尿石素制剂及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911016511.1 (22)申请日 2019.10.24 (71)申请人 广州中医药大学第一附属医院 地址 510405 广东省广州市白云区机场路 12号 (72)发明人 张锦芳 (74)专利代理机构 广州三环专利商标代理有限 公司 44202 代理人 颜希文 (51)Int.Cl. A61K 31/37(2006.01) A61P 3/04(2006.01) (54)发明名称 一种尿石素制剂及其应用 (57)摘要 本发明涉及尿石素制剂及其应用， 属于生物 医药领域。 。

2、本发明提供的尿石素制剂， 其有效成 分包括尿石素A， 所述尿石素A占尿石素制剂的质 量百分含量为0.199。 本发明提供的尿石 素A能抑制骨髓间充质干细胞的成脂肪分化， 且 能抑制成脂肪分化的标志基因PPARr和C/EBP的 表达， 使用含尿石素A的尿石素制剂将达到为肥 胖患者去脂减肥的效果。 本发明提供的尿石素制 剂应用于制备减肥药品中， 为尿石素制剂开发了 新的用途， 同时也为需要去脂减肥的肥胖患者提 供了新的治疗药物。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 110693880 A 2020.01.17 CN 110693880 A 1.一种尿石素制剂， 其特征在于， 所述尿石素制剂。

3、的有效成分包括尿石素A。 2.如权利要求1所述的尿石素制剂， 其特征在于， 所述尿石素A占尿石素制剂的质量百 分含量为0.199。 3.如权利要求2所述的尿石素制剂， 其特征在于， 所述尿石素A占尿石素制剂的质量百 分含量为1050。 4.如权利要求13任一项所述的尿石素制剂， 其特征在于， 所述尿石素制剂的剂型为 搽剂、 霜剂、 软膏剂、 硬膏剂、 糊剂、 贴膏、 贴片、 涂膜剂、 膜剂、 凝胶剂、 乳剂中的至少一种。 5.如权利要求1所述的尿石素制剂， 其特征在于， 所述尿石素制剂还包括药学上可接受 的载体。 6.如权利要求5所述的尿石素制剂， 其特征在于， 所述药学上可接受的载体选自表面。

4、活 性剂、 油脂性基质、 水溶性基质、 透皮吸收促进剂、 防腐剂、 抗氧剂、 保湿剂、 香精、 香料中的 至少一种。 7.如权利要求6所述的尿石素制剂， 其特征在于， 所述油脂性基质选自单硬脂酸甘油 酯、 凡士林、 氢化植物油、 液体石蜡、 甘油、 吐温80、 Span-80、 甘油三酸酯、 硬脂酸、 尼泊金乙 酯、 油酸乙酯中的至少一种； 所述水溶性基质选自蒸馏水、 生理盐水、 甘油、 十二烷基硫酸 钠、 三乙醇胺、 甲基纤维素、 月桂氮卓酮、 聚乙二醇中的至少一种。 8.如权利要求17任一项所述的尿石素制剂在制备减肥药品中的应用。 9.如权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述的尿石素制。

5、剂用于抑制间充质干细胞成 脂肪细胞分化。 10.如权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述的尿石素制剂用于抑制成脂肪分化的 标志基因PPARr和C/EBP的表达。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110693880 A 2 一种尿石素制剂及其应用 技术领域 0001 本发明涉及尿石素制剂及其应用， 属于生物医药领域。 背景技术 0002 随着近年来生活水平的提高以及生活方式和饮食结构的改变， 肥胖患病率呈快速 上升趋势， 目前肥胖已成为我国面临的严重社会问题。 根据国家统计局和国家卫计委的数 据显示， 中国人的超重率和肥胖率均不断上升。 从1992年到2015年， 超重率从13上升到 30。

6、， 肥胖率从3上升到12。 依此测算， 当前中国超重肥胖总人数超过5.7亿人， 中国肥 胖人口超过1.6亿人。 0003 肥胖已成为世界范围内导致人类死亡的第五大因素， 至少280万的成年人由于肥 胖相关疾病死亡。 肥胖、 糖尿病、 高血压和心血管疾病已经成为威胁国人健康的最大危险因 素。 其中， 肥胖又是糖尿病、 高血压、 心血管疾病等慢性病的主要诱因之一。 据统计， 44的 糖尿病， 23的缺血性心脏病， 以及741的特定癌症都是由肥胖引起的。 因此， 肥胖已 日益成为影响人类健康的一种全球性疾病。 当前， 国内减肥产品五花八门， 药物、 手术、 节食 等方式方法大行其道， 但是对于肥胖患。

