中间的卷曲 (Frizzled)域； 以及膜近端的克林格(Kringle)域。 0003 有研究表明ROR1在胚胎发育过程中高水平表达， 并在胚胎、 肌肉、 骨骼、 肺以及神 经系统发育调控中发挥重要的作用。 在发育成熟之后， ROR1蛋白的表达被限制了， 其仅仅少 量表达在一些器官和组织中， 包括肺、 胰脏、 脂肪细胞等。 但是， ROR1在多种肿瘤细胞中表 达， 包括慢性淋巴细胞白血病、 套细胞淋巴瘤、 肺癌、 乳腺癌以及卵巢癌等。 0004 目前已经有一个ROR1单克隆抗体药物(UC-961)在进行临床实验， 用于治疗慢性淋 巴细胞白。

8、血病和套细胞淋巴瘤。 UC-961特异性结合在ROR1蛋白的免疫球蛋白样(Ig-like) 域。 尚未发现针对ROR1其他结构域的ROR1单克隆抗体的问世。 发明内容 0005 针对上述技术问题， 本发明提供了一种ROR1单克隆抗体， 所述ROR1单克隆抗体包 括重链和轻链结构， 所述重链的可变区和所述轻链的可变区各自具有3个互补决定区CDR， 其中： 重链可变区的CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.3， 重链可变区的CDR2的氨基酸序列为 SEQ ID NO.4， 重链可变区的CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.5， 轻链可变区的CDR1的氨基 酸序列为SEQ ID NO.6， 。

9、轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.7， 轻链可变区的 CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.8。 0006 即重链CDR1： GGSFSG(SEQ ID NO:3)； 0007 重链CDR1： NHSGSTS(SEQ ID NO:4)； 0008 重链CDR1： GHSSGWYRRYFDL(SEQ ID NO:5)； 0009 轻链CDR1： RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:6)； 0010 轻链CDR2： DASNRAT(SEQ ID NO:7)； 0011 轻链CDR3： QQRSNWPPT(SEQ ID NO:8)。 0012 本发明进一步提供ROR1。

10、单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所 示。 0013 本发明进一步提供ROR1单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所 示。 0014 本发明中， 将该单克隆抗体命名为G3单克隆抗体。 0015 进一步地， 本发明提供ROR1单克隆抗体， 在所述的重链可变区的氨基酸和轻链可 说明书 1/5 页 3 CN 110590951 A 3 变区的氨基酸序列基础上， 在重链可变区(VH)的N端加上针对重链分泌表达优化的信号肽 序列(例如序列是ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCA， 如。

11、 SEQ ID NO.11所示； 蛋白序列为MGWSCIILFLVATATGVHS， 如SEQ ID NO.12所示)， 在VH的C端 加上人IgG1恒定区序列CH1-CH3(例如核苷酸序列为： 0016 GCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCTCCCTCTTCCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGC TGCTCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATTCCGGCGCCCTGACCTCC GGCGTGCACACATTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTATAGCCTG。

12、TCCTCCGTGGTGACAGTGCCTAGCT CCAGCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTAGCAATACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGA GCCTAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTC CTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGT CCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGG。

13、CGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAG AGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAA GAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGC CTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCT GGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGG。

14、AATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACA ACCCCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCAGATGGCAGC AGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTC TCCTGGCAAATGATAA， 如SEQ ID NO.13所示； 氨基酸序列ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY。

15、SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK， 如 SEQ ID NO.14所示)， 构造出了重链全长的。

16、氨基酸序列。 0017 进一步地， 本发明提供ROR1单克隆抗体， 在轻链可变区VL的N端加上轻链分泌表达 优化的信号肽序列(例如核苷酸序列为： 0018 ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCA， 如SEQ ID NO.15所示； 氨基酸序列为： MGWSCIILFLVATATGVHS， 如SEQ ID NO.16所示)， 在VL的C端加上 人Kappa恒定区序列(例如核苷酸序列为： 0019 AGGACCGTGGCTGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCTCCTAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGC。

17、ACCGC TAGCGTGGTGTGTCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAG AGCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGAGCTCCACCCTGACCC TGTCCAAGGCTGATTATGAGAAGCACAAGGTGTATGCTTGCGAGGTGACACACCAGGGCCTGTCCAGCCCTGTGAC CAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTGATAA， 如SEQ ID NO.17所示； 氨基酸序列为RTVAAPS。

18、VFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC， 如SEQ ID NO.18所示)， 构造出轻链的全长氨基酸序列。 0020 即， 根据本发明的具体实施方案， 本发明的单克隆抗体的重链恒定区为人IgG1-Fc 恒定区， 轻链恒定区为人 链恒定区。 0021 根据本发明的具体实施方案， 本发明的单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列分 别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示； 该抗体为本发明的抗ROR1的全人源单克隆抗体G3的 说。

