COL/PEGCaP生物矿化多层膜的制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910962308.7 (22)申请日 2019.10.11 (71)申请人 中国地质大学 （北京） 地址 100083 北京市海淀区学院路29号 (72)发明人 张以河安琪马泽群 (74)专利代理机构 北京兴智翔达知识产权代理 有限公司 11768 代理人 蒋常雪 (51)Int.Cl. C08L 89/00(2006.01) C08L 71/02(2006.01) C08K 3/32(2006.01) C08J 5/18(2006.01) A61L 27/06(2006。

2、.01) A61L 27/34(2006.01) A61L 27/32(2006.01) A61L 27/50(2006.01) A61L 27/56(2006.01) (54)发明名称 一种COL/PEGCaP生物矿化多层膜的制备方 法 (57)摘要 本发明公开了一种COL/PEGCaP生物矿化多 层膜的制备方法， 以钛合金为基底， 通过PDA的改 性提高钛合金的表面黏附性， 并在PDA改性钛合 金基底上以COL和PEG为聚电解质， 利用层层自组 装技术制备COL/PEG自组装多层膜， 最后通过生 物矿化制得COL/PEGCaP生物矿化多层膜。 本发 明所制备的COL/PEGCaP生物矿化多。

3、层膜能有效 改善无机粒子在体内的生物毒性； 制备工艺简 单， 成本低， 周期短， 适合大批量生产， 具有广泛 的应用前景； 所制得的(COL/PEG)CaP矿化薄膜 具有药物负载与释放、 控制成骨细胞定向分化和 检测细胞分化程度的功能， 在组织工程领域具有 广泛的应用前景。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 110734646 A 2020.01.31 CN 110734646 A 1.一种COL/PEGCaP生物矿化多层膜的制备方法， 其特征在于， 以钛合金为基底， 通过 PDA的改性提高钛合金的表面黏附性， 并在PDA改性钛合金基底上以COL和PEG为聚电解质， 利用层层自组装技。

4、术制备COL/PEG自组装多层膜， 最后通过生物矿化制得COL/PEGCaP生物 矿化多层膜。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1、 以医用钛合金为基底， 通过等离子处理使基底表面亲水； S2、 配置DA溶液， 采用Tris溶液调整其pH值后搅拌， 使DA溶液聚合得到PDA溶液； S3、 将步骤S1中经等离子处理后的基底浸泡在PDA溶液中， 提高基底的表面黏附性； S4、 分别配置COL溶液、 PEG溶液、 CaCl2溶液和K2HPO4溶液； S5、 将步骤S3中经PDA改性后的基底置入COL溶液中静置， 去离子水清洗， 氮气吹干； S6、 将步骤S5得到的。

5、基底置入PEG溶液中静置， 去离子水清洗， 氮气吹干； S7、 重复步骤S5和S6， 利用红外检测组装薄膜过程的变化， 得到以钛合金为基底的COL/ PEG多层膜； S8、 将步骤S7得到的COL/PEG多层膜置入CaCl2溶液中静置， 氮气吹干； S9、 将步骤S8得到的多层膜置入K2HPO4溶液中静置， 通过生物矿化制得CaP矿物， 氮气吹 干； S10、 重复步骤S8和S9， 得到COL/PEGCaP生物矿化多层膜。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S2中， 所述DA溶液的浓度为0.5-5mg/mL； 和/或， 采用Tris溶液调整DA溶液pH为8-10。 4.根据。

6、权利要求2或3所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S3中， 所述基底浸泡在PDA溶 液中的时间为10-30min。 5.根据权利要求2或3所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S4中， 所述COL溶液的浓度为0.5-2mg/mL， 并用氢氧化钠溶液调节其pH为3-4； 和/或， 所述PEG溶液的浓度为0.5-2mg/mL； 和/或， 所述CaCl2溶液的浓度为400-600mmol/L； 和/或， 所述K2HPO4溶液的浓度为200-400mmol/L。 6.根据权利要求2或3所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S5中， 所述基底置入COL溶液中静置的时间为10-20min； 和/或， 步骤S6。

7、中， 所述基底置入PEG溶液中静置的时间为10-20min。 7.根据权利要求2或3所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S7中， 步骤S5和S6的交替重复 次数为5-20次， 且最后一次浸入PEG溶液， 得到以钛合金为基底的COL/PEG多层膜。 8.根据权利要求2或3所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S8中， 所述多层膜置入CaCl2溶液中静置的时间为3-10min； 和/或， 步骤S9中， 所述多层膜置入K2HPO4溶液中静置的时间为3-10min。 9.根据权利要求2或3所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S10中， 步骤S8和S9的交替重 复次数为1-5次。 10.权利要求1-9任一。