7、者在减重过程中药物减肥的副作用大， 节食减肥容 易失败， 手术减肥有医疗风险， 而且三者都容易反弹， 无法从根源上帮助患者摆脱肥胖的困 扰。 0004 尿石素(Urolithin)是富含鞣花单宁的食物(石榴、 草莓、 核桃、 花生等)经肠道微 生物代谢生成的一类具有不同酚羟基的二苯并喃-6-酮衍生物。 其中， 尿石素A(UA)率先从 喂食鞣花酸的小鼠粪便和尿液中被分离鉴定出来。 许多日常食用的水果包括石榴、 草莓、 覆 盆子、 黑莓、 核桃、 麝香葡萄等均富含鞣花单宁， 但鞣花单宁的吸收非常低。 相反的， 在血液 和尿液中能检测到大量的尿石素的存在， 这提示我们尿石素可能是在生物体内发挥作用的。

8、 有效活性形式。 研究表明， 尿石素A具有调控雌激素分泌、 抗氧化、 抗炎以及抗癌等生物活 性， 但是对于尿石素去脂减肥的研究却鲜有报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种具有抑制脂肪分化作用的尿石 素制剂。 0006 本发明的另一目的是提供所述尿石素制剂在制备减肥药品中的应用。 0007 本发明利用骨髓间充质干细胞的成脂肪分化平台， 主要探讨研究了尿石素A对脂 肪分化的作用， 其结果显示尿石素A具有抑制脂肪分化的作用。 0008 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案为： 一种尿石素制剂， 所述尿石素制剂的 有效成分包括尿石素A。 所述尿石素A的化学式为C1。

9、3H8O4， 分子量为228.2。 所述尿石素A可通 过化学方法合成也可通过市场上购买获得。 0009 优选地， 所述尿石素A占尿石素制剂的质量百分含量为0.199。 0010 优选地， 所述尿石素A占尿石素制剂的质量百分含量为1050。 说明书 1/6 页 3 CN 110693880 A 3 0011 优选地， 所述尿石素制剂的剂型为洗剂、 浴剂、 搽剂、 酊剂、 油剂、 霜剂、 软膏剂、 硬 膏剂、 糊剂、 贴膏、 贴片、 涂膜剂、 膜剂、 凝胶剂、 巴布剂、 敷剂、 喷雾剂、 气雾剂、 植入剂、 乳剂、 栓剂、 片剂、 胶囊、 丸剂、 注射剂、 粉剂中的至少一种。 更优选地， 所述尿石。

10、素制剂的剂型为成 霜剂、 软膏剂、 乳剂中的至少一种。 0012 剂型为霜剂、 软膏剂、 乳剂的尿石素制剂适用于患者局部涂抹和经皮给药。 0013 优选地， 所述尿石素制剂还包括药学上可接受的载体。 0014 优选地， 所述药学上可接受的载体选自表面活性剂、 油脂性基质、 水溶性基质、 透 皮吸收促进剂、 防腐剂、 抗氧剂、 保湿剂、 香精、 香料中的至少一种。 0015 优选地， 所述油脂性基质选自单硬脂酸甘油酯、 凡士林、 氢化植物油、 液体石蜡、 甘 油、 吐温80、 Span-80、 甘油三酸酯、 硬脂酸、 尼泊金乙酯、 油酸乙酯中的至少一种； 所述水溶 性基质选自蒸馏水、 生理盐水、。

11、 甘油、 十二烷基硫酸钠、 三乙醇胺、 甲基纤维素、 月桂氮卓酮、 聚乙二醇中的至少一种。 0016 本发明所述的尿石素制剂在制备减肥药品中的应用。 0017 作为所述尿石素制剂在制备减肥药品中的应用技术方案的改进， 所述的尿石素制 剂用于促进间充质干细胞成骨细胞分化。 0018 作为所述尿石素制剂在制备减肥药品中的应用技术方案的改进， 所述的尿石素制 剂用于抑制成脂肪分化的标志基因PPARr和C/EBP的表达。 0019 与现有技术相比， 本发明的有益效果为： 本发明提供一种具有抑制脂肪分化作用， 且有效成分为尿石素A的尿石素制剂， 将本发明所述的尿石素制剂应用于制备减肥药品中， 其能促进间。

