刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911073997.2 (22)申请日 2019.11.06 (71)申请人 内蒙古农业大学 地址 010018 内蒙古自治区呼和浩特市赛 罕区昭乌达路306号 (72)发明人 张玉辉郭泽宇王杰盛显良 王李娟宋明瑞王博 (74)专利代理机构 天津耀达律师事务所 12223 代理人 侯力 (51)Int.Cl. A61K 47/61(2017.01) A61K 47/54(2017.01) A61K 31/4745(2006.01) A61K 49/00(2006.01) A。

2、61P 35/00(2006.01) C08G 81/00(2006.01) C08B 37/08(2006.01) (54)发明名称 一种刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组 装体及其制备方法 (57)摘要 一种刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组 装体及其制备方法。 组装体构筑单元为环糊精修 饰透明质酸和二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜 树碱前药， 通过环糊精和金刚烷之间的主客体相 互作用构筑形成以亲水的透明质酸为外壳、 疏水 的喜树碱为内核的组装体， 组装体形貌为球形纳 米粒子， 粒径为260-280nm， 对硫醇类还原剂具有 很好的刺激响应性。 本发明的优点是： 1)引入环 糊精修饰透明质酸， 增。

3、强了喜树碱的水溶性、 生 物相容性和靶向性； 2)二硫键作为药物释放刺激 响应的位点； 3)萘酰亚胺作为荧光响应的报告基 团， 监测药物释放； 4)该组装体构筑方法简单、 易 于实施且原料成本低， 使其在成像介导的癌症治 疗领域具有很好的应用前景。 权利要求书3页 说明书6页 附图5页 CN 110732027 A 2020.01.31 CN 110732027 A 1.一种刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体， 其构筑单元为环糊精修饰透明质酸 和二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药， 通过环糊精和金刚烷之间的主客体相互作用 构筑形成以亲水的透明质酸为外壳、 疏水的喜树碱为内核的组装体， 组装。

4、体形貌为球形的 纳米粒子， 粒径为260-280nm， 并对硫醇具有很好的药物释放响应性； 其中环糊精修饰透明 质酸分子式为(C14H21NO11)1175(C58H95N3O44)196， 平均每7个透明质酸单元修饰有一个环糊精单 元， 二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药的分子式为C44H52Cl2N4O7S2， 该组装体构筑单 元的结构如下： 2.一种权利要求1所述刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的制备方法， 其特征 在于包括以下步骤： 1)将分子量为550kDa的透明质酸钠溶于pH为7.2， 浓度1mM的磷酸缓冲溶液中， 再加入 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟。

5、基硫代琥珀酰亚胺， 搅拌反应30min， 得 到溶液A； 2)将6-去氧-6-乙二胺- -环糊精溶于pH为7.2， 浓度1mM的磷酸缓冲溶液中， 加入到步 骤1)得到的溶液A中， 在室温下搅拌24h， 然后装入截留分子量范围为8-14kDa的透析袋中用 过量的蒸馏水连续透析5天， 将所得溶液冻干制得环糊精修饰透明质酸(HACD)； 3)将4-硝基-N-2-氨乙基-1,8-萘酰亚胺溶于无水二氯甲烷中， 向溶液中加入三乙醇 胺， 在冰浴条件下搅拌30min得到混合液B； 将金刚烷甲酰氯溶于二氯甲烷中， 然后逐滴加入 到上述混合溶液B中， 反应液在室温下搅拌12h； 将反应液用水萃取， 收集有机相并。

