测定汞离子的比率型荧光探针及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911072939.8 (22)申请日 2019.11.05 (71)申请人 齐鲁工业大学 地址 250353 山东省济南市长清区大学路 3501号 (72)发明人 吕洪水孙海燕 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 张晓鹏 (51)Int.Cl. C07D 491/107(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称 一种测定汞离子的比率型荧光探针及其制 备方法和应用。

2、 (57)摘要 本公开属于荧光探针化合物技术领域， 具体 涉及一种测定汞离子的比率型荧光探针及其制 备方法和应用。 汞对人体健康具有严重的危害， 开发可靠稳定的的Hg2+检测方法对于环境的保 护及人类健康具有重要的意义。 本公开提供提供 了一种比率型近红外荧光探针化合物及其制备 方法和应用。 该探针具有螺环结构， 发射香豆素 结构的蓝色荧光， 在加入Hg2+后， 螺环打开， 共轭 体系增大， 蓝色荧光减弱并出现红色荧光， 可以 实现比率检测； 同时溶液由黄色变为绿色， 可以 对Hg2+的存在进行裸眼识别。 该探针对Hg2+具有 很高的选择性， 具有很好的抗干扰能力； 对水溶 液中Hg2+的检测。

3、限达到12.2nm。 该探针还成功用 于斑马鱼体内Hg2+的荧光成像， 显示出广阔的应 用前景。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 110734447 A 2020.01.31 CN 110734447 A 1.一种化合物， 其特征在于， 或所述化合物的异构体或溶剂化物， 所述化合物具有下式 (I)所示的结构： 2.权利要求1所述化合物的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法流程如下： 将化合物CB与水合肼在缩合剂作用下发生闭环反应得到CB-N2H4； 将化合物CB-N2H4与异 硫氰酸苯酯反应得到所述化合物CB-Hg。 3.如权利要求2所述化合物的制备方法， 其特征在于， 所述缩合。

4、剂为PyBOP。 4.如权利要求3所述化合物的制备方法， 其特征在于， 所述闭环反应的具体步骤如下： 将化合物CB和PyBOP溶于二氯甲烷中， 室温下搅拌0.81.2小时， 然后加入水合肼， 继 续在室温下反应2.53.5小时， 纯化得到化合物CB-N2H4。 5.如权利要求3所述化合物的制备方法， 其特征在于， 所述化合物CB： PyBOP： 水合肼的 摩尔比为0.81.2:0.81.2:4.85.2。 6.如权利要求2所述化合物的制备方法， 其特征在于， 所述加入水合肼温室下反应完成 后还包括干燥及纯化的步骤: 所述干燥采用无水硫酸钠进行干燥得到粗品。 7.如权利要求6所述化合物的制备方法。

5、， 其特征在于， 所述纯化采用石油醚-乙酸乙酯 混合溶剂洗涤所述粗品得到化合物CB-N2H4。 8.如权利要求2所述化合物的制备方法， 其特征在于， 所述化合物CB-N2H4与异硫氰酸苯 酯反应的具体步骤如下： 将化合物CB-N2H4和异硫氰酸苯酯溶于N,N-二甲基甲酰胺， 加热至6575反应1.8 2.2小时， 冷却后得到化合物CB-Hg。 9.权利要求1所述所述化合物作为Hg2+检测荧光探针化合物的应用， 或权利要求1所述 化合物在制备Hg2+检测试剂中的应用。 10.一种Hg2+的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法包括以下步骤： 向待测溶液中加入 CB-Hg的缓冲溶液， 检测495n。

6、m及720nm处的荧光强度。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110734447 A 2 一种测定汞离子的比率型荧光探针及其制备方法和应用 技术领域 0001 本公开属于荧光探针化合物技术领域， 具体涉及一种可测定汞离子的比率型近红 外荧光探针化合物及其制备方法和应用。 背景技术 0002 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解， 而不必然 被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技 术。 0003 汞是一种高毒性的重金属元素， 其中汞离子(Hg2+)是环境中无机汞存在的主要形 式， 并且可以通过微生物作用转化为毒性更大的有机汞。 汞可。