12、充质干细胞成骨细胞分化， 以及抑制成脂肪分化的标志基因PPARr和C/EBP的表 达， 因此， 使用含尿石素A的尿石素制剂为肥胖患者提供去脂减肥的效果。 本发明提供的尿 石素制剂应用于制备减肥药品中， 为尿石素制剂开发了新的用途， 同时也为需要去脂减肥 的肥胖患者提供了新的治疗药物。 附图说明 0020 附图1为尿石素A(UA)对间充质干细胞的毒性研究结果图； 0021 附图2为尿石素A(UA)抑制间充质干细胞的成脂肪分化的油红O染色图， 其中图2A： 显微镜下观察骨髓细胞内脂肪滴形成的油红O染色结果图； 图2B： 质量百分含量为10、 30、 50的UA对骨髓间充质干细胞成脂肪分化的抑制结果。

13、图； 0022 附图3为尿石素A(UA)抑制间充质干细胞的成脂肪分化的标志基因的检测结果图； 0023 附图4为尿石素A(UA)抑制小鼠体内脂肪形成的检测结果图。 具体实施方式 0024 为更好地说明本发明的目的、 技术方案和优点， 下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。 0025 实施例1 0026 本实施例为本发明的一种尿石素霜剂， 所述尿石素霜剂包括如下质量百分含量的 组分： 尿石素A 30、 单硬脂酸甘油酯7、 硬脂酸13、 液体石蜡10、 尼泊金乙酯0.14、 纯净水29、 十二烷基硫酸钠0.29、 甘油6、 三乙醇胺0.41、 月桂氮卓酮0.19、 生理 说明书 2/6 页 。

14、4 CN 110693880 A 4 盐水3.97。 0027 上述尿石素霜剂的制备方法： 将上述单硬脂酸甘油酯、 硬脂酸、 液体石蜡和尼泊金 乙酯混合均匀制备成油相， 加热溶解， 搅匀， 保持在70； 将纯净水、 十二烷基硫酸钠、 甘油 混合均匀制备成水相， 保温在70； 将油相慢慢加入到水相中， 边加边搅拌， 加入三乙醇胺、 月桂氮卓酮， 置均质器上搅拌10min后， 用普通搅拌器继续搅拌直至冷却， 获得乳白色霜状 的混合物。 将尿石素A溶解在4ml生理盐水中， 然后缓慢添加上述已成型的乳白色霜状混合 物， 边加边缓慢搅拌， 直至均匀， 即可制备成所述尿石素霜剂。 0028 实施例2 00。

15、29 本实施例为本发明的一种尿石素软膏剂， 所述尿石素膏剂包括如下质量百分含量 的组分： 尿石素A 1、 硬脂酸14、 凡士林7、 单硬脂酸甘油酯7、 液体石蜡21、 三乙醇 胺0.35、 纯净水39、 十二烷基硫酸钠0.18、 甘油7、 月桂氮卓酮0.07、 生理盐水 3.40。 0030 上述尿石素膏剂的制备方法： 油相的制备： 将上述硬脂酸、 凡士林、 单硬脂酸甘油 酯、 液体石蜡和三乙醇胺混合均匀制备成油相； 水相的制备： 将纯净水、 十二烷基硫酸钠、 甘 油和月桂氮卓酮混合均匀制备成水相； 将油相慢慢加入到水相中， 边加边搅拌， 85进行乳 化， 等温度降至40度左右， 即呈乳白色膏。

16、状。 将尿石素A溶解在3ml生理盐水中， 然后缓慢添 加上述已成型的乳白色膏状， 边加边缓慢搅拌， 直至均匀， 即可制备成所述尿石素软膏剂。 0031 实施例3 0032 本实施例为本发明的一种尿石素乳剂， 所述尿石素乳剂包括如下质量百分含量的 组分： 尿石素A 40、 Span-80 4.5、 甘油三酸酯9.5、 氢化植物油7.3、 吐温80 3、 纯 净水21、 甘油9.5、 生理盐水5.2。 0033 上述尿石素乳剂的制备方法： 油相的制备： 将上述Span-80、 甘油三酸酯、 和氢化植 物油均匀混合， 并经37水浴充分摇匀； 水相的制备： 将上述吐温80、 纯净水和甘油混合均 匀制备。

17、成水相； 按油相 水相1.5-2 1的体积比乳化， 先将油相放于胶体磨内， 慢速转动搅 拌， 同时缓慢加入水相， 加完后再以8000r/min搅拌15min； 在终止搅拌前， 将尿石素A溶解在 5ml生理盐水中， 然后缓慢添加至上述已成型的乳液中， 边加边缓慢搅拌， 直至均匀， 即可制 备成所述尿石素乳剂。 0034 实施例4 0035 本实施例为本发明的一种尿石素霜剂， 所述尿石素霜剂包括如下质量百分含量的 组分： 尿石素A10、 单硬脂酸甘油酯17、 硬脂酸23、 液体石蜡10、 尼泊金乙酯0.14、 纯净水29、 十二烷基硫酸钠0.29、 甘油6、 三乙醇胺0.41、 月桂氮卓酮0.19。

18、、 生理 盐水3.97。 0036 上述尿石素霜剂的制备方法： 将上述单硬脂酸甘油酯、 硬脂酸、 液体石蜡和尼泊金 乙酯混合均匀制备成油相， 加热溶解， 搅匀， 保持在80； 将纯净水、 十二烷基硫酸钠、 甘油 混合均匀制备成水相， 保温在80； 将油相慢慢加入到水相中， 边加边搅拌， 加入三乙醇胺、 月桂氮卓酮， 置均质器上搅拌10min后， 用普通搅拌器继续搅拌直至冷却， 获得乳白色霜状 的混合物。 将尿石素A溶解在4ml生理盐水中， 然后缓慢添加上述已成型的乳白色霜状混合 物， 边加边缓慢搅拌， 直至均匀， 即可制备成所述尿石素霜剂。 0037 实施例5 说明书 3/6 页 5 CN 1。

19、10693880 A 5 0038 本实施例为本发明的一种尿石素软膏剂， 所述尿石素膏剂包括如下质量百分含量 的组分： 尿石素A0.1、 硬脂酸14、 凡士林7、 单硬脂酸甘油酯7、 液体石蜡21、 三乙 醇胺0.35、 纯净水39、 十二烷基硫酸钠0.18、 甘油7、 月桂氮卓酮0.07、 生理盐水 4.30。 0039 上述尿石素膏剂的制备方法： 同实施例2。 0040 实施例6 0041 本实施例为本发明的一种尿石素乳剂， 所述尿石素乳剂包括如下质量百分含量的 组分： 尿石素A 50、 Span-80 4.5、 甘油三酸酯9.5、 氢化植物油7、 吐温80 3、 纯净 水11、 甘油9、。

20、 生理盐水6。 0042 上述尿石素乳剂的制备方法： 油相的制备： 将上述Span-80、 甘油三酸酯、 和氢化植 物油均匀混合， 并经37水浴充分摇匀； 水相的制备： 将上述吐温80、 纯净水和甘油混合均 匀制备成水相； 按油相 水相1.5-2 1的体积比乳化， 先将油相放于胶体磨内， 慢速转动搅 拌， 同时缓慢加入水相， 加完后再以8000r/min搅拌10min； 在终止搅拌前， 将尿石素A溶解在 5ml生理盐水中， 然后缓慢添加至上述已成型的乳液中， 边加边缓慢搅拌， 直至均匀， 即可制 备成所述尿石素乳剂。 0043 实施例7 0044 本实施例为本发明的一种尿石素乳剂， 所述尿石素。

21、乳剂包括如下质量百分含量的 组分： 尿石素A99、 Span-80 0.1、 甘油三酸酯0.1、 氢化植物油0.1、 吐温80 0.1、 纯净水0.3、 甘油0.1、 生理盐水0.2。 0045 上述尿石素乳剂的制备方法： 同实施例6。 0046 实验例1 0047 本实验例为尿石素A(UA)对间充质干细胞毒性的研究 0048 1.材料和方法 0049 1.1骨髓来源的间充质干细胞的培养 0050 取36岁， 男性健康志愿者捐献的骨髓， 通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心收集单 核细胞， 用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次后， 将这些单核细胞直接种于细胞培养瓶中， 加 入含100U/。

22、ml青霉素、 100U/ml链霉素及10胎牛血清(Invitrogen公司)的-MEM (Invitrogen公司)培养基， 置于37、 5CO2的温箱中孵育， 继续培养5-7天(换液周期为3 天/次)， 可以观察到间充质干细胞集落形成。 细胞扩增后， 取P3P8代用于相关实验。 0051 1.2药物 0052 PBS， 尿石素A等购于美国Sigma-Aldrich公司。 0053 1.3统计 0054 计量资料用均数标准差表示， 采用SPSS16.0软件行ANOVA方差分析并以LSD-t检 验进行组间比较， P0.05可认为具有统计学意义。 0055 2.实验方法 0056 将UA溶于生理盐。

23、水， 配制成质量百分含量为0、 5、 10、 30、 50、 70、 90的 UA乳剂。 以此验证不同质量百分含量的UA制剂对间充质干细胞的毒性， 发明人以MTT法测定 细胞的活力。 将间充质干细胞接种于96孔板内， 并用不同浓度的尿石素A制剂处理72小时 后， 在培养基中加入5mg/ml的MTT， 孵育4h后在显微镜下读数。 存活率活细胞数/总细胞 说明书 4/6 页 6 CN 110693880 A 6 数*100。 0057 3.实验结果 0058 如图1所示， 结果表明， 在质量百分含量为0-50范围内， UA对细胞活性略有抑制， 但无显著的毒性作用， 表明该药物对间充质干细胞是安全的。

24、。 0059 实验例2 0060 本实验例研究尿石素UA制剂促进间充质干细胞成骨细胞分化 0061 1.材料和方法 0062 1.1骨髓来源的间充质干细胞的培养 0063 取36岁， 男性健康志愿者捐献的骨髓， 通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心收集单 核细胞， 用PBS洗涤两次后， 将这些单核细胞直接种于细胞培养瓶中， 加入含100U/ml青霉 素、 100U/ml链霉素及10胎牛血清(Invitrogen公司)的 -MEM(Invitrogen公司)培养基， 置于37、 5CO2的温箱中孵育， 继续培养5-7天(换液周期为3天/次)， 可以观察到间充质 干细胞集落形成。 细胞扩增。

25、后， 取P3P8代用于相关实验。 0064 1.2药物 0065 PBS， 尿石素A均购于美国Sigma Chemical公司。 0066 1.3统计 0067 计量资料用均数标准差表示， 采用SPSS16.0软件行ANOVA方差分析并以LSD-t检 验进行组间比较， P0.05可认为具有统计学意义。 0068 2.实验方法 0069 将UA溶于DMSO溶液， 配制成质量百分含量为90的母液。 为研究UA对间充质干细 胞向成脂肪分化的影响， 我们采用经典的间充质干细胞在体外诱导成脂肪分化的平台， 并 在此分化过程中添加质量百分含量为10、 30、 50的UA乳剂来研究UA对成脂肪分化的 效果，。

26、 对照处理为添加质量百分含量为10、 30、 50的的生理盐水。 在诱导分化的第10- 12天， 将培养板中培养基去掉， 加入PBS洗涤2次， 然后采用中性甲醛固定， 采用油红O染色， 显微镜下观察细胞内脂肪滴的形成， 并加入异丙醇经红色脂肪滴溶出后在570nm下测定吸 光度值进行定量分析， 结果如图2所示。 同时， 收集细胞， 裂解后提取RNA， 经反转录后采用实 时定量PCR(real time PCR)检测成脂肪分化相关的标记基因PPARr以及C/EBP的表达， 结果 如图3所示。 0070 3.实验结果 0071 由图2可知， 与对照相比， 质量百分含量为10、 30、 50的UA乳剂。

27、均明显抑制了 骨髓间充质干细胞的成脂肪分化。 由图3可知， 与对照相比， 质量百分含量为10、 30、 50的UA乳剂均明显抑制了成脂肪分化的标志基因的表达。 因此， 图2和图3的结果表明， UA 是一个潜在的抑制成脂肪分化的有效小分子。 0072 实验例3 0073 本实验例是尿石素A(UA)抑制小鼠体内脂肪形成的检测 0074 实验方法： 将MSCs接种到6孔板， 达到80融合度后加入经典脂肪分化的诱导剂， 同时加入质量百分含量为50的UA乳剂处理4-6天， 然后收集细胞， 经PBS洗涤后， 制成2 107cells/ml细胞悬液。 按照500ul细胞悬液的量分别皮下注射到裸鼠体内， 对照。

28、处理注射 500ul生理盐水； 对照细胞及UA处理的细胞每组8只， 每周一次， 连续4次。 继续饲养6周后， 处 说明书 5/6 页 7 CN 110693880 A 7 死裸鼠后取其皮下脂肪组织。 0075 实验结果： 由图4的尿石素A(UA)抑制小鼠体内脂肪形成的检测结果图可知， 经称 重后结果证明， 与对照组相比， UA处理后的MSCs脂肪形成能力明显减弱。 0076 综上， 尿石素A能抑制骨髓间充质干细胞的成脂肪分化， 且能抑制成脂肪分化的标 志基因PPARr和C/EBP的表达， 由此说明， 使用含尿石素A的尿石素制剂为肥胖患者提供去脂 减肥的效果。 本发明提供的尿石素制剂应用于制备减肥药品中， 为尿石素制剂开发了新的 用途， 同时也为需要去脂减肥的肥胖患者提供了新的治疗药物。 0077 最后所应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制， 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当 理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。 说明书 6/6 页 8 CN 110693880 A 8 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 9 CN 110693880 A 9 图4 说明书附图 2/2 页 10 CN 110693880 A 10 。