6、用无水硫 酸钠干燥， 减压蒸馏除去溶剂得金刚烷修饰萘酰亚胺中间体1的粗品， 然后以正己烷与乙酸 乙酯的混合液为展开剂， 用200-300目硅胶柱进行分离制得金刚烷修饰萘酰亚胺中间体1； 4)将步骤3)制备的金刚烷修饰萘酰亚胺中间体1溶于乙醇中， 加入催化量的钯碳， 加入 水合肼， 反应液回流搅拌12h； 将反应液冷却到室温， 过滤除去钯碳， 收集滤液， 减压蒸馏除 去溶剂得金刚烷修饰萘酰亚胺中间体2的粗品， 然后以正己烷与乙酸乙酯的混合液为展开 剂， 用200-300目硅胶柱进行分离制得金刚烷修饰萘酰亚胺中间体2； 5)将步骤4)制备的金刚烷修饰萘酰亚胺中间体2、 N,N-二异丙基乙胺溶于无水。

7、甲苯中， 将溶液逐滴加入到溶有三光气的甲苯溶液中； 反应液在100mL反应瓶中回流反应3h， 将溶液 冷却到室温， 然后减压蒸馏除去溶剂； 将双(2-羟乙基)二硫醚溶于四氢呋喃溶液中得溶液 C， 将溶液C加入到上述反应瓶中， 反应液在室温搅拌12h； 减压蒸馏除去溶剂， 然后加入二氯 权利要求书 1/3 页 2 CN 110732027 A 2 甲烷和蒸馏水的混合液萃取； 然后收集有机相， 用无水硫酸钠干燥； 减压蒸馏除去溶剂， 以 正己烷与乙酸乙酯的混合液为展开剂， 用200-300目硅胶柱进行分离制得金刚烷修饰萘酰 亚胺中间体3； 6)将喜树碱和4-二甲氨基吡啶分散到无水二氯甲烷溶液中， 。

8、然后向混合液中加入三光 气得混合液D， 混合液D在室温下搅拌30min； 将步骤5)制备的金刚烷修饰萘酰亚胺中间体3 溶于5mL二氯甲烷溶液中， 逐滴加入到混合液D中， 然后将反应液在室温条件下搅拌12h， 所 得溶液用蒸馏水萃取， 收集有机溶剂， 用无水硫酸钠干燥， 减压蒸馏除去溶剂， 以乙酸乙酯 为展开剂， 用200-300目硅胶柱进行分离制得二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药； 7)将步骤2)制得的环糊精修饰透明质酸溶于蒸馏水得到溶液a， 将溶液a稀释20倍得到 溶液c， 将步骤6)得到的二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药溶于二甲基亚砜中得到 溶液b， 然后将溶液c和溶液b混合均匀，。

9、 制得刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体。 3.根据权利要求2所述刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的制备方法， 其特征 在于： 所述步骤1)中透明质酸钠与磷酸缓冲溶液的用量比为0.006mmol/L， 透明质酸钠、 1- 乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为0.00018: 0.875:0.875。 4.根据权利要求2所述刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的制备方法， 其特征 在于： 所述步骤2)中6-去氧-6-乙二胺- -环糊精与磷酸缓冲溶液的用量比为0.1mol/L， 6- 去氧-6-乙二胺- -环糊精与步骤1)中透明质酸钠、 1-乙基-(3。

10、-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐 酸盐、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为0.5:0.00018:0.875:0.875。 5.根据权利要求2所述刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的制备方法， 其特征 在于： 所述步骤3)中4-硝基-N-2-氨乙基-1 ,8-萘酰亚胺与无水二氯甲烷的用量比为 0.325mol/L， 三乙醇胺与4-硝基-N-2-氨乙基-1,8-萘酰亚胺的摩尔比为2:1， 金刚烷甲酰氯 与二氯甲烷的用量比为1mol/L， 4-硝基-N-2-氨乙基-1,8-萘酰亚胺与金刚烷甲酰氯的摩尔 比为6.5:10， 混合液中正己烷和乙酸乙酯的溶剂比为1:1。 6.根据权利要求2所述刺激响应的靶向。