19、明书 2/5 页 4 CN 110590951 A 4 具体示例。 (SEQ ID NO.1和2不含信号肽， 但是含恒定区) 0022 另一方面， 本发明还提供了ROR1单克隆抗体， 所述单克隆抗体的重链和轻链的核 苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示； 该抗体为本发明的抗ROR1的全人源单克 隆抗体G3的具体示例。 0023 本发明进一步提供一种ROR1单克隆抗体的制备方法， 由以下步骤组成： 0024 1)根据重链和轻链的核苷酸序列进行合成序列， 构建到表达抗体中； 0025 2)按照重链和轻链比例进行真核细胞转染， 表达抗体进行蛋白纯化后得到相应 ROR1单克。

20、隆抗体。 0026 在上述制备方法中， 所述表达抗体为pcDNA3.4。 0027 在上述制备方法中， 所述重链和轻链的质粒量摩尔比例为1： 1-5。 优选1： 2。 防止产 生没有轻链的Fc二聚体。 0028 进一步地， 在上述制备方法中， 上述重链和轻链中包括优化分泌的信号肽。 0029 一种上述ROR1单克隆抗体在制备治疗癌症药物中的应用。 0030 在上述应用中， 癌症包括： 慢性粒细胞淋巴瘤， 套细胞淋巴瘤， 非小细胞肺癌和乳 腺癌 0031 在上述应用中， 所述癌症为非小细胞肺癌腺癌。 0032 综上所述， 本发明利用从天然噬菌体展示库中筛选得到一个单克隆抗体的VH和VL 序列， 。

21、构建与制备出全人源的全长单克隆抗体。 本发明中的单克隆抗体G3特异性得与人 ROR1的卷曲(Frizzled)域结合， 效果优于结合于人ROR1其他结构域的治疗效果， 首次发现， 本单克隆抗体非小细胞肺腺癌具有突出的效果， 其在临床肿瘤的诊疗上有重要的应用价 值。 附图说明 0033 图1抗人ROR1抗体G3与人ROR1的结合(ELISA)； 0034 图2抗人ROR1抗体G3与鼠ROR1的结合(ELISA)； 0035 图3抗人ROR1单克隆抗体G3与JeKo-1细胞ROR1蛋白的结合(FACS)； 0036 图4抗人ROR1单克隆抗体G3与CHO-K1-hROR1细胞表面的ROR1的结合(。

22、FACS)； 0037 图5抗人ROR1单克隆抗体G3与人ROR1蛋白卷曲(Frizzled)域的结合(ELISA)； 0038 图6 G3抗体能抑制NCI-H1975细胞的增殖。 具体实施方式 0039 以下实施例为本领域常用方法或依据商用试剂盒说明书进行操作。 0040 实施例1 0041 抗ROR1抗体的制备方法 0042 本发明中的ROR1抗体VH和VL序列来自于天然噬菌体展示库 (ProMa b Biotechnologies,Inc)。 0043 抗体重链和轻链的序列通过基因合成(即SEQ ID NO.9和10， 并加入相应的分泌信 号肽SEQID NO.11和15)的方式得到， 。

23、分别构建到pcDNA3.4载体上。 将Expi-CHO-S细胞扩培 到一定密度后， 通过瞬时转染的方式(Gibco， ExpiFectamine CHO Transfection Kit 1L)， 说明书 3/5 页 5 CN 110590951 A 5 将该质粒DNA以重链轻链摩尔比为1:2转染到Expi-CHO-S中， 根据转染试剂盒操作规程在转 染后第1天和第5天分别进行补料， 在转染后第7天进行纯化。 0044 表达结束后用Protein A(GE mabselect Sure)进行纯化， 得到纯化后的抗体。 最 后采用SDS-PAGE和SEC-HPLC对抗体进行质量分析。 0045 。

24、抗体分子量为150kDa， 抗体纯度为93.9。 0046 实施例2 0047 ROR1抗体的活性鉴定 0048 I酶联免疫(ELISA)法 0049 用包被液(3.56g Na2CO3和8.4g NaHCO3， pH9.5)稀释重组人ROR1蛋白(购自北京百 普赛斯生物科技有限公司， 产品编号为： RO1-H522y)至1 g/mL包被ELISA 96孔板， 每孔加入 100 L， 4孵育过夜； PBS含2BSA的缓冲液封闭96孔板， 室温孵育1h； PBST(PBS含0.05 Tween 20)洗涤3次后， 每个孔中加入100 L ROR1的抗体分子G3(0.6 g/ml起始浓度， 按5倍。