7、以通过食物链在人体内累积， 造成严重的神经损伤甚至死亡。 因此， 开发高灵敏度、 高选择性的Hg2+检测方法对环境保护 及人类健康具有重大意义。 0004 汞离子的传统检测方法包括原子吸收光谱、 电感耦合等离子体质谱和电感耦合等 离子体原子发射光谱等。 但这些检测方法都需要昂贵的仪器及繁琐的样品处理， 并且生物 相容性不好。 近年来发展的荧光分析法具有操作简单、 选择性好、 灵敏度高及生物相容性好 等优势。 目前报道的汞离子荧光探针大多是基于单个荧光峰强度变化进行检测的， 容易受 到温度、 探针浓度及仪器状态等多种因素影响， 无法进行准确的定量检测。 比率型荧光探针 通过两个荧光峰比值的变化进。

8、行检测， 可以有效消除这些干扰因素。 另外， 大多数荧光探针 由于激发和发射波长较短， 组织穿透能力差、 光毒性强且易受生物体自发荧光干扰， 而近红 外荧光探针能很好的克服以上问题。 因此， 将近红外发光和比率型检测相结合， 开发新型的 汞离子荧光探针对于环境和生物体内汞离子的定量检测及成像具有重要的意义。 发明内容 0005 本公开针对可用于汞离子检测的荧光探针化合物进行了研究， 得到了一种可用于 测定待测环境中汞离子的比率型近红外荧光探针化合物， 该化合物具有螺环结构， 发射蓝 色的荧光， 在加入Hg2+后， 原本的蓝色荧光减弱并出现红色荧光， 同时待测溶液由黄色变为 绿色， 可裸眼识别，。

9、 另外还可以应用于生物体内的Hg2+检测。 上述探针化合物对Hg2+具有很 好的选择性， 其检测效果不受溶液中其他离子的影响， 抗干扰能力强， 且检测限可以达到 12.2nM， 有望成为一种可靠的Hg2+检测手段。 0006 基于上述研究成果， 本公开提供以下技术方案： 0007 本公开第一方面， 提供一种化合物， 或所述化合物的异构体或溶剂化物， 所述化合 物具有下式(I)所示的结构： 说明书 1/5 页 3 CN 110734447 A 3 0008 0009 式(I)所示化合物简称化合物CB-Hg， 本公开文件中出现的 “化合物CB-Hg” 即指代 式(I)所示化合物。 0010 本公开。

10、第二方面， 提供第一方面所述化合物的制备方法， 所述制备方法流程如下： 0011 0012 将化合物CB与水合肼在缩合剂作用下发生闭环反应得到CB-N2H4； 将化合物CB- N2H4与异硫氰酸苯酯反应得到所述化合物CB-Hg。 0013 优选的， 所述缩合剂为PyBOP。 0014 进一步的， 所述闭环反应的具体步骤如下： 0015 将化合物CB和PyBOP溶于二氯甲烷中， 室温下搅拌0.81.2小时， 然后加入水合 肼， 继续在室温下反应2.53.5小时， 纯化得到化合物CB-N2H4。 0016 在一些具体的实施例中， 所述化合物CB： PyBOP： 水合肼的摩尔比为0.81.2:0.8。

11、 1.2:4.85.2. 0017 在一些具体的实施例中， 所述加入水合肼温室下反应完成后还包括干燥及纯化的 步骤: 0018 所述干燥采用无水硫酸钠进行干燥得到粗品； 0019 所述纯化采用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂洗涤所述粗品得到化合物CB-N2H4。 0020 优选的， 所述化合物CB-N2H4与异硫氰酸苯酯反应的具体步骤如下： 0021 将化合物CB-N2H4和异硫氰酸苯酯溶于N,N-二甲基甲酰胺， 加热至6575反应 1.82.2小时， 冷却后得到化合物CB-Hg。 0022 本公开第三方面， 提供第一方面所述化合物作为Hg2+荧光探针的应用， 或第一方面 所述化合物在制备Hg2+检测。