11、聚多糖超分子诊疗组装体的制备方法， 其特征 在于： 所述步骤4)中金刚烷修饰萘酰亚胺中间体1与乙醇的用量比为0.1115mol/L， 钯碳与 金刚烷修饰萘酰亚胺中间体1的用量比为0.5:10， 金刚烷修饰萘酰亚胺中间体1与水合肼的 用量比为1.115mol/L， 该混合液中正己烷和乙酸乙酯的溶剂比为1:1。 7.根据权利要求2所述刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的制备方法， 其特征 在于： 所述步骤5)中金刚烷修饰萘酰亚胺中间体2与甲苯溶液的用量比为0.05mol/L， N,N- 二异丙基乙胺与甲苯溶液的用量比为0.15mol/L， 三光气与甲苯的用量比为0.1875mol/L， 金刚烷修。

12、饰萘酰亚胺中间体2与双(2-羟乙基)二硫醚的摩尔比为0.5:4， 双(2-羟乙基)二硫 醚与四氢呋喃的用量比为0.133mol/L， 二氯甲烷和蒸馏水的溶剂比为1:1， 该混合液中正己 烷和乙酸乙酯的溶剂比为1:1。 8.根据权利要求2所述刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的制备方法， 其特征 在于： 所述步骤6)中喜树碱和无水二氯甲烷的用量比为0.019mol/L， 4-二甲氨基吡啶和无 水二氯甲烷的用量比为0.06mol/L， 金刚烷修饰萘酰亚胺中间体3与二氯甲烷的用量比为 0.0528mol/L。 9.根据权利要求2所述刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的制备方法， 其特征 权利要求。

13、书 2/3 页 3 CN 110732027 A 3 在于： 所述步骤7)溶液a中环糊精修饰透明质酸与蒸馏水的用量比为0.01mmol/L， 溶液b中 二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药与二甲基亚砜的用量比为4mmol/L， 溶液a与溶液 c的浓度比为20:1， 溶液b与溶液c的体积比为1:40。 权利要求书 3/3 页 4 CN 110732027 A 4 一种刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及抗癌药物靶向诊疗传递技术领域， 特别是一种刺激响应的靶向聚多糖 超分子诊疗组装体及其制备方法和应用。 背景技术 0002 利用小分子抗癌药物进行常规化疗。

14、是临床癌症治疗的一种主要治疗方法， 但通常 存在特异性差、 毒性大、 水溶性差等缺点。 因此， 为了解决这些问题， 构筑靶向诊疗药物传递 体系是近几年来备受关注的增强基础化疗的一种有前景的方法。 靶向诊疗药物传递体系， 可以选择性地靶向癌细胞， 在内源性刺激下产生易于监测的信号， 同时传递治疗药物， 并监 测药物释放过程。 将细胞特异性的诊断和治疗功能结合到一个自组装的分子载体中， 在药 物治疗中具有如下几个优势： (1)靶向配体通过与肿瘤细胞表面过度表达的受体特异性结 合， 选择性的将治疗药物传递到肿瘤细胞， 提高了治疗效率， 降低了对正常组织的毒副作 用。 (2)通过引入荧光响应基团， 可。

15、以将药物传递过程进行可视化。 (3)水溶性差的抗癌药物 可以被结合到水溶性载体中， 从而提高药物的水溶性和生物相容性。 尽管一些基于介孔硅、 无机纳米粒子、 脂质体和囊泡的诊疗药物传递体系被开发出来， 并对癌细胞表现出有效的 治疗作用， 在构筑过程中仍然存在许多问题如载体水溶性和稳定性差、 合成和分离过程复 杂等。 发明内容 0003 本发明的目的是针对上述技术分析和存在问题， 提供一种刺激响应的靶向聚多糖 超分子诊疗组装体及其制备方法和应用， 该组装体以环糊精修饰透明质酸(HACD)和二硫键 连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药(AdaCPT)为构筑单元， 利用环糊精和金刚烷之间的主客 体相互作用。