8、项所述的制备方法在制备生物组织工程材料中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110734646 A 2 一种COL/PEGCaP生物矿化多层膜的制备方法 技术领域 0001 本发明属于化学复合材料、 层层自组装及生物矿化制备技术领域， 涉及层层自组 装薄膜和生物矿化离子的制备方法， 具体涉及一种COL/PEGCaP生物矿化多层膜的制备方 法。 背景技术 0002 超分子化学发展迅速， 越来越受到科学界的关注。 超分子化学的目标是以非共价 方式合成材料， 在自然生命系统中到处存在非共价力， 例如蛋白质的四级结构， 磷脂双层膜 的双链DNA。 特别是超分子纳米技术， 其在疾病的诊断和治疗方。

9、面显示出巨大的潜力。 具体 而言， 通过超分子自组装技术可以制备具有可调节和多样性质的纳米颗粒， 其在纳米药物 领域具有巨大潜力。 如今， 纳米医学开发的纳米材料可分为三大类， 包括： 无机， 有机和有 机-无机杂化纳米系统。 对于无机纳米粒子， 它们具有独特的物理和化学性质以及多种形态 和尺寸。 然而， 无机纳米粒子往往具有生物毒性， 这阻碍了这种纳米材料在临床试验中的发 展。 采用有机-无机杂化纳米系统结合了无机和有机材料的优势。 有希望合成具有多种功能 和生物相容性的材料并应用于新型生物医学及临床应用。 利用自组装构建有机-无机杂化 纳米生物材料不仅可以结合异构结构单元的内在性质， 而且。

10、可以通过它们之间的超分子相 互作用获得新的物理， 化学和生物功能。 0003 生物矿化材料， 如聚多巴胺(PDA)， 碳酸钙(CaCO3)， 和磷酸钙(CaP)， 因其优异的生 物应用而成为合适的材料。 CaCO3和CaP因其高生物相容性， 生物降解性和对pH的响应性而 被证明是生物医学应用的不错的材料。 CaCO3和CaP在中性pH下稳定， 在酸性pH条件下分解， 可用于pH响应药物或基因传递。 与传统纳米粒子相比， 生物矿化粒子具有生物毒性小， 代谢 途径清晰， 刺激反应灵敏的优点。 所有这些优势为我们提供了一种新颖的组织工程材料。 0004 因此， 使用层层自组装技术制备具有高生物相容性。

11、的多层薄膜， 并将其与生物矿 化的无机纳米离子结合起来， 不仅可以在分子水平上调控所得材料的尺寸、 结构和形貌， 而 且很好的解决了无机纳米离子的生物毒性问题， 使无机纳米粒子载药等性能得以更好的发 挥。 本发明使用COL和PEG作为组装单元， 为材料提供了很好的生物相容性， 同时可以控制生 物矿化的CaP晶体的生长， 调节其尺寸、 结构和形貌， 从而使其拥有药物释放和促进细胞分 化等功能。 0005 在本文中， DA为多巴胺， PDA为聚多巴胺， Tris为三羟甲基氨基甲烷， COL为胶原蛋 白， PEG为聚乙二醇， CaCl2为氯化钙， K2HPO4为磷酸氢二钾， CaP为磷酸钙。 发明内。

12、容 0006 为了克服无机纳米粒子存在的生物毒性、 结晶生长无规律的问题， 本发明提供一 种基于钛合金基底的COL/PEGCaP生物矿化多层膜的制备方法， 该方法通过层层自组装技 术制备出生物相容性良好的多层膜， 通过生物矿化， 有机多层膜很好的控制了CaP矿物的结 晶， 调整其表面形貌， 使其具备药物负载与释放、 促进细胞定向分化等功能， 同时该方法制 说明书 1/5 页 3 CN 110734646 A 3 备工艺简单， 周期短， 环保无污染， 可重复性强， 所得矿化多层膜稳定， 可实现大批量制备。 0007 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 0008 一种COL/PEGCaP生物。

13、矿化多层膜的制备方法， 其特征在于， 以钛合金为基底， 通 过PDA的改性提高钛合金的表面黏附性， 并在PDA改性钛合金基底上以COL和PEG为聚电解 质， 利用层层自组装技术制备COL/PEG自组装多层膜， 最后通过生物矿化制得COL/PEGCaP 生物矿化多层膜。 0009 钛合金常用于制造植入人体内的医疗器件、 假体或人工器官和辅助治疗设备的钛 合金。 经过PDA的黏附， COL/PEG薄膜的组装， 钛合金基底拥有了更好的生物相容性， 更加适 合细胞和组织工程学的应用； 经过生物矿化后形成CaP矿物颗粒， 构成可调节形态的多孔结 构， 提高了薄膜的载药量和药物释放时间， 同时， 多孔的结。