25、 稀释成8个浓度梯度)室温孵育1h； 以1:10000稀释辣根过氧化物酶偶联的羊抗人IgG Fc二 抗(购自Abcam公司， 产品编号： ab97225)， 按100 L/孔加入到孔内， 室温孵育1h； 配制辣根过 氧化物酶底物显色液(购自上海生工生物工程有限公司， 产品编号： C520026)， 按100 L/孔 加入到孔内， 室温下孵育1-2min后用2mol硫酸中止反应， 酶标仪读取OD450值。 0050 用包被液(3.56g Na2CO3和8.4g NaHCO3， pH9.5)稀释重组鼠ROR1蛋白(购自北京百 普赛斯生物科技有限公司， 产品编号为： RO1-M5221)至1 g/m。

26、L包被ELISA 96孔板， 每孔加入 100 L， 4孵育过夜； PBS含2BSA的缓冲液封闭96孔板， 室温孵育1h； PBST(PBS含0.05 Tween 20)洗涤3次后， 每个孔中加入100 L ROR1的抗体分子G3(15 g/ml起始浓度， 按5倍稀 释成8个浓度梯度)室温孵育1h； PBST洗涤3次后， 以1:10000稀释辣根过氧化物酶偶联的羊 抗人IgG Fc二抗(购自Abcam公司， 产品编号： ab97225)， 按100 L/孔加入到孔内， 室温孵育 1h； 配制辣根过氧化物酶底物显色液(购自上海生工生物工程有限公司， 产品编号： C520026)， 按100 L/。

27、孔加入到孔内， 室温下孵育1-2min后用2mol硫酸中止反应， 酶标仪读取 OD450值。 0051 上述结果显示抗人ROR1抗体G3与人ROR1及鼠ROR1都能结合(图1和2)。 证明该抗体 能够与受体稳定结合。 0052 II流式细胞术(FACS) 0053 采用流式细胞仪(FACS)分析人ROR1抗体与内源性ROR1抗原的结合活性。 0054 具体方法： 收集JeKo-1细胞， 平均分至1.5mL EP管， 每管5105个JeKo-1细胞。 用 PBS洗1次， 1000rpm， 5min。 每管加入含1BSA的PBS封闭液， 4孵育1h， PBS洗1次， 1000rpm， 5min。 。

28、将2管细胞均用100 L PBS重悬， 其余管的细胞分别用100 L不同浓度的ROR1抗体G3 (20 g/mL起始浓度， 4倍稀释成8种浓度梯度)重悬， 4孵育1h， PBS洗2次， 1000rpm， 5min。 0055 加入ROR1抗体的细胞用100 L PE标记的羊抗人IgG-Fc二抗(购自Abcam公司， 产品 编号： ab98596)重悬， 其余2管细胞分别用100 L PBS和PE标记的羊抗人IgG-Fc二抗重悬， 4 避光孵育30min。 PBS洗1次后， 每管均用200 L PBS重悬， 在FACS上进行免疫荧光分析。 0056 采用流式细胞仪(FACS)分析人ROR1抗体与。

29、外源性ROR1抗原的结合活性。 具体方 法： 用包装人ROR1蛋白表达质粒的慢病毒感染CHO-K1细胞， 得到过表达ROR1的稳转细胞株 CHO-K1-hROR1。 收集稳定表达人ROR1的细胞株CHO-K1-hROR1， 平均分至1.5mL EP管， 每管5 说明书 4/5 页 6 CN 110590951 A 6 105个CHO-K1-human-ROR1细胞。 PBS洗1次， 300g， 5min。 每管加入含1BSA的PBS封闭液， 4 孵育1h， PBS洗1次， 300g， 5min。 将其中2管细胞用100 L PBS重悬， 其余管的细胞分别用 100 L不同浓度的ROR1抗体G3。

30、(30 g/mL起始浓度， 3倍稀释成8种浓度梯度)重悬， 4孵育 1h， PBS洗2次， 300g， 5min。 加入ROR1抗体的细胞用100 L PE标记的羊抗人IgG-Fc二抗(购自 Abcam公司， 产品编号： ab98596)重悬， 其余2管细胞分别用100 L PBS和PE标记的羊抗人 IgG-Fc二抗重悬， 4避光孵育30min。 PBS洗1次后， 每管均用200 L PBS重悬， 在FACS上进行 免疫荧光分析。 0057 上述结果显示抗人ROR1抗体G3能与JeKo-1和CHO-K1-hROR1细胞表面的ROR1结合 (图3和4)。 0058 实施例3 0059 ROR1抗。

31、体抗原结合表位鉴定 0060 重组ROR1蛋白包含3种胞外结构域： Ig结构域， 卷曲结构域， 克林格结构域(购自北 京百普赛斯生物科技有限公司， 产品编号分别为： RO1-H5221、 RO1-H5222、 RO1-H5223)。 用包 被液(3.56g Na2CO3和8.4g NaHCO3， pH9.5)分别稀释3种ROR1蛋白的胞外结构域至1 g/mL， 包被ELISA 96孔板， 每孔加入100 L， 4孵育过夜； PBS含2BSA的缓冲液封闭96孔板， 室温 孵育1h； PBST(PBS含0.05Tween 20)洗涤3次后， 每个孔中加入100 L ROR1的抗体分子G3 和C3(。