16、构筑以亲水的透明质酸为外壳、 疏水的喜树碱为内核的组装体。 由于二硫键对 还原剂的响应性， 在硫醇作用下， 二硫键断开， 抗癌药喜树碱被释放出来， 同时萘酰亚胺的 荧光发生红移， 用于监测药物释放和细胞成像； 该组装体制备方法简单， 对癌细胞的选择性 和杀伤作用强， 毒副作用低， 适于放大合成和实际生产应用。 0004 本发明的技术方案： 0005 一种刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体， 其构筑单元为环糊精修饰透明质 酸和二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药， 通过环糊精和金刚烷之间的主客体相互作 用构筑形成以亲水的透明质酸为外壳、 疏水的喜树碱为内核的组装体， 组装体形貌为球形 的纳米粒。

17、子， 粒径为260-280nm， 并对硫醇类还原剂具有很好的药物释放响应性。 其中环糊 精修饰透明质酸分子式为(C14H21NO11)1175(C58H95N3O44)196， 平均每7个透明质酸单元修饰有一 个环糊精单元， 二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药的分子式为C44H52Cl2N4O7S2， 该组 装体构筑单元的结构如下： 说明书 1/6 页 5 CN 110732027 A 5 0006 0007 一种刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的制备方法， 包括以下步骤： 0008 1)将分子量为550kDa的透明质酸钠溶于pH为7.2， 浓度1mM的磷酸缓冲溶液中， 再 加入1-乙基。

18、-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺， 搅拌反应 30min， 得到溶液A； 0009 2)将6-去氧-6-乙二胺- -环糊精溶于pH为7.2， 浓度1mM的磷酸缓冲溶液中， 加入 到步骤1)得到的溶液A中， 在室温下搅拌24h， 然后装入截留分子量范围为8-14kDa的透析袋 中用过量的蒸馏水连续透析5天， 将所得溶液冻干制得环糊精修饰透明质酸(HACD)； 0010 3)将4-硝基-N-2-氨乙基-1,8-萘酰亚胺溶于无水二氯甲烷中， 向溶液中加入三乙 醇胺， 在冰浴条件下搅拌30min得到混合液B； 将金刚烷甲酰氯溶于二氯甲烷中， 然后逐滴加 入到上述混合溶液B中。

19、， 反应液在室温下搅拌12h； 将反应液用水萃取， 收集有机相并用无水 硫酸钠干燥， 减压蒸馏除去溶剂得金刚烷修饰萘酰亚胺中间体1的粗品， 然后以正己烷与乙 酸乙酯的混合液为展开剂， 用200-300目硅胶柱进行分离即可制得金刚烷修饰萘酰亚胺中 间体1； 0011 4)将步骤3)制备的金刚烷修饰萘酰亚胺中间体1溶于乙醇中， 加入催化量的钯碳， 加入水合肼， 反应液回流搅拌12h。 将反应液冷却到室温， 过滤除去钯碳， 收集滤液， 减压蒸 馏除去溶剂得金刚烷修饰萘酰亚胺中间体2的粗品， 然后以正己烷与乙酸乙酯的混合液为 展开剂， 用200-300目硅胶柱进行分离即可制得金刚烷修饰萘酰亚胺中间体2。

20、； 0012 5)将步骤4)制备的金刚烷修饰萘酰亚胺中间体2、 N,N-二异丙基乙胺溶于无水甲 苯中， 将溶液逐滴加入到溶有三光气的甲苯溶液中； 反应液在100mL反应瓶中回流反应3h， 将溶液冷却到室温， 然后减压蒸馏除去溶剂； 将双(2-羟乙基)二硫醚溶于四氢呋喃溶液中 得溶液C， 将溶液C加入到上述反应瓶中， 反应液在室温搅拌12h； 减压蒸馏除去溶剂， 然后加 入二氯甲烷和蒸馏水的混合液萃取； 然后收集有机相， 用无水硫酸钠干燥； 减压蒸馏除去溶 剂， 以正己烷与乙酸乙酯的混合液为展开剂， 用200-300目硅胶柱进行分离制得金刚烷修饰 萘酰亚胺中间体3； 0013 6)将喜树碱和4-。

