双硫仑纳米颗粒及其制备方法和用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911140858.7 (22)申请日 2019.11.20 (71)申请人 温州医科大学 地址 325000 浙江省温州市瓯海区东方南 路38号温州市国家大学科技园孵化器 (72)发明人 姚情寇龙发赵应征林蒙婷 鲁翠涛徐荷林张元元杨洋 (74)专利代理机构 温州名创知识产权代理有限 公司 33258 代理人 陈加利 (51)Int.Cl. A61K 47/69(2017.01) A61K 31/145(2006.01) A61K 33/34(2006.01) A61K 3。

2、3/30(2006.01) A61K 47/64(2017.01) A61P 35/00(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) (54)发明名称 一种双硫仑纳米颗粒及其制备方法和用途 (57)摘要 本发明公开了一种双硫仑纳米颗粒及其制 备方法和用途， 纳米颗粒由双硫仑、 纳米金属氧 化物和丝素蛋白组成， 属于纳米药物载体技术领 域。 本发明还公开了该纳米颗粒的制备方法， 首 先将双硫仑溶液缓慢滴入纳米金属氧化物分散 液中， 持续搅拌后加入丝素蛋白溶液继续搅拌， 最后加入3倍量的乙腈交联固化， 旋转蒸发除去 有机溶剂后冻干得到双硫仑纳米颗。

3、粒。 本发明所 制备的双硫仑纳米颗粒制备简单， 载药量高， 稳 定性高， 在较低剂量下即能有效抑制肿瘤细胞增 殖， 其抗肿瘤效果明显优于双硫仑药物， 具有广 阔的临床应用前景。 权利要求书1页 说明书7页 CN 110721318 A 2020.01.24 CN 110721318 A 1.一种双硫仑纳米颗粒， 其特征在于该双硫仑纳米颗粒由双硫仑、 纳米金属氧化物和 丝素蛋白组成,所述的纳米金属氧化物为纳米氧化锌、 纳米氧化铜。 2.根据权利要求1所述的一种双硫仑纳米颗粒， 其特征在于： 双硫仑、 纳米金属氧化物 和丝素蛋白的质量比为1： (0.25.0)： (0.54.0)。 3.根据权利要。

4、求2所述的双硫仑纳米颗粒， 其特征在于： 所述双硫仑、 纳米金属氧化物 和丝素蛋白的质量比为1： (0.52.0)： (1.03.0)。 4.根据权利要求3所述的双硫仑纳米颗粒， 其特征在于： 所述双硫仑、 纳米金属氧化物 和丝素蛋白的质量比为1： 1： 2。 5.根据权利要求1所述的双硫仑纳米颗粒， 其特征在于： 所述的双硫仑纳米颗粒的粒径 在50200nm。 6.一种如权利要求1所述的双硫仑纳米颗粒的制备方法， 其特征在于包括以下步骤： (1)将双硫仑用无水乙醇溶解后， 配置成双硫仑溶液 (2)将双硫仑溶液缓慢滴入纳米金属氧化物分散液， 持续搅拌一段时间得到混悬液； (3)将得到的混悬液滴。

5、入丝素蛋白水溶液， 继续搅拌一段时间得到混合液； (4)在上述混合液中加入3倍量体积的乙腈充分混合搅拌， 然后旋转蒸发除去有机溶剂 后冻干得到双硫仑纳米颗粒。 7.根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于： 双硫仑溶液的浓度为10mg/mL。 8.根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于： 纳米金属氧化物分散液的浓度为 1.25mg/mL12.5mg/mL， 丝素蛋白水溶液的浓度为10mg/mL40mg/mL。 9.一种抗肿瘤治疗药物， 其特征在于： 包括有权利要求1-5之一所述的双硫仑纳米颗 粒， 所述的肿瘤为乳腺癌、 肠道肿瘤、 肝癌、 宫颈癌、 卵巢癌、 胃癌、 脑部肿瘤、 胆囊癌或。