14、构对成骨细胞的定向分化起到了 促进作用。 0010 进一步地， 在上述技术方案中， 所述制备方法包括以下步骤： 0011 S1、 以医用钛合金为基底， 通过等离子处理使基底表面亲水； 0012 S2、 配置DA溶液， 采用Tris溶液调整其pH值后搅拌， 使DA溶液聚合得到PDA溶液； 0013 S3、 将步骤S1中经等离子处理后的基底浸泡在PDA溶液中， 提高基底的表面黏附 性； 0014 S4、 分别配置COL溶液、 PEG溶液、 CaCl2溶液和K2HPO4溶液； 0015 S5、 将步骤S3中经PDA改性后的基底置入COL溶液中静置， 去离子水清洗， 氮气吹 干； 0016 S6、 将。

15、步骤S5得到的基底置入PEG溶液中静置， 去离子水清洗， 氮气吹干； 0017 S7、 重复步骤S5和S6， 利用红外检测组装薄膜过程的变化， 得到以钛合金为基底的 COL/PEG多层膜； 0018 S8、 将步骤S7得到的COL/PEG多层膜置入CaCl2溶液中静置， 氮气吹干； 0019 S9、 将步骤S8得到的多层膜置入K2HPO4溶液中静置， 通过生物矿化制得CaP矿物， 氮 气吹干； 0020 S10、 重复步骤S8和S9， 得到COL/PEGCaP生物矿化多层膜。 0021 优选地， 步骤S2中， 所述DA溶液的浓度为0.5-5mg/mL。 0022 优选地， 步骤S2中， 采用T。

16、ris溶液调整DA溶液pH为8-10。 0023 详细地， DA溶液在碱性条件下可在常温下即能自发聚合。 0024 优选地， 步骤S3中， 所述基底浸泡在PDA溶液中的时间为10-30min。 0025 优选地， 步骤S4中， 所述COL溶液的浓度为0.5-2mg/mL， 并用氢氧化钠溶液调节其 pH为3-4。 0026 优选地， 步骤S4中， 所述PEG溶液的浓度为0.5-2mg/mL。 0027 优选地， 步骤S4中， 所述CaCl2溶液的浓度为400-600mmol/L。 0028 优选地， 步骤S4中， 所述K2HPO4溶液的浓度为200-400mmol/L。 0029 优选地， 步骤。

17、S5中， 所述基底置入COL溶液中静置的时间为10-20min。 0030 优选地， 步骤S6中， 所述基底置入PEG溶液中静置的时间为10-20min。 0031 优选地， 步骤S7中， 步骤S5和S6的交替重复次数为5-20次， 且最后一次浸入PEG溶 液， 得到以钛合金为基底的COL/PEG多层膜。 说明书 2/5 页 4 CN 110734646 A 4 0032 优选地， 步骤S8中， 所述多层膜置入CaCl2溶液中静置的时间为3-10min。 0033 优选地， 步骤S9中， 所述多层膜置入K2HPO4溶液中静置的时间为3-10min。 0034 优选地， 步骤S10中， 步骤S8。

18、和S9的交替重复次数为1-5次。 0035 本发明另一方面还提供了上述制备方法在制备生物组织工程材料中的应用。 0036 本发明的优点： 0037 (1)本发明所制备的COL/PEGCaP生物矿化多层膜能有效改善无机粒子在体内的 生物毒性， 使无机粒子可以更有效地发挥其在生物体内的功能； 0038 (2)本发明所提供的制备方法采用层层自组装技术制备具有良好生物相容性的高 分子多层膜， 是一种通过逐层交替沉积的方法， 利用层与层之间的弱相互作用结合在一起 的方法， 制备工艺简单， 周期短， 适合大批量生产， 具有广泛的应用前景； 0039 (3)本发明所提供的制备方法通过生物矿化技术， 使用有机。