21、二甲氨基吡啶分散到无水二氯甲烷溶液中， 然后向混合液中加入 三光气得混合液D， 混合液D在室温下搅拌30min。 将步骤5)制备的金刚烷修饰萘酰亚胺中间 体3溶于5mL二氯甲烷溶液中， 逐滴加入到混合液D中， 然后将反应液在室温条件下搅拌12h， 所得溶液用蒸馏水萃取， 收集有机溶剂， 用无水硫酸钠干燥， 减压蒸馏除去溶剂， 以乙酸乙 说明书 2/6 页 6 CN 110732027 A 6 酯为展开剂， 用200-300目硅胶柱进行分离即可制得二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱 前药； 0014 7)将步骤2)制得的环糊精修饰透明质酸溶于蒸馏水得到溶液a， 将步骤6)得到的 二硫键连接的金刚烷。

22、萘酰亚胺喜树碱前药溶于二甲基亚砜中得到溶液b， 然后取一定量的 溶液a稀释20倍得溶液c， 取一定量的溶液b在超声作用下缓慢滴加到一定量的溶液c中， 制 得刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体。 0015 所述步骤1)中透明质酸钠与磷酸缓冲溶液的用量比为0.006mmol/L， 透明质酸钠、 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为0.00018: 0.875:0.875。 0016 所述步骤2)中6-去氧-6-乙二胺- -环糊精与磷酸缓冲溶液的用量比为0.1mol/L， 6-去氧-6-乙二胺- -环糊精与步骤1)中透明质酸钠、 1-乙基-(3-二甲氨基。

23、丙基)碳二亚胺 盐酸盐、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为0.5:0.00018:0.875:0.875。 0017 所述步骤3)中4-硝基-N-2-氨乙基-1,8-萘酰亚胺与无水二氯甲烷的用量比为 0.325mol/L， 三乙醇胺与4-硝基-N-2-氨乙基-1,8-萘酰亚胺的摩尔比为2:1， 金刚烷甲酰氯 与二氯甲烷的用量比为1mol/L， 4-硝基-N-2-氨乙基-1,8-萘酰亚胺与金刚烷甲酰氯的摩尔 比为6.5:10， 混合液中正己烷和乙酸乙酯的溶剂比为1:1。 0018 所述步骤4)中金刚烷修饰萘酰亚胺中间体1与乙醇的用量比为0.1115mol/L， 钯碳 与金刚烷萘修饰酰亚胺中间体1。

24、的用量比为0.5:10， 金刚烷修饰萘酰亚胺中间体1与水合肼 的用量比为1.115mol/L， 该混合液中正己烷和乙酸乙酯的溶剂比为1:1。 0019 所述步骤5)中金刚烷修饰萘酰亚胺中间体2与甲苯溶液的用量比为0.05mol/L， N, N-二异丙基乙胺与甲苯溶液的用量比为0.15mol/L， 三光气与甲苯的用量比为0.1875mol/ L， 金刚烷修饰萘酰亚胺中间体2与双(2-羟乙基)二硫醚的摩尔比为0.5:4， 双(2-羟乙基)二 硫醚与四氢呋喃的用量比为0.133mol/L， 二氯甲烷和蒸馏水的溶剂比为1:1， 该混合液中正 己烷和乙酸乙酯的溶剂比为1:1。 0020 所述步骤6)中喜。

25、树碱和无水二氯甲烷的用量比为0.019mol/L， 4-二甲氨基吡啶和 无水二氯甲烷的用量比为0.06mol/L， 金刚烷修饰萘酰亚胺中间体3与二氯甲烷的用量比为 0.0528mol/L。 0021 所述步骤7)中溶液a中环糊精修饰透明质酸与蒸馏水的用量比为0.01mmol/L， 溶 液b中二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药与二甲基亚砜的用量比为4mmol/L， 溶液a 与溶液c的浓度比为20:1， 溶液b与溶液c的体积比为1:40。 0022 0023 本发明的优点和有益效果是： 0024 1)环糊精修饰透明质酸是一类生物相容性聚多糖， 结合了 -环糊精空腔包结各种 疏水分子， 透明质酸聚。

26、合物骨架选择性识别癌细胞表面过度表达的CD44受体两种优势； 通 过引入环糊精修饰透明质酸， 能够将喜树碱的水溶性、 生物相容性和靶向性同时增强； 2)为 了成像介导的靶向传递抗癌药喜树碱到癌细胞， 然后刺激响应性的释放， 引入二硫键作为 刺激响应的位点； 3)将萘酰亚胺作为荧光响应的报告基团， 监测药物释放过程， 当二硫键被 内源性的硫醇切断后， 荧光发射能够从蓝光红移到绿光； 4)该刺激响应的靶向聚多糖超分 子诊疗组装体构筑方法简单、 易于实施且原料成本低， 使其在成像介导的癌症治疗领域具 说明书 3/6 页 7 CN 110732027 A 7 有很好的应用前景。 附图说明 0025 图。

27、1为二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药合成路线示意图。 0026 图2为刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的构筑路线示意图。 0027 图3为刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的透射电子显微镜图。 0028 图4为激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的在DTT作用下的紫外光谱图。 0029 图5为激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的在DTT作用下随时间响应的荧光 光谱图。 0030 图6为HCT-116细胞的细胞毒性结果。 0031 图7为NIH3T3细胞的细胞毒性结果。 具体实施方式 0032 下面通过实例对本发明做进一步的说明： 0033 实施例1： 0034 一种刺激响应的靶向聚多糖。

28、超分子诊疗组装体， 其构筑单元为环糊精修饰透明质 酸和二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药， 通过环糊精和金刚烷之间的主客体相互作 用构筑形成以亲水的透明质酸为外壳、 疏水的喜树碱为内核的组装体， 组装体形貌为球形 的纳米粒子， 粒径为260-280nm， 并对硫醇类还原剂具有很好的药物释放响应性。 其中环糊 精修饰透明质酸分子式为(C14H21NO11)1175(C58H95N3O44)196， 平均每7个透明质酸单元修饰有一 个环糊精单元， 二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药的分子式为C44H52Cl2N4O7S2， 该组 装体构筑单元的结构如下： 0035 0036 本发明所述刺激响应。

29、的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的制备方法， 包括以下步 骤： 0037 1)将100mg(0.18 mol)分子量为550kDa的透明质酸钠溶于30mL pH为7.2， 浓度1mM 的磷酸缓冲溶液中， 再加入167.7mg(0.875mmol)1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸 盐和190mg(0.875mmol)N-羟基硫代琥珀酰亚胺， 搅拌反应30min， 得到溶液A； 0038 2)将588.5mg(0.5mmol)6-去氧-6-乙二胺- -环糊精溶于5mL pH为7.2， 浓度1mM的 说明书 4/6 页 8 CN 110732027 A 8 磷酸缓冲溶液中， 加入到步骤1)得到。

30、的溶液A中， 在室温下搅拌24h， 然后装入截留分子量范 围为8-14kDa的透析袋中用过量的蒸馏水连续透析5天， 将所得溶液冻干制得环糊精修饰透 明质酸(HACD)； 0039 检测显示制备的环糊精修饰透明质酸核磁表征如下： 1H NMR(400MHz,D2O,TMS, ppm): 2.0(s,3H),2.853.95(m,16H),4.464.51(m,2H),5.065.12(m,1H)。 环糊精修饰 透明质酸的修饰度根据透明质酸骨架上与酰胺基相连的甲基上的三个氢 2.0(s,3H)和 环糊精C-1位上的氢5.065.12(m,1H)的核磁积分面积比计算得到环糊精修饰透明质酸分 子式为(。