6、血液 系统肿瘤。 10.根据权利要求9所述的抗肿瘤治疗药物， 其特征在于： 还包括有药学上可接受的载 体、 赋形剂或药物制剂方面可接受的盐。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110721318 A 2 一种双硫仑纳米颗粒及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明属于纳米药物载体和医药技术领域， 具体是一种双硫仑纳米颗粒及其制备 方法和在用于制备抗肿瘤治疗药物的用途。 背景技术 0002 双硫仑(DSF)是一种由FDA批准的抗酒精中毒药物， 是目前应用最多的传统戒酒药 物。 它能够抑制乙醛脱氢酶氧化代谢乙醛， 使酒精代谢产物乙醛在体内蓄积， 从而达到戒酒 的目的。 DSF具有较好的安全性，。

7、 无明显的毒副作用。 近几年来研究人员发现DSF在肿瘤研究 治疗中显示出巨大的潜力， 能够在体内外杀伤包括乳腺癌、 直肠癌、 黑色素瘤、 脑胶质瘤等 多种肿瘤细胞。 相对于传统的化疗药物， DSF毒性低， 价格低廉， 应用前景广阔。 但是目前DSF 的剂型以口服为主， 需要大量服用才能达到有效剂量， 容易导致患者出现双硫仑样反应等 副作用。 此外， 由于DSF在血液中高度不稳定， 不能在肿瘤组中达到有效的治疗浓度， 导致 DSF在癌症治疗的临床应用中受到了极大的限制。 因此， 如何提高双硫仑在抗肿瘤方面的治 疗效果， 已经成为一个关键难题。 0003 当前有多个研究已经证明DSF的抗癌作用是由。

8、于DSF在生理环境中代谢为二硫代 氨基甲酸酯(DTC)， 这个二硫二聚体是有效的金属螯合剂， 并且已经有研究证实DSF的抗肿 瘤活性是Cu2+或Zn2+等金属离子依赖的， DSF与金属离子一起作为抗癌药物取得了令人欣喜 的进展。 但是现有技术采用的铜补充剂很难直接提高药物在作用部位的铜离子浓度， 导致 临床上出现药物作用效果的个体差异性较大。 目前有报道称可以采用共同递送金属离子以 提高药物作用效果， 但是其载药效率较低， 特别是金属离子和双硫仑的共同递送对载体具 有较高的要求。 0004 金属纳米氧化材料， 例如纳米氧化锌(ZnO)和氧化铜(CuO)已广泛应用于工业工具 和化妆品等行业中， 。

9、具有荧光性、 压电性、 吸收和散射紫外线能力。 目前尚无关于纳米氧化 锌或纳米氧化铜用于双硫仑药物递送的报道。 但是金属纳米氧化材料具有一定的生物毒 性， 如何修饰其表面性质提高生物相容性至关重要。 发明内容 0005 为解决现有技术存在的问题和不足， 本发明的目的是提供一种双硫仑纳米颗粒及 其制备方法和用于抗肿瘤治疗药物的用途。 0006 作为本发明的第一个方面， 本发明提供一种双硫仑纳米颗粒， 该双硫仑纳米颗粒 由双硫仑、 纳米金属氧化物和丝素蛋白组成,所述的纳米金属氧化物为纳米氧化锌、 纳米氧 化铜。 0007 进一步设置是双硫仑、 纳米金属氧化物和丝素蛋白的质量比为1： (0.25.0。

10、)： (0.54.0)。 0008 进一步设置是所述双硫仑、 纳米金属氧化物和丝素蛋白的质量比为1： (0.5 2.0)： (1.03.0)。 说明书 1/7 页 3 CN 110721318 A 3 0009 进一步设置是所述双硫仑、 纳米金属氧化物和丝素蛋白的质量比为1： 1： 2。 0010 进一步设置是所述的双硫仑纳米颗粒的粒径在50200nm。 0011 通过上述设置， 本发明首次提出构建一种由丝素蛋白、 双硫仑和纳米金属氧化物 共同组成的双硫仑纳米颗粒。 纳米金属氧化物在肿瘤酸性环境中可释放金属离子和活性 氧， 与双硫仑协同杀死肿瘤细胞。 丝素蛋白的表面修饰可提高金属纳米氧化物的生。