19、高分子多层膜调整无 机粒子的成核、 结晶、 生长， 同时通过层数的变化调节其表面形貌， 使其具备药物负载与释 放， 促进细胞定向分化的功能； 0040 (4)本发明所提供的制备方法在层层自组装过程中， 使用胶原蛋白这种有机高分 子， 它的来源主要是哺乳动物体内， 避免了生物体的免疫排斥反应， 增加了材料的生物相容 性。 附图说明 0041 图1为本发明实施例1中制备得到的(COL/PEG)15CaP矿化多层膜的面扫描电子显 微镜图像； 0042 图2为本发明实施例1中制备得到的(COL/PEG)15CaP矿化多层膜的原子力显微镜 图像及其高度表示图像； 0043 图3为本发明实施例1中(COL。

20、/PEG)15CaP矿化多层膜和实施例2中(COL/PEG)10 CaP矿化多层膜及两者未经矿化后的(COL/PEG)15和(COL/PEG)10多层膜对亚甲基蓝释放的 影响； 0044 图4为本发明实施例1中(COL/PEG)15CaP矿化多层膜和实施例2中(COL/PEG)10 CaP矿化多层膜、 未经矿化后的(COL/PEG)10多层膜及空白钛合金基底在培养细胞7天和14天 后碱性磷酸酶活性的检测结果图； 0045 图5为本发明实施例1中(COL/PEG)15CaP矿化多层膜和实施例2中(COL/PEG)10 CaP矿化多层膜、 未经矿化后的(COL/PEG)10多层膜及空白钛合金基底在。

21、培养细胞7天、 14天 和21天后Runx2基因表达的检测结果图； 0046 图6为本发明实施例1中(COL/PEG)15CaP矿化多层膜和实施例2中(COL/PEG)10 CaP矿化多层膜、 未经矿化后的(COL/PEG)10多层膜及空白钛合金基底在培养细胞7天、 14天 和21天后OCN基因表达的检测结果图； 0047 图7为本发明实施例1中(COL/PEG)15CaP矿化多层膜和实施例2中(COL/PEG)10 CaP矿化多层膜、 未经矿化后的(COL/PEG)10多层膜及空白钛合金基底在培养细胞7天、 14天 和21天后OPN基因表达的检测结果图。 说明书 3/5 页 5 CN 110。

22、734646 A 5 具体实施方式 0048 下面结合附图和实施例， 对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。 以下实施 例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的保护范围， 本发明的保护范围以权利要求书为 准。 0049 若未特别指明， 本发明实施例中所用的实验试剂和材料等均可市售获得。 0050 若未具体指明， 本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常 规手段。 0051 实施例1 0052 本发明实施例提供了一种COL/PEGCaP生物矿化多层膜的制备方法， 包括以下步 骤： 0053 (1)以医用钛合金为基底， 将钛合金基底进行等离子处理， 使其表面羟基化， 从而 达到较。

23、好的亲水性， 以便后续的组装过程； 0054 (2)配置1mg/mL的DA溶液并用Tris溶液调整其pH值至8.5， 磁力搅拌使DA聚合形成 PDA溶液。 0055 (3)将钛合金基底浸泡在PDA溶液中30min， 以改善基底的表面的粘附性， 为随后的 聚电解质组装做基底 0056 (4)分别配置1mg/mL的COL溶液、 1mg/mL PEG溶液、 500mM的CaCl2溶液和300mM的 K2HPO4溶液， 并将COL溶液的pH值用氢氧化钠调节至3.5； 0057 (5)将步骤(3)中的改性钛合金基底置入COL溶液中静置10min， 去离子水清洗， 氮 气吹干； 0058 (6)将步骤(5。

24、)中的材料置入PEG溶液中静置10min， 去离子水清洗， 氮气吹干； 0059 (7)重复步骤(5)和(6)15次， 利用红外检测组装薄膜过程的变化， 得到以钛合金和 基底的(COL/PEG)15多层膜。 0060 (8)将步骤(7)中得到的多层膜置入CaCl2溶液中静置3min， 氮气吹干； 0061 (9)将步骤(8)中得到的材料置入K2HPO4溶液中静置3min， 使其进行生物矿化产生 CaP矿物， 氮气吹干。 0062 性能测试 0063 (1)配制1mg/mL的亚甲基蓝溶液， 分别将步骤(7)所得的(COL/PEG)15多层膜和步骤 (9)所得的(COL/PEG)15CaP矿化薄膜。