31、C14H21NO11)1175(C58H95N3O44)196， 平均每7个透明质酸单元修饰有一个环糊精单元。 0040 3)将1.85g(6.5mmol)4-硝基-N-2-氨乙基-1,8-萘酰亚胺溶于20mL无水二氯甲烷 中， 向溶液中加入1.3g(13mmol)三乙醇胺， 混合液在冰浴条件下搅拌30min得到混合液B； 将 2g(10mmol)金刚烷甲酰氯溶于10mL二氯甲烷中， 逐滴加入到上述混合溶液B中， 反应液在室 温下搅拌12h； 将反应液用60mL水萃取， 收集有机相并用无水硫酸钠干燥， 减压蒸馏除去溶 剂得金刚烷修饰萘酰亚胺中间体1的粗品， 然后以溶剂比为1:1的正己烷与乙酸乙。

32、酯的混合 液为展开剂， 用200-300目硅胶柱进行分离即可制得金刚烷修饰萘酰亚胺中间体1； 0041 4)将1g(2.23mmol)上述步骤3)制备的金刚烷修饰萘酰亚胺中间体1溶于20mL乙醇 中， 加入11.9mg(0.1115mmol)催化量的钯碳， 加入2mL(70-80)水合肼， 反应液回流搅拌 12h； 将反应液冷却到室温， 过滤除去钯碳， 收集滤液， 减压蒸馏除去溶剂得金刚烷修饰萘酰 亚胺中间体2的粗品， 然后以溶剂比为1:1的正己烷与乙酸乙酯的混合液为展开剂， 用200- 300目硅胶柱进行分离即可制得金刚烷修饰萘酰亚胺中间体2； 0042 5)将208mg(0.5mmol)上。

33、述步骤4)制备的金刚烷修饰萘酰亚胺中间体2、 194mg (1 .5mmol)N ,N-二异丙基乙胺溶于10ml无水甲苯中， 将溶液逐滴加入到溶有445mg (1.5mmol)三光气的8mL甲苯溶液中； 反应液在100mL反应瓶中回流反应3h， 将溶液冷却到室 温， 然后减压蒸馏除去溶剂； 将1.23g(4mmol)双(2-羟乙基)二硫醚溶于30mL四氢呋喃溶液 中得溶液C， 将溶液C加入到上述反应瓶中， 反应液在室温搅拌12h； 减压蒸馏除去溶剂， 然后 加入100mL二氯甲烷和100mL蒸馏水的混合液萃取； 然后收集有机相， 用无水硫酸钠干燥； 减 压蒸馏除去溶剂， 以溶剂比为1:1的正己。

34、烷与乙酸乙酯的混合液为展开剂， 用200-300目硅 胶柱进行分离即可制得金刚烷修饰萘酰亚胺中间体3； 0043 6)将100mg(0.287mmol)喜树碱和110mg(0.9mmol)4-二甲氨基吡啶分散到15mL无 水二氯甲烷溶液中， 然后向混合液中加入30mg(0.1mmol)三光气得混合液D， 反应液在室温 下搅拌30min； 将158mg(0.264mmol)上述步骤5)制备的金刚烷修饰萘酰亚胺中间体3溶于 5mL二氯甲烷溶液中， 逐滴加入到混合液D中， 然后将反应液在室温条件下搅拌12h， 所得溶 液用15mL蒸馏水萃取三次， 收集有机溶剂， 用无水硫酸钠干燥， 减压蒸馏除去溶剂。

35、， 以乙酸 乙酯为展开剂， 用200-300目硅胶柱进行分离即可制得二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树 碱前药； 0044 检测显示制备的二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药核磁表征如下： 1H NMR (400MHz,CDCl3,TMS,ppm): 0.98(t,3H),1.66(m,6H),1.81(s,6H),1.99(s,3H),2.13(d, 1H),2.19(t,1H),3.08(m,4H),3.68(d,2H),4.314.60(m,6H),5.035.21(d,4H),6.50(s, 1H),7.31(s,1H),7.66(d,2H),7.86(t,1H),7.97(d,1H),8。