11、物相容 性， 并提高双硫仑的体内外稳定性。 这种有效的双硫仑给药体系在未来癌症治疗中具有潜 力。 本发明还公开了该纳米颗粒的制备方法， 该方法简单易行， 可操作性极强。 目前对于将 丝素蛋白、 双硫仑和纳米氧化锌联用构建纳米递送体系是否能够提高双硫仑的抗肿瘤作用 的研究国内外尚未见报道。 0012 本发明的第二个方面是提供一种双硫仑纳米颗粒的制备方法， 包括以下步骤： 0013 (1)将双硫仑用无水乙醇溶解后， 配置成双硫仑溶液 0014 (2)将双硫仑溶液缓慢滴入纳米金属氧化物分散液， 持续搅拌一段时间得到混悬 液； 0015 (3)将得到的混悬液滴入丝素蛋白水溶液， 继续搅拌一段时间得到混。

12、合液； 0016 (4)在上述混合液中加入3倍量体积的乙腈充分混合搅拌， 然后旋转蒸发除去有机 溶剂后冻干得到双硫仑纳米颗粒。 旋转蒸发除去有机试剂， 0017 冻干除水得到的是固体粉末。 0018 进一步设置是双硫仑在无水乙醇中的浓度为10mg/mL。 0019 进一步设置是纳米金属氧化物分散液的浓度为1.25mg/mL12.5mg/mL， 丝素蛋白 水溶液的浓度为10mg/mL40mg/mL。 纳米金属氧化物分散液的溶剂为水。 0020 另外， 本发明还提供一种抗肿瘤治疗药物， 包括有所述的双硫仑纳米颗粒， 所述的 肿瘤为乳腺癌、 肠道肿瘤、 肝癌、 宫颈癌、 卵巢癌、 胃癌、 脑部肿瘤、。

13、 胆囊癌或血液系统肿瘤。 0021 进一步设置是还包括有药学上可接受的载体、 赋形剂或药物制剂方面可接受的 盐。 0022 术语 “药物制剂方面可接受的盐” 意指对病人无害的盐类。 这些盐类中包括药物制 剂方面可接受的酸或碱的加成盐， 金属盐， 铵盐和烷基化铵盐， 加成盐包括无机酸盐和有机 酸盐。 可接受的无机酸盐的代表包括盐酸盐， 氢溴酸盐， 氢碘酸盐， 磷酸盐， 磺酸盐， 硝酸盐 等类似无机酸盐类。 可接受的有机酸典型例子包括甲酸， 乙酸， 三氯乙酸， 三氟乙酸， 丙酸， 苯甲酸， 肉桂酸， 柠檬酸， 富马酸， 甘露酸， 乳酸， 马来酸， 苹果酸， 丙二酸， 扁桃酸， 草酸， 苦味 酸， 。

14、丙酮酸， 水杨酸， 琥珀酸， 甲基磺酸， 乙基磺酸， 酒石酸， 抗坏血酸， 双羟萘酸， 亚甲基双水 杨酸， 乙基二磺酸， 葡萄糖酸， 甲基顺丁烯二酸， 天冬氨酸， 硬脂酸， 棕榈酸， 乙二胺四乙酸， 甘醇酸， 对氨基苯甲酸， 谷氨酸， 苯磺酸， 甲苯磺酸等等。 药物制剂方面可接受的无机酸和有 机酸加成盐包括药物制剂方面可接受的盐的更多例子在J.Pharm.Sci.1977， volume66， issue2中列举出来。 金属盐的例子包括锂、 钠、 钾、 镁盐等等。 铵盐和烷基化铵盐的例子包 括， 铵， 甲胺盐， 二甲胺盐， 三甲胺盐， 乙胺盐， 乙醇胺， 二乙胺， 丁基胺盐， 四甲基胺盐等等。。

15、 0023 本发明的药物组成可利用药物制剂方面可接受的载体或者赋形剂， 例如那些在 Remington公开的： The Science and Practice of Pharmacy， 19th Edition， Gennaro， Ed.， Mack Publishing Co.， Easton， PA， 1995。 0024 药物制剂方面可接受的载体包括惰性固体稀释剂或者填充剂， 无菌水溶液和各种 说明书 2/7 页 4 CN 110721318 A 4 有机溶剂。 固体载体包括乳糖， 石膏粉， 蔗糖， 环糊精， 滑石粉， 明胶， 琼脂， 果胶， 阿拉伯胶， 硬脂酸镁， 硬脂酸和纤维素的低。

16、级烷基醚。 液体载体包括糖浆， 花生油， 橄榄油， 磷脂， 脂肪 酸， 脂肪酸胺， 聚氧乙烯和水。 此外， 本发明的化合物可以与水或普通的有机溶剂形成溶剂 化物。 这样的溶剂化物也包含在本发明的范围之内。 0025 有益效果： 0026 本发明的纳米颗粒能够同步递送双硫仑和药物作用所必须的金属离子， 有效解决 传统的双硫仑制剂的瓶颈问题。 0027 通过溶剂自组装法交联变性制备纳米颗粒， 对双硫仑起到了增溶、 稳定和金属离 子控制释放的作用， 提高了其在体内的半衰期， 并有效提高了双硫仑的抗肿瘤作用。 并且， 整个制备过程操作简单， 条件稳定， 重现性良好。 本发明通过大量试验发现所述双硫仑纳。

17、米 颗粒对治疗恶性肿瘤效果好， 毒副作用小， 成本低廉。 将有助于延缓病情进展恶化， 还具有 可操作性强， 能显著降低患者及医疗机构的诊疗费用等优点。 0028 本申请的创新机理： 纳米氧化锌可以在肿瘤微环境的低pH条件下局部产生锌离子 和ROS， 可以协同双硫仑发挥抗肿瘤作用。 双硫仑本身的抗肿瘤效果不佳， 临床实验中采用 铜离子补充剂的方式错开给药。 在本设计中， 纳米氧化锌或者纳米氧化铜， 既作为双硫仑的 纳米载体， 通过金属络合作用提高载药量， 又可以在肿瘤微环境中提供发挥抗肿瘤作用所 必需的的金属离子， 实现较好的抗肿瘤作用。 丝素蛋白可以通过与纳米氧化锌及双硫仑的 结合， 修饰于双。

18、硫仑/氧化锌表面， 以减少进入血液循环之后的蛋白吸附可以提高体循环时 间并增加纳米载体肿瘤被动靶向作用， 另外的话也可以改善普通金属纳米颗粒的生物相容 性的问题。 具体实施方式 0029 为使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合实施例对本发明作进 一步地详细描述。 0030 实施例双硫仑纳米颗粒的制备 0031 制备方法参考例 0032 蚕茧经过碳酸氢钠弱碱溶液脱胶以后， 用溴化锂溶液完全溶解， 在经过去离子水 透析后得到再生丝素蛋白； 将20mg双硫仑溶解在2mL无水乙醇中， 得到10mg/mL的双硫仑溶 液， 将该溶液加入到6mL纳米氧化锌混悬液中， 持续搅拌6小时后， 缓。

19、慢滴入2mL丝素蛋白水 溶液继续搅拌6小时， 将所得到的混合液加入30mL的乙腈溶液， 混合搅拌1小时后， 旋转蒸发 除去有机溶剂， 冻干即得双硫仑纳米颗粒。 0033 根据相同方法改变物料配比， 获得以下实施例1-12的双硫仑纳米颗粒， 并设置比 例对照组1-7和替换对照组1-5。 0034 表1双硫仑纳米颗粒处方(单位： mg) 说明书 3/7 页 5 CN 110721318 A 5 0035 0036 0037 注:*表示标注剂量的成分由括号内的成分所替代。 0038 试验例： 双硫仑纳米颗粒的粒径和表面电位 0039 取实施例1中制备得到的双硫仑纳米颗粒， 分别测定其粒径大小和包封率。

20、， 结果见 表2。 取实施例1中制备得到的双硫仑纳米颗粒， 用水分散后在室温条件下放置两周， 分别测 定其粒径大小和包封率， 结果见表2。 0040 表2双硫仑纳米颗粒的粒径和包封率 0041 处方号粒径包封率粒径包封率 实施例192.889.2102.388.7 实施例293.688.7100.785.3 实施例376.686.478.380.1 实施例4126.593.5144.993.3 实施例5104.890.3110.388.7 实施例6109.791.8120.389.1 实施例7105.265.3107.258.7 实施例8167.393.2291.476.3 实施例9122.4。

21、95.9198.380.2 实施例1070.285.7112.983.9 说明书 4/7 页 6 CN 110721318 A 6 实施例11130.688.1140.186.4 实施例12141.389.7145.888.1 比例对照组180.7-87.3- 比例对照组276.98.280.86.7 比例对照组3350.476.2400.747.2 比例对照组486.337.290.118.9 比例对照组5131.693.1175.380.2 比例对照组6259.790.3377.450.9 比例对照组7124.591.3133.990.6 替换对照组1100.388.2113.282.3 。

22、替换对照组294.260.4103.250.9 替换对照组383.125.7109.518.1 替换对照组4109.180.9183.163.2 替换对照组5296.546.5244.830.1 0042 本发明的双硫仑纳米颗粒外观形态为球形， 边缘平整光滑， 粒径基本为正态分布。 在本发明的实施例比例范围内(实施例112)， 按照提供的制备方法可成功制备得到50 200nm之间的纳米粒， 且具有较好的包封率(50)。 本发明的双硫仑纳米颗粒(实施例1 12)具有良好的储存稳定性， 在水中分散放置两周后， 依然保持良好的纳米尺寸， 并避免了 活性药物的提前泄露。 纳米金属氧化物可以显著提高双硫。

23、仑的包封率。 丝素蛋白外部修饰 可以提高双硫仑的稳定性， 并避免纳米粒子聚集和药物的提前释放。 0043 试验例： 双硫仑纳米颗粒对肿瘤细胞的杀伤作用 0044 取对数生长期的肿瘤细胞(4T1和C6)， 用含10FBS的DMEM培养液调整细胞浓度至 6104个/mL， 接种于96孔细胞培养板中， 100uL/孔， 置于含有5CO2的37恒温培养箱中培 养12h， 然后在各孔中加入不同浓度双硫仑处方。 加药后继续培养48小时后， 在各孔中加入 10 L的MTT溶液(5mg/mL)， 继续培养4小时， 吸弃培养液， 在各孔中加入DMSO， 经微量混合振 荡器振荡10分钟后， 全自动酶联免疫检测仪于。

24、570nm处测定吸光度值， 计算抑制率IC50。 0045 表3各实验组对肿瘤细胞的杀伤作用结果 说明书 5/7 页 7 CN 110721318 A 7 0046 0047 根据结果(表3)， 本发明的双硫仑纳米颗粒具有良好的抗肿瘤效果， 显著降低了 IC50值。 该结果表明， 本发明的双硫仑纳米颗粒的抗肿瘤结果与其处方组成具有相关性， 在 优选的比例范围内其抗肿瘤效果更为显著。 0048 实施例4双硫仑纳米颗粒的体内抗肿瘤作用 0049 4.1荷瘤小鼠模型的建立 0050 按2106个细胞每只将对数期紫杉醇耐药细胞(MCF-7/PTX)接种于体重18-20g， 周龄5-6周的雌性BABL/。

25、c裸鼠腋下。 观察测量， 当移植瘤长至50100mm3后开始随机分组。 分组后的第2,4,6天分别静脉注射各双硫仑制剂(10mg/kg)。 给药结束两周后停止实验， 脱 颈椎处死小鼠并称重， 剥取肿瘤并称重， 计算抑瘤率： 抑瘤率1-(给药组平均瘤重/阴 性组平均瘤重)100。 。 0051 4.2实验分组 0052 实验组按照生理盐水组， 双硫仑溶液组(静脉注射)， 双硫仑溶液组+口服铜补充剂 和双硫仑纳米颗粒处方1， 2， 6， 12及替换对照组4和5。 0053 4.3实验结果和结论 0054 表4双硫仑纳米颗粒对耐药性乳腺癌小鼠移植瘤瘤重和抑瘤率结果 说明书 6/7 页 8 CN 11。

26、0721318 A 8 0055 组别瘤重(g)抑瘤率() 生理盐水1.54- 双硫仑溶液组1.399.74 双硫仑溶液组+口服铜补充剂1.0829.87 纳米氧化锌混悬液组1.474.54 样品10.8359.09 样品20.7564.28 样品60.9438.96 样品121.0333.11 替换对照组41.2419.48 替换对照组51.3512.3 0056 结果如表4所示。 本发明中双硫仑纳米颗粒(处方1， 2， 6， 12)的抗肿瘤效果( 50)明显优于双硫仑溶液组(9.74)及双硫仑+口服铜补充剂组(29.87)。 0057 以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已， 当然不能以此来限定本发明之权利范 围， 因此依本发明权利要求所作的等同变化， 仍属本发明所涵盖的范围。 说明书 7/7 页 9 CN 110721318 A 9 。