25、置于溶液中24h， 吸附亚甲基蓝分子； 0064 (2)配制pH7.4的PBS(磷酸盐)缓冲溶液， 分别将步骤(7)所得的(COL/PEG)15多层 膜和步骤(9)所得的(COL/PEG)15CaP矿化薄膜置于其中， 探究薄膜在矿化前后对负载分子 的释放效果， 用紫外监测其释放过程； 0065 (3)分别将空白的医用钛合金基底、 步骤(7)所得的(COL/PEG)15多层膜和步骤(9) 所得的(COL/PEG)15CaP矿化薄膜置于细胞培养板中， 接种5105个小鼠胚胎成骨前体细胞 (MC3T3-E1)正常培养7天、 14天后检测其碱性磷酸酶(ALP)蛋白活性和培养7天、 14天、 21天 后。

26、， 其mRNA基因表达情况。 0066 实施例2 0067 在实施例1的基础上， 本实施例中与实施例1不同的是： 步骤7)中， 交替重复步骤5) 和步骤6)各10次； 其它部分与实施例1完全一致。 说明书 4/5 页 6 CN 110734646 A 6 0068 实施例3： 0069 在实施例1的基础上， 本实施例中与实施例1不同的是： 步骤4)中， 配置的COL溶液 和PEG溶液的浓度均为0.5mg/mL， 并用氢氧化钠将COL溶液的pH值调节至3.5； 其它部分与实 施例1完全一致。 0070 实施例4： 0071 在实施例1的基础上， 本实施例中与实施例1不同的是： 交替重复步骤8和步。

27、骤9)各 3次， 得到基于钛合金基底的(COL/PEG)15CaP3矿化多层膜； 其他部分与实施例1完全一致。 0072 实验结果及讨论： 0073 结合图1可知， 以钛合金为基底的(COL/PEG)CaP矿化薄膜在(COL/PEG)多层膜为 15层时， 其调节CaP矿物的表面形貌为连续的多孔结构， 表明了有机多层膜对矿物形成的成 功调节。 0074 结合图2可知， (COL/PEG)多层膜是成功组装在基底上的， 且层数为15层时， 薄膜的 厚度约为236nm。 综上， 说明本发明制备得到的压电薄膜满足预期的目的， 通过对实施例2、 实施例3、 实施例4的样品进行相同的检测， 得到了与上述结果。

28、有一定规律的结果， 故不再进 行赘述。 0075 结合图3可知， (COL/PEG)多层膜与(COL/PEG)CaP矿化多层膜均可以对亚甲基蓝 进行吸附与释放； 但是， 相比于矿化后的(COL/PEG)CaP矿化多层膜， 未经矿化的(COL/PEG) 多层膜对亚甲基蓝的吸附量小， 释放的持续时间短， 说明了矿化后的连续多孔结构很好地 提高了多层膜对小分子的吸附量并延长了小分子释放的时间。 0076 结合图4可知， 碱性磷酸酶(ALP)的活性是评价细胞成骨分化早期的一个标志， 由 图4可以看出(COL/PEG)15CaP矿化多层膜在第14天达到了最高的ALP活性， 均大于其他样 品。 0077 。

29、结合图5可知， Runx2这种mRNA的表达， 是骨发育过程中重要的转录因子， 对成骨细 胞的分化、 软骨细胞成熟、 破骨细胞的分化及细胞外基质的分泌都有重要的调控作用， 由图 5可知(COL/PEG)15CaP矿化多层膜在培养细胞21天时， RunX2基因的表达最高， 并在7天和14 天的时间点， 均高于其他对照。 0078 结合图6可知， OCN为骨钙蛋白， 是形成骨骼的骨芽细胞所分泌的蛋白质， 由图6可 以看出(COL/PEG)15CaP矿化多层膜在培养细胞14天时， OCN基因的表达最高， 并在7天和21 天的时间点， 均高于其他对照。 0079 结合图7可知， OPN为骨桥蛋白， 成。

30、骨细胞、 骨细胞及破骨细胞均可分泌OPN， 其在骨 基质的矿化和吸收过程中有重要作用， 由图7可以看出， (COL/PEG)15CaP矿化多层膜在培养 细胞14天时， OPN基因的表达最高， 并在7天和21天的时间点， 均高于其他对照； 综上， (COL/ PEG)15CaP矿化多层膜表明了最佳的诱导细胞成骨分化的能力 0080 最后应说明的是： 显然， 上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例， 而并 非对实施方式的限定。 对于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可以做 出其它不同形式的变化或变动。 这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。 而由此所引 申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。 说明书 5/5 页 7 CN 110734646 A 7 图1 图2 说明书附图 1/4 页 8 CN 110734646 A 8 图3 图4 说明书附图 2/4 页 9 CN 110734646 A 9 图5 图6 说明书附图 3/4 页 10 CN 110734646 A 10 图7 说明书附图 4/4 页 11 CN 110734646 A 11 。