36、.02(s,1H),8.19(d,2H),8.28(d, 1H),8.40(s,1H),8.56(t,2H)。 通过核磁表征得到二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前 说明书 5/6 页 9 CN 110732027 A 9 药的分子式为C44H52Cl2N4O7S2。 0045 7)将7.63mg上述步骤2)制得的环糊精修饰透明质酸溶于1mL蒸馏水得到溶液a， 将 1.94mg二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药溶于0.5mL二甲基亚砜中得到溶液b， 然后 取0.1ml溶液a稀释到2mL得溶液c， 取25 L溶液b在超声作用下缓慢滴加到975 L溶液c中， 制 得刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组。

37、装体。 0046 图1为二硫键连接的金刚烷萘酰亚胺喜树碱前药合成路线示意图。 0047 图2为刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的构筑路线示意图。 0048 图3为刺激响应的靶向聚多糖超分子诊疗组装体的透射电子显微镜图， 通过透射 电子显微镜表征可以得出该组装体通过环糊精和金刚烷之间的主客体相互作用构筑形成 以亲水的透明质酸为外壳、 疏水的喜树碱为内核的球形纳米粒子， 纳米粒子粒径为260- 280。 0049 实施例2： 0050 该组装体刺激响应性实验验证： 0051 选取二硫苏糖醇(DTT)作为模型还原剂。 对于紫外光谱和荧光光谱测定， 将上述制 备的组装体母液用pH 7.4， 浓度为。

38、0.01M的磷酸缓冲溶液稀释到5 M， 分别取3mL溶液加入到 7mL离心管中， 一支里面加入5mM的DTT， 将两支离心管在37水浴中孵化2h后， 用紫外光谱 仪检测(图4)和荧光光谱仪检测(图5)。 从图4可以看出在加入DTT孵化之后， 在400-500nm出 现一个新的吸收峰， 从荧光谱图5可以看出加入DTT孵化之后， 发射波长发生红移， 并且发射 强度增加， 这些结果表明我们构筑的聚多糖超分子诊疗组装体具有刺激响应性的药物释放 能力。 0052 实施例3： 0053 该组装体在癌症治疗领域中的应用 0054 本发明的具体应用效果如下： 0055 将HCT-116细胞(人结肠癌细胞)和N。

39、IH3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)铺在含有10胎 牛血清的DMEM培养基的96孔板中培养24小时， 分别加入环糊精修饰透明质酸(HACD)、 喜树 碱(CPT)、 组装体(HACD-AdaCPT)， 含有过量透明质酸的组装体(HACD-AdaCPT+HA)， 连续培养 48小时， 用MTT法测量各个实验条件下的细胞生存率。 0056 图6为HCT-116细胞的细胞毒性结果， 图中表明： 在48h范围内HACD-AdaCPT组装体 展现出了和CPT相似的对HCT-116肿瘤细胞的抑制作用， 当加入过量的透明质酸将细胞表面 的透明质酸受体饱和后， 组装体对HCT-116细胞的抑制作用减弱， 表明这种。

40、抑制作用是以细 胞受体为媒介的内吞作用将组装体带入到癌细胞中。 对于NIH3T3细胞， 如图7所示， CPT对其 具有很大的杀伤作用， 然而由于正常细胞表面透明质酸受体的表达远远小于癌细胞， 因此 HACD-AdaCPT组装体对正常细胞的毒性比单纯的药物CPT小很多， 从而实现在保护正常细胞 的情况下对癌细胞选择性杀伤的目的。 说明书 6/6 页 10 CN 110732027 A 10 图1 说明书附图 1/5 页 11 CN 110732027 A 11 图2 说明书附图 2/5 页 12 CN 110732027 A 12 图3 图4 说明书附图 3/5 页 13 CN 110732027 A 13 图5 图6 说明书附图 4/5 页 14 CN 110732027 A 14 图7 说明书附图 5/5 页 15 CN 110732027 A 15 。