32、20 g/ml起始浓度， 按5倍稀释成8个浓度梯度)室温孵育1h； PBST洗涤3次后， 以1: 10000稀释辣根过氧化物酶偶联的羊抗人IgG Fc二抗(购自Abcam公司， 产品编号： ab97225)， 按100 L/孔加入到孔内， 室温孵育1h； 配制辣根过氧化物酶底物显色液(购自上 海生工生物工程有限公司， 产品编号： C520026)， 按100 L/孔加入到孔内， 室温下孵育10min 后用2mol硫酸中止反应， 酶标仪读取OD450值。 0061 上述结果显示抗人ROR1抗体G3能人ROR1蛋白卷曲(Frizzled)域结合(图5)。 0062 实施例4 0063 G3抗体能抑。

33、制NCL-H1975细胞的增殖 0064 选择96孔板， 每孔铺入3103个NCL-H1975细胞(人非小细胞肺癌腺癌细胞， ATCC， CRL-5908)， 37， 5CO2培养箱培养过夜。 第二天分别加入ROR1抗体G3和UC-961(根据 US20160097776A1制得)(24 g/ml起始浓度， 按2倍稀释成10个梯度)， 37， 5CO2培养箱培 养3天。 0065每个孔加入50 lLuminesent试剂(购自Promega,产品编号为： G7572)， 室温裂解10分钟。 在微孔板检测仪(购自Tecan,型号为： Infinite 200pro)读值。 0066 实验结果显示。

34、G3对NCL-H1975细胞的增殖抑制效果明显优于UC-961(图6)。 说明书 5/5 页 7 CN 110590951 A 7 序列表 安萌得医药科技 （上海） 有限公司 一种ROR1单克隆抗体、 制备方法及其应用 2019-09-27 18 SIPOSequenceListing 1.0 1 451 PRT Artificial Sequence 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Se。

35、r Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr。

36、 Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly His Ser Ser Gly Trp Tyr Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pr。

37、o Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Va。

38、l Glu Pro Lys Ser Cys 序列表 1/9 页 8 CN 110590951 A 8 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu A。

39、sp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 3。

40、35 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 3。

41、90 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 2 213 PRT Artificial Sequence 2 Ile Val Leu T。

42、hr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu 序列表 2/9 页 9 CN 110590951 A 9 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Lys Phe Ser Gly Ser 。

43、50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 11。

44、5 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Ty。

45、r Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 3 6 PRT Artificial Sequence 3 Gly Gly Ser Phe Ser Gly 1 5 4 7 PRT Artificial Sequence 4 Asn His Ser Gly Ser Thr Ser 1 5 序列表 3/9 页 10 CN 110590951 A 10 5 13 PRT Artificial Sequence 5 。

46、Gly His Ser Ser Gly Trp Tyr Arg Arg Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 6 11 PRT Artificial Sequence 6 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 7 7 PRT Artificial Sequence 7 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 8 9 PRT Artificial Sequence 8 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr 1 5 9 1359 DNA/RNA Artificial S。

47、equence 9 caggtgcagc tgcagcagtg gggcgccgga ctgctgaagc cttccgagac cctgtccctg 60 acctgtgccg tgtacggcgg ctccttcagc ggctattact ggtcctggat ccggcagcct 120 cctggcaagg gcctggagtg gatcggcgag atcaatcaca gcggctccac ctcctataac 180 cccagcctga agagccgggt gaccatcagc gtggatacca gcaagaatca gttcagcctg 240 aagctgagct 。

48、ccgtgaccgc cgctgacacc gccgtgtatt attgtgccag gggccacagc 300 agcggctggt atcggcggta cttcgatctg tggggcaggg gcaccctggt gaccgtgagc 360 序列表 4/9 页 11 CN 110590951 A 11 tccgcttcca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggctc cctcttccaa gagcaccagc 420 ggcggcaccg ctgctctggg atgtctggtg aaggactact tccctgagcc tgtgaccgtg 480 。

49、tcctggaatt ccggcgccct gacctccggc gtgcacacat tccctgctgt gctgcagtcc 540 tccggcctgt atagcctgtc ctccgtggtg acagtgccta gctccagcct gggcacccag 600 acctatatct gcaacgtgaa ccacaagcct agcaatacca aggtggacaa gaaggtggag 660 cctaagagct gcgacaagac ccacacctgt cctccatgtc ctgctccaga actgctcggc 720 ggaccttccg tgttcctgt。

50、t tcctccaaag cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc 780 cctgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccacgagg atcccgaagt gaagttcaat 840 tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagtac 900 aacagcacct acagagtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960 aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgc。