基因目标区域富集方法及试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910897689.5 (22)申请日 2019.09.20 (66)本国优先权数据 201910002408.5 2019.01.02 CN (71)申请人 上海臻迪基因科技有限公司 地址 201210 上海市浦东新区高科东路777 弄10号2613室 (72)发明人 郭志伟李英辉陈倩胡荣君 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) (54)发明名称 基因目标区域富集方法及试剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物技术领域， 特别是涉及一种 基因目标区域。

2、富集方法及试剂盒。 本发明提供一 种基因目标区域富集方法， 包括： (1)通过特异性 探针扩增包括目标区域的片段化DNA， 以提供捕 获延伸产物， 所述的特异性探针包括与所述片段 化DNA的目标区域互补的序列， 所述特异性探针 的3 末端核苷酸被修饰， 用于阻止所述特异性探 针的3 末端发生连接反应； (2)将步骤(1)所提供 的捕获延伸产物的3 末端连接接头DNA， 以提供 连接产物。 本发明所提供的富集方法操作简单、 结果可靠， 针对片段长度较短的DNA使用， 可以最 大程度的减少原始分子尤其是稀有分子的损失， 最高效地富集目标分子。 权利要求书2页 说明书29页 序列表5页 附图2页 C。

3、N 110699426 A 2020.01.17 CN 110699426 A 1.一种基因目标区域富集方法， 包括： (1)通过特异性探针扩增包括目标区域的片段化DNA， 以提供捕获延伸产物， 所述的特 异性探针包括与所述片段化DNA的目标区域互补的序列， 所述特异性探针的3 末端核苷酸 被修饰， 用于阻止所述特异性探针的3 末端发生连接反应； (2)将步骤(1)所提供的捕获延伸产物的3 端连接接头DNA， 以提供连接产物。 2.如权利要求1所述的基因目标区域富集方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中， 所述片段 化DNA包含双链DNA、 单链DNA和cDNA， 所述片段化DNA的长度为25。

4、200bp； 和/或， 所述步骤(1)的扩增体系中包括特异性探针、 DNA聚合酶和dNTP。 3.如权利要求2所述的基因目标区域富集方法， 其特征在于， 所述DNA聚合酶具有3 -5 外切酶活性； 和/或， 所述dNTP还偶联有标记分子， 所述标记分子优选为生物素。 4.如权利要求1所述的基因目标区域富集方法， 其特征在于， 所述步骤(1)的扩增体系 中还包括用于切除结合目标区域后所述特异性探针的3 末端修饰基团的活性物质， 所述活 性物质优选为核酸酶； 和/或， 所述特异性探针还包括能被测序系统识别的通用序列； 和/或， 所述特异性探针的3 末端核苷酸的3位羟基被取代； 和/或， 所述特异性。

5、探针的3 末端的取代基团选自氢原子、 C3Spacer基团、 C6Spacer基 团、 磷酸基团或氨基基团； 和/或， 所述特异性探针3 端尾部区域包含错配碱基。 5.如权利要求1所述的基因目标区域富集方法， 其特征在于， 所述步骤(2)的连接体系 中包括单链连接酶， 所述单链连接酶优选为T4RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶； 和/或， 所述接头DNA的5 末端核苷酸被修饰、 且在步骤(2)的反应温度下为单链结构， 优选的， 接头DNA的5 末端核苷酸被磷酸基团或腺苷基团取代； 和/或， 所述接头DNA为5 端区域具有黏性末端的部分双链结构； 和/或， 所述接头DNA包括能够被测序系统识别的。

6、通用序列、 样本标签序列、 分子标签序 列中的一种或多种的组合。 6.如权利要求1所述的基因目标区域富集方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中， 还包括纯 化捕获延伸产物， 捕获延伸产物的纯化方法优选选自磁珠纯化； 和/或， 所述步骤(2)中， 还包括纯化连接产物， 连接产物的纯化方法优选选自硅胶柱纯 化和/或加热处理。 7.如权利要求1所述的基因目标区域富集方法， 其特征在于， 还包括： (3)扩增步骤(2)所提供的连接产物， 优选的， 所述步骤(3)中， PCR扩增引物具有与所述 特异性探针的通用序列和/或所述接头DNA的通用序列相配合。 8.如权利要求7所述的基因目标区域富集方法， 其特。

7、征在于， 还包括： (4)对扩增后的连接产物进行测序， 以提供目标区域的测序结果。 9.如权利要求1所述的基因目标区域富集方法， 还包括： (5)用检测引物1、 检测引物2和探针3检测步骤(2)提供的连接产物， 其特征在于， 所述 检测引物1、 检测引物2和探针3中， 至少其一包含基因特异性序列； 优选的， 所述检测引物1包含基因特异性序列， 所述检测引物2和探针3包含通用序列； 权利要求书 1/2 页 2 CN 110699426 A 2 和/或， 所述检测引物2和/或探针3也包含基因特异性序列； 优选的， 所述探针3包含标记分子， 且所述探针3的序列与检测引物1或2不互补。 10.如权利要。

8、求1所述的基因目标区域富集方法， 其特征在于， 所述基因目标区域富集 方法用于基因检测。 11.一种用于富集片段化DNA目标区域的试剂盒， 包括适用于如权利要求19任一权利 要求所述的基因目标区域富集方法的特异性探针和接头DNA。 12.如权利要求11所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括以下的一种或多种： RNA连接酶， 偶联标记分子的dNTP， DNA聚合酶， 核酸酶； 和/或， 还包括正向引物和反向引物， 所述正向引物和反向引物具有与所述特异性探针 的通用序列和所述接头DNA的通用序列中至少部分互补的序列。 13.如权利要求12所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括检测引物1、 检测引物2和。

9、探针3， 三者中至少其一含有基因特异性序列。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110699426 A 3 基因目标区域富集方法及试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 特别是涉及一种基因目标区域富集方法及试剂盒。 背景技术 0002 基因测序技术自上世纪七十年代问世以来已经历了近半个世纪， 1985年PCR技术 的横空出世推动了整个分子生物学领域的发展。 下一代测序技术(NGS)具有准确、 灵敏、 通 量高的优点， 随着测序成本的不断降低， 其应用范围不断扩大， 但其应用也受到了需求多样 化且费时费力的文库构建这一步骤的制约。 在对临床样本比如血浆样本的建库过程中， DNA 的。

10、存在形式通常是短片段的， 受损的， 单链或部分双链的， 对于这些存在形式的尤其是片段 小于200bp的DNA来说， 现有的PCR技术并不能做到很好的捕获和富集。 0003 对于微小DNA片段的富集， 现有技术仍主要使用传统的PCR建库方法或先加接头连 接再扩增的方法比如杂交捕获法。 但对于前者来说， 由于需要双端引物， 极大限制了适合扩 增的片段的长度， 且存在扩增中的偏好性导致产物的高不均一性， 以及指数扩增累积的错 误导致后续测序结果不准确的问题； 而对于后者， 虽然对待富集片段长度的要求没有PCR 高， 但需要先进行连接反应， 而连接的效率通常只有2050， 导致捕获效率低下， 还存 在。

11、因连接困难容易丢失稀有分子的问题。 为了解决NGS的建库问题， 近期发展起来的技术还 包括诸如分子倒置探针、 多重PCR等。 分子倒置探针与杂交捕获技术相比， 特异性较好， 但其 口袋状探针设计复杂， 也不适用于微小DNA片段的富集。 多重PCR技术适合大规模样本， 应用 最为广泛， 但要么引物设计要求极高且扩增子均一性差， 要么扩增产物均一性较好但对起 始样本浓度要求很高， 同样不适用于起始浓度低的微小DNA片段的富集。 这些现有技术构建 文库时通常需要双端引物， 为了去除接头二聚体污染必然引入纯化步骤， 这导致小片段的 双链 DNA、 受损伤的双链DNA和单链DNA分子的信息丢失。 然而，。

12、 在一些转录活跃的基因组区 域恰恰是这些存在形式的DNA。 综上所述， 现有技术对片段化的， 尤其是200bp以下的微小 DNA进行富集的需求严重未能满足， 而找到高效富集片段化DNA目标区域的方法， 突破连接 效率对富集效果的瓶颈， 抑制非目的连接产物的产生， 最大程度的捕获稀有分子并保持产 物的均一性， 是本发明要解决的主要技术问题。 发明内容 0004 鉴于以上所述现有技术的缺点， 本发明的目的在于提供一种基因目标区域富集方 法， 用于解决现有技术中的问题。 0005 为实现上述目的及其他相关目的， 本发明提供一种基因目标区域富集方法， 包括： 0006 (1)通过特异性探针扩增包括目标。

13、区域的片段化DNA， 以提供捕获延伸产物， 所述 的特异性探针包括与所述片段化DNA的目标区域互补的序列， 所述特异性探针的3 末端核 苷酸被修饰， 用于阻止所述特异性探针的3 末端发生连接反应； 0007 (2)将步骤(1)所提供的捕获延伸产物的3 端连接接头DNA， 以提供连接产物。 0008 本发明另一方面提供一种用于富集片段化DNA目标区域的试剂盒， 包括适用于所 说明书 1/29 页 4 CN 110699426 A 4 述的基因目标区域富集方法的特异性探针和接头DNA。 附图说明 0009 图1是本发明实施例中对于目标区域富集过程的流程示意图。 0010 图2是本发明实施例所构建的。

14、文库分子示意图。 0011 图3是本发明实施例中校准品的构建示意图。 0012 图4是本发明实施例中单特异性检测体系的流程示意图。 具体实施方式 0013 本发明发明人经过大量探索性研究， 提供了一种基因目标区域富集方法， 所述基 因目标区域富集方法操作简单、 结果可靠， 尤其对于短片段核酸具有良好的富集效果， 在此 基础上完成了本发明。 0014 本发明第一方面提供一种基因目标区域富集方法， 包括： 0015 (1)通过特异性探针扩增包括目标区域的片段化DNA， 以提供捕获延伸产物， 所述 的特异性探针包括与所述片段化DNA的目标区域互补的序列， 所述特异性探针的3 末端核 苷酸被修饰， 用。

15、于阻止所述特异性探针的3 末端发生连接反应； 0016 (2)将步骤(1)所提供的捕获延伸产物的3 端连接接头DNA， 以提供连接产物。 0017 本发明所提供的基因目标区富集方法中， 可以包括： 通过特异性探针扩增包括目 标区域的片段化DNA， 以提供捕获延伸产物。 反应时， 所述特异性探针可以在捕获目标区域 互补序列的基础上延伸， 获得捕获延伸产物(Capture-Extension Product,CEP)。 0018 所述基因目标区域富集方法中， 通过特异性探针扩增包括目标区域的片段化DNA 的反应中， 包括目标区域的片段化DNA可以是一个， 也可以是多个。 通常来说， 特异性探针与 。

16、包括目标区域的片段化DNA是一一对应的， 即反应体系中特异性探针的数量可以是一种， 也 可以多种。 此步骤所述的延伸指的是对样本的整个预扩增步骤， 包括单轮或多轮变性、 退 火、 延伸步骤的循环。 优选的实施例中， 此步骤实施多轮循环， 比如2100、 210、 1020、 2030、 3040、 4060、 6080、 80100个循环， 有效地增加包含目标区域的分子数。 0019 所述基因目标区域富集方法中， 所述片段化DNA可以是双链DNA、 单链DNA和cDNA 等， 所述cDNA通常可以由RNA反转录获得。 对于双链DNA来说， 特异性探针可以包括与所述片 段化DNA其中一链的目标区。

17、域互补的序列。 所以本发明的富集方法也适用于片段化 RNA， 本 领域技术人员可以将RNA反转录成cDNA即可通过本发明所提供的富集方法进行后续操作。 所述片段化DNA的长度可以是25200bps、 2540bps、 4060bps、 6080bps、 80 100bps、 100120bps、 120140bps、 140160bps、 160180bps、 或180200bps。 0020 所述基因目标区域富集方法中， 所述步骤(1)的扩增体系中可以包括特异性探针、 DNA 聚合酶和dNTP。 通过特异性探针扩增包括目标区域的片段化DNA的反应通常可以在DNA 聚合酶存在的条件下进行， 3。

18、端封闭修饰的探针在高保真聚合酶的作用下结合模板后， 封 闭基团被切除， 探针被活化， 从而可以对目标序列进行有效延伸。 所述DNA聚合酶可以具有 3 - 5 外切酶活性， 从而可以切除结合模板后的探针3 端的取代基团， 使探针能够延模板 延伸， 优选可以为高保真DNA聚合酶， 用于进一步提高产物的扩增效率和纯度。 所述DNA聚合 酶也可以是普通的DNA聚合酶(即对应不具有3 -5 外切酶活性)。 所述步骤(1)的扩增体系 说明书 2/29 页 5 CN 110699426 A 5 中还包括活性物质， 所述活性物质可以用于切除结合目标区域后所述特异性探针的3 末端 修饰基团， 还可以在捕获延伸体。

19、系中与DNA聚合酶(例如， 普通的DNA聚合酶)组合， 以提升扩 增体系的效率， 所述活性物质优选为核酸酶。 通过特异性探针扩增包括目标区域的片段化 DNA的反应通常可以在dNTP存在的条件下进行， 所述dNTP通常可以是偶联标记分子的 dNTP， 所述偶联标记分子可以是包括但不限于生物素等， 所述dTNP可以是包括但不限于 dCTP、 dATP等。 所述dNTP还可以偶联有标记分子， 所述标记分子可以是生物素等， 所述标记 分子通常可以用于捕获延伸产物的纯化。 0021 所述基因目标区域富集方法中， 所述的特异性探针包括与所述片段化DNA的目标 区域互补的序列， 从而可以实现对片段化DNA的。

20、目标区域的特异性扩增， 本领域技术人员可 选择合适的片段化DNA的目标区域， 并根据片段化DNA的目标区域， 设计合适的互补的序列。 所述特异性探针可以是3 末端核苷酸被修饰的特异性探针， 用于阻止所述特异性探针的3 末端与其他基团发生连接反应， 从而可以避免游离探针的自连或连接其它非目的分子， 例 如， 非目的分子可以是接头DNA等。 本领域技术人员可选择合适的修饰基团以实现特异性探 针 3 末端的修饰， 例如， 所修饰的基团可以取代特异性探针3 末端核苷酸上的天然基团 (例如， 羟基等)， 以阻止所述特异性探针3 端发生连接反应， 所使用的修饰基团通常可以是 封闭基团。 探针通过互补序列与。

21、模板上的目标区域结合后， 3 端的修饰基团可以被酶切除， 使得探针被活化， 从而可以对目标序列进行有效延伸。 特异性探针的3 末端修饰基团可以 是包括但不限于氢原子、 C3 Spacer基团、 C6 Spacer基团、 磷酸基团(PO4)、 氨基(NH2)等。 不 同取代基团的选择对于探针的捕获效果有明显差异， 在本发明一优选实施例中， 将探针3 端羟基取代为C3 Spacer得到的效果最佳， 与其它取代基团相比具有明显优势。 所述特异性 探针还包括通用序列， 所述通用序列通常能被测序系统识别， 从而可以将后续提供的连接 产物通过测序系统进行测序， 例如， 对于Ion Torrent测序系统，。

22、 所述通用序列可以是对应 的P1序列。 在本发明一优选实施方式中， 所述特异性探针3 端尾部区域的碱基可以包含错 配， 错配的可以是探针3 端最后一个碱基， 也可以是接近3 端的碱基； 错配的可以是一个碱 基， 也可以是复数个。 该错配不仅不影响探针的特异性和结合效率， 还更有利于提高高保真 DNA聚合酶的切割效率和保真度。 0022 所述基因目标区域富集方法中， 所述步骤(1)中， 还可以包括纯化捕获延伸产物。 本领域技术人员可选择合适的方法对捕获延伸产物进行纯化， 例如， 捕获延伸产物的纯化 方法可以是包括磁珠纯化等。 在本发明一具体实施例中， 可以通过标记分子对捕获延伸产 物进行纯化， 。

23、纯化过程可以使用亲和素或者链霉亲和素包被的磁珠的固相纯化方法等。 0023 本发明所提供的基因目标区富集方法中， 还可以包括： 将步骤(1)所提供的捕获延 伸产物的3 端连接接头DNA， 以提供连接产物。 0024 所述基因目标区域富集方法中， 将捕获延伸产物的3 端连接接头DNA的连接体系 中可以包括单链连接酶， 所述单链连接酶使接头DNA的5 端连接到所述捕获延伸产物的3 端， 所述单链连接酶优选为T4 RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶等。 0025 所述基因目标区域富集方法中， 所述接头DNA可以是5 末端核苷酸被修饰的、 且在 步骤(2)的反应温度下为单链结构， 从而可以在单链连接酶。

24、的催化下， 通过捕获延伸产物的 3 端羟基与接头DNA5 末端的修饰基团生成共价键， 得到连接产物。 在本发明一具体实施方 式中， 接头DNA的5 末端核苷酸(例如， 具体可以为的5 末端核苷酸的5位羟基)被磷酸基团 说明书 3/29 页 6 CN 110699426 A 6 取代， 从而形成磷酸化修饰， 在单链连接酶的催化下， 捕获延伸产物的3 端羟基与接头DNA 磷酸化的5 末端生成共价键， 得到连接产物。 在本发明另一具体实施方式中， 接头DNA的5 末端核苷酸(例如， 具体可以为的5 末端核苷酸的5位羟基)被腺苷基团取代， 从而形成腺苷 酸化修饰， 在5 App DNA/RNA热稳定连。

25、接酶的催化下， 接头DNA的5 末端可以与捕获延伸产 物的3 端发生连接反应。 在本发明另一具体实施方式中， 接头DNA的5 末端核苷酸(例如， 具 体可以为的5 末端核苷酸的5位羟基)被磷酸基团取代， 从而形成磷酸化修饰， 在热稳定RNA 连接酶的催化下， 接头DNA的5 末端可以与捕获延伸产物的3 端发生连接反应。 所述接头 DNA也可以是5 端区域具有黏性末端的部分双链结构， 其5 端区域的黏性末端具有单链性 质， 从而可以通过如上所述的方法对5 端进行修饰， 在合适的单链连接酶催化下， 可以与捕 获延伸产物连接。 所述接头DNA还可以包括通用序列、 样本标签序列、 分子标签序列等中的 。

26、一种或多种的组合， 这些序列通常可以被测序系统识别的， 从而可以对制备获得的连接产 物进行测序。 例如， 对于Ion Torrent测序系统， 所述通用序列可以为A序列， 所述样本标签 序列可以是barcode， 与其对应的分子标签序列等。 引入barcode有利于后续的生信分析中 对不同来源的样本进行区别， 从而实现在单次反应中同时进行多个样本的测序以提高通 量。 引入分子标签有利于后续的生信分析中识别不同分子， 以便进一步对后续扩增中产生 的变异进行识别。 这些能被测序系统识别的序列的应用， 使本发明完成建库后的文库能够 通过高通量测序平台进行测序， 以提供各种后续研究和临床应用所需要的信。

27、息。 0026 在本发明一优选实施例中， 所述接头DNA的3 端羟基也被其他基团取代， 以阻止所 述接头DNA 3 端的连接反应， 避免其自连或连接其它非目的分子， 比如来自步骤(1)的游离 探针。 0027 所述基因目标区域富集方法中， 所述步骤(2)中， 还可以包括纯化连接产物。 本领 域技术人员可选择合适的方法对连接产物进行纯化， 例如， 连接产物的纯化方法可以是包 括但不限于硅胶柱纯化、 加热处理等。 0028 本发明所提供的基因目标区域富集方法， 可以用于基因检测。 通过扩增后的连接 产物进一步进行基因检测的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。 在本发明一具体 实施例中， 所述目。

28、标区域富集的方法可以应用于高通量测序中。 在本发明另一具体实施例 中， 本发明目标区域富集的方法可以应用于基因序列检测中， 例如， 所述的目标区域包括： 序列发生变异的位点， 更具体可以是单碱基突变位点区域， 碱基缺失位点区域， 碱基插入位 点区域和融合突变位点区域等。 在本发明另一具体实施例中， 本发明目标区域富集的方法 可以应用于基因修饰状态的检测中， 例如， 所述的目标区域包括可能存在甲基化位点的区 域， 再例如， 所述的DNA片段经过了重亚硫酸盐的处理。 0029 本发明所提供的基因目标区域富集方法， 还可以包括： (3)扩增步骤(2)所提供的 连接产物。 通常可以通过DNA聚合酶和P。

29、CR扩增引物对连接产物进行PCR扩增， 通过扩增连接 产物， 可以进一步富集含有目标区域的DNA的产物。 本领域技术人员可选择合适的方法和体 系对步骤(2)所提供的连接产物进行扩增， 例如， PCR扩增引物具有与所述特异性探针的通 用序列和/或所述接头DNA的通用序列相配合， 具体的， 所述的PCR扩增引物具有与所述特异 性探针的通用序列和所述接头DNA的通用序列至少部分互补的序列。 0030 本发明所提供的基因目标区域富集方法， 还可以包括： (4)对扩增后的连接产物进 行测序， 以提供目标区域的测序结果。 在对连接产物进行PCR扩增之后， 可以通过识别扩增 说明书 4/29 页 7 CN 。

30、110699426 A 7 产物中的通用序列对扩增产物进行测序， 获得目标区域的测序结果。 本领域技术人员可选 择合适的方法和体系对扩增后的连接产物进行测序， 例如， 基于Ion Torrent平台的P1序列 和A序列进行测序， 获得目标区域的测序结果。 需要说明的是， 本发明的富集方法可使步骤 (2)得到的连接产物包含任意测序通用序列， 比如可以是Ion Torrent测序平台， 也可以是 Illumina 测序平台， 当然也可以是其它测序平台的通用序列。 0031 本发明所提供的基因目标区域富集方法， 还可以包括： (5)用检测引物1、 检测引物 2 和探针3检测步骤(2)提供的连接产物，。

31、 以非二代测序而是PCR检测的手段快速提供目标 区域的检测结果。 所述的检测引物1、 检测引物2和探针3中， 至少其一包含基因特异性序列， 也即是说， 对于不同的基因目标区域， 三种引物/探针有关特异性序列的组合可以是单特异 性、 双特异性或三特异性。 在本发明一个实施例中， 所述检测引物1包含基因特异性序列， 检 测引物2和探针3包含通用序列， 或检测引物1和检测引物2包含基因特异性序列； 或检测引 物1和探针3包含基因特异性序列， 或检测引物1、 检测引物2和探针3均包含基因特异性序 列。 在一些实施例中， 探针3还可以包含标记分子， 比如可以是荧光分子， 且探针3 的序列与 检测引物1或。

32、2不互补。 0032 本发明第二方面提供一种用于富集片段化DNA目标区域的试剂盒， 包括适用于本 发明第一方面所提供的基因目标区域富集方法的特异性探针和接头DNA。 所述特异性探针 和接头 DNA的结构在本发明第一方面已经详细描述， 在此不作赘述。 0033 本发明所提供的试剂盒中， 还可以包括以下组分的一种或多种： RNA连接酶、 偶联 标记分子的dNTP、 DNA聚合酶、 核酸酶等。 其中， RNA连接酶可以是热稳定性RNA连接酶、 T4 RNA连接酶、 或5 App DNA/RNA热稳定连接酶等； dTNP可以是dCTP， 也可以是dATP。 所述DNA聚 合酶可以是具有3 -5 外切酶。

33、活性的DNA聚合酶， 优选的， 所述DNA聚合酶选用高保真聚合 酶。 0034 本发明所提供的试剂盒中， 还可以包括用于PCR扩增的正向引物和反向引物， 它们 通常与特异性探针的通用序列和所述接头DNA的通用序列相配合， 具体可以具有与所述特 异性探针的通用序列和所述接头DNA的通用序列至少部分互补的序列。 0035 本发明所提供的试剂盒中， 还可以包括用于PCR检测的检测引物1、 检测引物2和探 针 3， 三者中至少其一含有基因特异性序列， 具体的可以是单特异性、 双特异性或三特异性 的引物/探针组合。 优选的情况下， 仅检测引物1包含基因特异性序列， 检测流程请参考图4。 0036 在本发。

34、明一优选实施例中， 通过本发明的方法或试剂盒进行文库构建后， 文库分 子(例如， 步骤(2)所提供的连接产物， 结构可以如图2所示)在结构上依次包含以下序列： 5 端测序通用序列、 基因特异性探针序列、 富集到的目标区域序列、 接头序列、 barcode、 分子 标签序列、 3 端测序通用序列， 如图2所示。 其中富集到的目标区域包含富集前样本DNA的序 列信息， 该部分序列的特点是： 5 端在基因组上的位置是固定的， 由特异性探针决定； 而3 端位置不固定， 由建库初始的DNA片段化状态决定。 因此， 在富集后的数据分析中， 该序列的 3 端在基因组上的位置也可以起到分子标签的作用。 分子标。

35、签可用于区分不同分子， 提高 检测的灵敏度与准确性。 0037 本发明的有益效果在于， 首先， 在连接前先对所有片段化DNA样本的目标区域通过 捕获延伸的手段进行预扩增， 避免在连接阶段因连接酶连接效率不足所致的原始目标分子 的损失或漏检， 特别是小片段和稀有分子； 预扩增阶段的延伸反应属于线性扩增， 没有PCR 说明书 5/29 页 8 CN 110699426 A 8 扩增的偏好性， 也不会累积PCR扩增所引入的错误， 与常规PCR建库技术相比， 产物均一性好 且后续的测序结果更准确； 其次， 预扩增阶段， 只需为每个目标基因设计一条长约30bp的单 链探针， 避开了为短片段如cfDNA和。

36、更短片段如ctDNA设计双端引物的困难， 既提高了建库 成功率还提升了建库便利性； 而封闭探针3 端， 可以阻断探针与模板之外的非目的连接， 有 效降低游离探针引起的背景噪声， 辅以偶联标记分子的dNTP及其纯化系统， 进一步提高目 的产物纯度， 使样本DNA分子达到理论最高转化率； 再次， 将接头DNA的5 端修饰后， 在单链 连接酶催化下能很好地连接到延伸产物的3 端但不会连接到封闭修饰的特异性探针 3 端， 同时封闭接头3 端避免接头的自连和错连， 提高目的连接产物在终产物中的比例。 最 后， 富集目标区域的过程中， 或在探针和接头上设置好测序通用序列、 样本标签序列和分子 标签序列， 。

37、达到建库完成后直接测序和数据分析的目的； 或用本发明独创的单、 双或三特异 性引物/探针体系对目标区域进行快速检测。 综上所述， 本发明的富集方法及试剂盒， 操作 简单， 结果可靠， 针对片段长度小于200bp的DNA使用， 可以最大程度的减少原始分子尤其是 稀有分子的损失， 最高效地富集目标分子； 且该富集方法及试剂盒保真性极高， 通过后续生 信手段可使在测序过程中产生的碱基错误得到有效纠正， 得到理论上可达到的最高测序准 确率。 0038 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式， 本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。 本发明还可以通过另外不同的具体。

38、实 施方式加以实施或应用， 本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用， 在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。 0039 在进一步描述本发明具体实施方式之前， 应理解， 本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案； 还应当理解， 本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围； 在本发明说明书和权利要求书中， 除非文中 另外明确指出， 单数形式 “一个” 、“一” 和 “这个” 包括复数形式。 0040 当实施例给出数值范围时， 应理解， 除非本发明另有说明， 每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。 除非另外定。

39、义， 本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。 除实施例中使用的具体方法、 设备、 材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载， 还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、 设备、 材料相似或等同的现有技术的任何方法、 设备和材料来实 现本发明。 0041 除非另外说明， 本发明中所公开的实验方法、 检测方法、 制备方法均采用本技术领 域常规的分子生物学、 生物化学、 染色质结构和分析、 分析化学、 细胞培养、 重组DNA技术及 相关领域的常规技术。 这些技术在现有文献中已有完善说明， 具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CL。

40、ONING： A LABORATORY MANUAL， Second edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989and Third edition， 2001； Ausubel等， CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY， John Wiley&Sons， New York， 1987and periodic updates； the series METHODS IN ENZYMOLOGY， Academic Press， San Diego； Wolffe， CHROMATIN STRUCTUR。

41、E AND FUNCTION， Third edition， Academic Press， San Diego， 1998； METHODS IN ENZYMOLOGY， Vol.304， Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe， eds.)， Academic Press， San Diego， 1999； 和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY， Vol.119， Chromatin 说明书 6/29 页 9 CN 110699426 A 9 Protocols(P.B.Becker， ed.)Humana Press， Toto。

42、wa， 1999等。 0042 实施例1 0043 实施例1中所用寡核苷酸序列如表1所示： 0044 表1 0045 0046 说明书 7/29 页 10 CN 110699426 A 10 0047 此实施例中的探针包含测序通用序列， 即斜体标示的碱基， 此处包含有Ion Torrent测序系统中的P1序列。 表中所有探针的特异性序列都针对EGFR基因21外显子的 L858R突变。 其中， 探针1(SEQ ID NO.1)3 端无修饰， 探针2、 3和4(SEQ ID NO.2， SEQ ID NO.7， SEQ ID NO.8)3 端羟基被替换为C3 Spacer， 探针2p(SEQ ID。

43、 NO.3)3 端羟基被替换 为磷酸基， 探针2c(SEQ ID NO.4)3 端羟基被替换为C6 Spacer， 探针2n(SEQ ID NO.5)3 端 羟基被替换为磷酸基， 探针2d(SEQ ID NO.6)3 端羟基被替换为双脱氧胞嘧啶(DDC)； 其中， 探针3(SEQ ID NO.7)的最后一个碱基为错配碱基， 探针4(SEQ ID NO.8)中靠近3 端的G被 替换为RNA碱基rG。 0048 接头ABar-X1/2/3(SEQ ID NO.9， SEQ ID NO.10， SEQ ID NO.11)中包含测序通用 序列, 即斜体标示的碱基， 此处为Ion Torrent测序系统。

44、中的A序列； 下划线部分序列为 barcode， 在本发明不同的样本中可以被替换成不同的barcodes， 此部分的变化在本发明中 不再累述。“N” 部分为分子标签序列， 其中NNNNNN为随机序列， 用以标记同一样本中不同的 延伸产物分子。 接头ABar-X1和ABar-X2(SEQ ID NO.9， SEQ ID NO.10)的5 端为磷酸化修 饰， 接头 ABar-X3(SEQ ID NO.11)的5 端为腺苷酸化修饰； ABar-X2和ABar-X3(SEQ ID NO10， SEQ ID NO.11)的3 端的羟基被替换为C3 Spacer。 0049 EF-1和ER-1(SEQ I。

45、D NO.12， SEQ ID NO.13)是用于PCR检测EGFR目的序列的前后 引物， EM-1(SEQ ID NO.14)为MGB探针。 AF和AR(SEQ ID NO.15， SEQ ID NO.16)分别是用来 扩增文库的前后引物， 与文库中的通用序列， 即上述探针中的P1序列和接头中的A 序列匹 配。 0050 主要试剂与材料 0051 血浆游离DNA提取试剂盒购自Qiagen； 细胞DNA提取试剂盒与纯化单链DNA的试剂 盒为RNA Clean Kit购自Tiangen Biotech； 热稳定RNA连接酶购自美国Epicentre公司， 高 保真DNA聚合酶反应体系、 Biot。

46、in-dCTP及用于纯化的MyOne Strptavidin C1试剂购自 Invitrogen， DNA聚合酶、 高保真DNA聚合酶和PCR反应试剂盒购自TOYOBO； RNAse H2热稳定 性核酸酶购自IDT。 Q5高保真DNA聚合酶、 T4 RNA连接酶与5 App DNA/RNA热稳定连接酶购自 NEB； Agencourt AMPure磁珠购自Beckman； 相关过程中定量检测的校准品按照分子克隆常 规方法构建， 具体构建组成见图3所示。 0052 步骤1、 样本准备 0053 用抽提试剂盒提取健康人血浆样本中的cfDNA与NCI-H1975细胞株(该细胞株为 EGFR 基因21。

47、外显子L858R突变)中的DNA， 通过Qubit荧光定量仪对DNA样本定量， 将NCI- H1975细胞株的DNA打断成160bp左右的片段， 按照10， 1， 0.1， 0.01的比例掺入到健 康人的cfDNA样本中， 同时以健康人cfDNA作为空白对照(QC)。 0054 步骤2、 捕获延伸 0055 按表2、 表3、 表4分别配制捕获延伸反应体系。 0056 表2 0057 说明书 8/29 页 11 CN 110699426 A 11 0058 0059 表3 0060 0061 表4 0062 0063 捕获延伸的PCR程序如表5所示： 0064 表5 0065 0066 0067。

48、 捕获延伸程序完成后用RNA Clean Kit试剂盒对延伸产物进行硅胶柱纯化， 用 60ul洗脱缓冲液洗脱。 (本发明中后续所指硅胶柱纯化， 都与此步骤相同。 )对于表4的延伸 说明书 9/29 页 12 CN 110699426 A 12 产物， 在经过硅胶柱纯化后用链霉亲和素包被的磁珠再次纯化， 并最终溶解于60ul洗脱缓 冲液中。 0068 步骤3、 延伸效率检测 0069 按照表6配制延伸产物的PCR检测体系。 0070 表6 0071 组分 用量( L) 终浓度 2Taqman Mix 25 1 ER-1(10uM) 1.5 300nM AF(10uM) 1.5 300nM EM-。

49、1(10uM) 0.5 100nM H2O 17.5 / 延伸产物/校准品 4 / 总体积 50 / 0072 检测延伸效率的PCR程序如表7。 0073 表7 0074 0075 步骤4、 单链连接 0076 根据步骤3的结果， 选择步骤2得到的部分延伸产物分别按表8、 表9、 表10配制连接 反应体系。 0077 表8 0078 0079 0080 表9 说明书 10/29 页 13 CN 110699426 A 13 0081 0082 表10 0083 0084 得到连接产物后的处理如表11所示。 0085 表11 0086 0087 步骤5、 连接效率检测 0088 按照表12配制P。

50、CR检测体系对步骤4的连接效率进行检测。 0089 表12 0090 0091 0092 检测连接效率的PCR程序如表13所示。 说明书 11/29 页 14 CN 110699426 A 14 0093 表13. 0094 0095 步骤6、 文库扩增 0096 按表14记载的反应体系和程序对步骤4得到的连接产物进行PCR扩增。 0097 表14 0098 0099 反应结束后， 取80 L Agencourt AMPure磁珠对扩增后的文库进行纯化， 将纯化产 物溶于 30ul洗脱缓冲液中洗脱， 至此， 待上机测序的文库构建完成。 0100 步骤7、 测序与数据分析 0101 将制备好的文。