12、试剂中的应用。 0023 化合物CB-Hg具有螺环结构， 在溶液中呈现黄色， 由于具有香豆素结构呈现出蓝色 的荧光。 当溶液中存在Hg2+时， 化合物CB-Hg发生脱硫化反应生成1,3,4-噁二唑结构， 共轭体 系增大， 溶液从黄色变为绿色， 蓝色的荧光逐渐减弱并发出红色荧光， 上述变化过程裸眼即 可识别。 进一步的， 经本公开的研究证实， Hg2+的浓度与495nm及720nm处荧光强度的比率 (I720/I495)呈线性相关， 相关性达到0.9965， 检测限可到12.2nM。 另外， 本公开研究还发现将 上述探针化合物加入斑马鱼培养液中， 可在显微镜下观察到斑马鱼体内的荧光变化， 证明 。

13、说明书 2/5 页 4 CN 110734447 A 4 该探针化合物的荧光穿透性较强， 可满足生物体内检测的需求。 0024 本公开第四方面， 提供一种Hg2+的检测方法， 所述检测方法包括以下步骤： 向待测 溶液中加入CB-Hg的缓冲溶液， 检测495nm及720nm处的荧光强度。 0025 与现有技术相比， 本公开的有益效果是： 0026 1.本公开提供的比率型近红外荧光探针可以选择性地与Hg2+作用， 不受环境中其 他离子的干扰。 溶液由黄色变为绿色， 可以实现裸眼识别； 同时荧光由蓝色变为红色， 溶液 中Hg2+浓度与I720/I495具有良好的线性关系， 可实现比率测量。 0027。

14、 2.本公开通过斑马鱼实验证实了， 该探针不仅可以检测水溶液中的Hg2+， 而且还可 以用于斑马鱼活体中Hg2+的荧光成像， 在环境检测和生物科学中具有广阔的应用前景。 附图说明 0028 构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解， 本公开的示 意性实施例及其说明用于解释本公开， 并不构成对本公开的不当限定。 0029 图1为所述探针CB-Hg与Hg2+的反应机理。 0030 图2为实施例2中探针CB-Hg与Hg2+反应产物的高分辨质谱。 0031 图3为实施例3中探针CB-Hg(10 M)的HEPES缓冲溶液(EtOH:H2O1:1， v/v， pH 7.2)中加入不同金属。

15、离子时的紫外可见吸收光谱。 0032 图4为实施例4中探针CB-Hg(10 M)的HEPES缓冲溶液(EtOH:H2O1:1， v/v， pH 7.2)中加入不同金属离子时的荧光发射光谱。 0033 图5为实施例5中探针CB-Hg(10 M)的HEPES缓冲溶液(EtOH:H2O1:1， v/v， pH 7.2)中Hg2+与不同金属离子共存时I720/I495变化的柱状图。 118分别代表CB-Hg， Hg2+， Ag+， Al3+， Ba2+， Ca2+， Cd2+， Co2+， Cr3+， Cu2+， Fe2+， Fe3+， K+， Mg2+， Na+， Ni2+， Pb2+， Zn2+。。

16、 0034 图6为实施例6中探针CB-Hg(10 M)的Hg2+荧光滴定图。 0035 图7为实施例6中能够探针CB-Hg(10 M)对Hg2+响应的工作曲线。 0036 图8为实施例7中探针CB-Hg(10 M)在斑马鱼中的荧光成像图。 0037 其中： 斑马鱼在加入10 M探针的培养液中培养30分钟； 将斑马鱼洗涤3次后再用10 M Hg2+溶液培养30分钟的荧光成像图。 具体实施方式 0038 应该指出， 以下详细说明都是例示性的， 旨在对本公开提供进一步的说明。 除非另 有指明， 本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常 理解的相同含义。 0039 需要注。

17、意的是， 这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式， 而非意图限制根 据本公开的示例性实施方式。 如在这里所使用的， 除非上下文另外明确指出， 否则单数形式 也意图包括复数形式， 此外， 还应当理解的是， 当在本说明书中使用术语 “包含” 和/或 “包 括” 时， 其指明存在特征、 步骤、 操作、 器件、 组件和/或它们的组合。 0040 正如背景技术所介绍的， 近红外荧光探针具有良好的穿透能力， 应用于汞离子检 测效果良好， 本公开提供了一种结构新颖的近红外荧光探针化合物。 0041 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案， 以下将结合具 说明书 3/5 页 5 CN 11。

18、0734447 A 5 体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。 0042 以下实施例中出现的化合物及试剂均为市售产品， 本领域技术人员可自行购买。 起始化合物CB名称为4-(2-羧基苯基)-2-(7-二乙胺基香豆素)-7-二乙胺基苯并吡喃高 氯酸盐(cas 168206-21-1)， 购自sigma公司。 0043 实施例1 0044 式(I)所示荧光探针化合物(CB-Hg)的合成， 合成路线如下： 0045 0046 具体包括以下步骤： 0047 (1)将637mg(1mmol)CB和520mg(1mmol)PyBOP溶于10mL二氯甲烷， 室温搅拌1小时， 然后加入250mg(5mm。

19、ol)水合肼， 继续反应3小时。 将反应液水洗后加入无水硫酸钠干燥， 过 滤、 浓缩后得粗品。 将粗品用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(5:1)洗涤， 过滤后干燥得黄色固体 CB-N2H4 230mg， 产率42。 CB-N2H4的表征结果如下： 0048 核磁共振氢谱： 1H NMR(400MHz,CDCl3) 8.34(s,1H),7.89(d,J7.5Hz,1H),7.53 7.42(m,3H),7.24(s,1H),6.64(dd,J8.9,2.5Hz,1H),6.516.39(m,3H),6.33(dd,J 8.7,2.5Hz,1H),6.25(s,1H),3.80(s,2H),3.44(。

20、q,J7.2Hz,4H),3.36(q,J7.1Hz,4H), 1.23(t,J7.1Hz,6H),1.18(t,J7.0Hz,6H)。 0049 核磁共振碳谱： 13C NMR(101MHz,CDCl3) 156.30,153.63,151.42,150.77,147.53, 139.67,132.50,129.97,128.56,127.95,124.16,123.23,109.41,109.05,108.38,100.98, 97.94,96.86,64.56,45.05,44.49,12.77,12.62。 0050 高分辨质谱： M+H+calcd for C33H35N4O4： 5。

21、51.2653， found 551.2650。 0051 (2)将100mg(0.18mmol)CB-N2H4和36mg(0.27mmol)异硫氰酸苯酯溶于5mL DMF， 加 热至70反应2小时。 冷却后将反应液倒入50mL水中， 有固体析出。 抽滤， 干燥得到黄绿色固 体CB-Hg 80mg， 产率65。 CB-Hg的表征结果如下： 0052 核磁共振氢谱： 1H NMR(400MHz,CDCl3) 8.37(s,1H),7.98(d,J7.6Hz,1H),7.92 (s,1H),7.66(t,J7.5Hz,1H),7.60(s,1H),7.57(t,J7.5Hz,1H),7.527.3。

22、2(m,3H), 7.247.17(m,3H),7.12(t,J8.0Hz,1H),6.66(dd,J8.9,2.4Hz,1H),6.586.22(m,5H), 3.46(q,J7.1Hz,4H),3.37(q,J7.5Hz,4H),1.25(t,J8.0Hz,6H)， 1.20(t,J8.0Hz, 6H)。 0053 核磁共振碳谱： 13C NMR(101MHz,CDCl3) 182.38,151.08,139.85,133.54,129.56, 128.62,127.90,127.60,126.69,125.52,124.51,124.45,124.14,123.57,108.96,107。

23、.77, 98.28,96.27,76.82,76.68,76.50,76.18,44.43,43.94,12.05,11.97。 0054 高分辨质谱： M+H+calcd for C40H40N5O4S： 686.2796， found 686.2793。 0055 探针CB-Hg具有螺环结构， 发射香豆素基团的蓝色荧光。 与Hg2+反应后螺环打开， 共 轭体系增大， 发射红色荧光， 通过两个波长荧光强度的变化可以实现比率检测。 反应机理如 图1所示， 反应产物的高分辨质谱如图2所示。 说明书 4/5 页 6 CN 110734447 A 6 0056 实施例2 0057 本实施例中提供一。

24、种采用实施例2中化合物CB-Hg检测检测Hg2+的方法， 包括以下 步骤： 0058 (1)用乙醇体系配制1mM的CB-Hg储备液。 0059 (2)配制CB-Hg(10 M)的HEPES缓冲溶液(EtOH:H2O1:1， v/v， pH7.2)， 分别加入 5当量的Hg2+， Ag+， Al3+， Ba2+， Ca2+， Cd2+， Co2+， Cr3+， Cu2+， Fe2+， Fe3+， K+， Mg2+， Na+， Ni2+， Pb2+， Zn2+ 的水溶液。 通过紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱测试探针对各种金属离子的选择性和响 应能力。 加入Hg2+后， 紫外可见吸收光谱中429nm。

25、处的吸收峰减弱， 在670nm处出现新的强吸 收峰； 荧光发射光谱中495nm处发射峰减弱， 在720nm处出现新的发射峰， 吸收和发射光谱都 红移至近红外区， 根据495nm和720nm两个荧光发射峰强度比值的变化可以实现比率检测。 干扰实验显示共存金属离子不影响CB-Hg对Hg2+的荧光响应。 如图3， 4， 5所示。 0060 (3)配制CB-Hg的HEPES缓冲溶液(EtOH:H2O1:1， v/v， pH7.2)， 加入不同浓度的 Hg2+水溶液(050 M)进行荧光滴定实验。 随着Hg2+浓度的增加， 495nm处荧光强度逐渐减 弱， 720nm处荧光强度逐渐增强(图6)。 以Hg。

26、2+浓度为横坐标， 荧光强度比值I720/I495为纵坐标 绘制工作曲线， 在Hg2+浓度为2 M10 M范围内， Hg2+浓度与I720/I495线性相关， 相关系数为 0.9965(图7)。 根据线性方程计算出Hg2+的检测限为12.2nM。 0061 (4)如图8所示， 在斑马鱼培养液中加入10 M的CB-Hg， 培养30分钟后在激光共聚焦 显微镜下进行成像。 将用CB-Hg培养过的斑马鱼再用10 M Hg2+继续培养30分钟进行荧光成 像。 未加Hg2+之前， 斑马鱼中只有蓝色通道有荧光， 红色通道无荧光。 加入Hg2+之后， 红色通 道出现荧光。 表明探针CB-Hg可以用于生物体内H。

27、g2+的荧光成像。 0062 以上所述仅为本公开的优选实施例而已， 并不用于限制本公开， 对于本领域的技 术人员来说， 本公开可以有各种更改和变化。 凡在本公开的精神和原则之内， 所作的任何修 改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本公开的保护范围之内。 说明书 5/5 页 7 CN 110734447 A 7 图1 图2 说明书附图 1/4 页 8 CN 110734447 A 8 图3 图4 说明书附图 2/4 页 9 CN 110734447 A 9 图5 图6 说明书附图 3/4 页 10 CN 110734447 A 10 图7 图8 说明书附图 4/4 页 11 CN 110734447 A 11 。