-内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的特异性引物、检测方法及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910905955.4 (22)申请日 2019.09.24 (71)申请人 天津科技大学 地址 300457 天津市滨海新区经济技术开 发区第十三大街9号 (72)发明人 赵化冰任璐路福平董萌 刘东青师三媛杨柳杨晨 史婷婷王晓康李子翼 (74)专利代理机构 天津盛理知识产权代理有限 公司 12209 代理人 韩晓梅 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种-内酰胺类抗生素抗性基因bla。

2、TEM的 特异性引物、 检测方法及应用 (57)摘要 本发明涉及一种-内酰胺类抗生素抗性基 因blaTEM的特异性引物， 所述引物的核苷酸序列 为： F1： SEQIDNO:1； R1： SEQIDNO:2。 本引物具 有较高的特异性， 检测方法的检测过程无需依靠 标准曲线来测定核酸量， 而是可以直接读取DNA 分子的拷贝数， 大大简化操作步骤， 该方法结果 判读直观准确、 精确度高、 灵敏度高， 重复性好， 同时具有高效性， 最低可检测25.5个拷贝数。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图6页 CN 110747260 A 2020.02.04 CN 110747260 A 1.一。

3、种 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的特异性引物， 其特征在于： 所述引物的核 苷酸序列为： F1： SEQ ID NO:1； R1： SEQ ID NO:2。 2.如权利要求1所述的 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的特异性引物在检测 -内酰 胺类抗生素抗性基因blaTEM拷贝数方面中的应用。 3.利用如权利要求1所述的特异性引物快速检测 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM拷 贝数的方法， 其特征在于： 所述方法中使用到微滴数字PCR、 待测样品DNA和引物。 4.根据权利要求3所述的快速检测 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM拷贝数的方法， 其特征在于： 所述方法包括如下步骤：。

4、 样品的采集及处理； 提取样品DNA的提取； 微滴数字PCR： 使用微滴数字PCR进行PCR扩增， 分别以提取的待检样品DNA和ddH2O为 模板， 与ddPCR Supermix、 SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2和ddH2O充分混匀， 将反应混合液加入 微滴发生器， 进行微滴数字PCR， 检测荧光信号； 结果的判断： 有荧光信号的微滴为阳性， 无荧光信号的微滴为阴性， 记录每个样品里 阳性微滴的比例， 最后分析数据， 并以多种方式显示检测结果； 其中， 每次检测均设立阴性对照， 阴性对照为ddH2O。 5.根据权利要求4所述的快速检测 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM拷。

5、贝数的方法， 其特征在于： 所述步骤中使用Quantasoft分析软件记录每个样品里阳性微滴的比例， 使 用Quantasoft软件自动分析数据。 6.根据权利要求4或5所述的快速检测 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM拷贝数的方 法， 其特征在于： 所述步骤中微滴数字PCR的扩增反应体系总体积为20 L， 具体为： 10 L 2ddPCR Supermix， 0.2 M SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各0.8 L， DNA模板2 L， ddH2O余量； 反应程序为： 95， 5min； 95， 30s； 57， 30s； 40个循环； 72， 5s； 4， 5min； 90。

6、， 5min； 4， Hold， 升降温速率均为2/s。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110747260 A 2 一种 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的特异性引物、 检测 方法及应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 尤其是一种利用数字PCR检测 -内酰胺类抗生素抗性 基因blaTEM的特异性引物、 检测方法及应用。 背景技术 0002 抗生素的环境污染与生态毒性近年来引起了日益广泛的关注,水产养殖和畜牧业 抗生素长期滥用很可能诱导动物体内抗生素抗性基因,经排泄后将对养殖区域及其周边环 境造成潜在基因污染。 抗性基因还极有可能在环境中传播、 扩散对公共健康和食品、 饮用。

7、水 安全构成威胁。 因此， 准确快速地对抗生素抗性基因进行检测十分必要。 0003 -内酰胺类抗生素抗性基因作为在环境介质中被广泛检测到的基因类型， 目前主 要采用可培养微生物的方法研究耐药性， 但是这些方法对不可培养微生物的耐药基因无法 进行检测。 0004 目前， 关于抗生素抗性基因的检测主要依赖于实时荧光定量PCR技术。 虽然该方法 能实现对抗生素抗性基因的检测和定量， 但该方法依赖于标准曲线、 Ct值并且受扩增效率 等影响， 这样会导致测得的基因拷贝数与样品中的实际基因拷贝数存在偏差， 从而加大了 定量结果的偏差。 0005 微滴数字PCR(droplet digital PCR， d。

8、dPCR)是近年来发展起来的一种突破性的 核酸定量分析技术， 它的基本原理是利用微流控技术生成油包水乳化微滴颗粒， 以每个油 包水小颗粒作为反应器， 进行PCR扩增及荧光检测。 实现理论上的单分子扩增， 有PCR扩增荧 光信号记为1， 无荧光信号记为0， 反应结果采用泊松概率分布公式对核酸分子进行绝对定 量分析。 相比之下， ddPCR具有灵敏度高、 特异性强、 检测限度低、 无需标准品不依赖于标准 曲线、 采用终点PCR信号计数检测、 不依赖于Ct值等优点。 0006 通过检索， 尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。 发明内容 0007 本发明目的在于克服现有技术的不足之处， 提供一。

9、种 -内酰胺类抗生素抗性基因 blaTEM的特异性引物、 检测方法和应用， 该引物具有较高的特异性， 检测方法的检测过程无 需依靠标准曲线来测定核酸量， 而是可以直接读取DNA分子的拷贝数， 大大简化操作步骤， 该方法结果判读直观准确、 精确度高、 灵敏度高， 重复性好， 同时具有高效性， 最低可检测 25.5个拷贝数。 0008 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 0009 一种 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的特异性引物， 所述引物的核苷酸序列 为： 0010 F1： SEQ ID NO:1， 即5 -CAGGACCACTTCTGCGC-3 ； 0011 R1： SEQ ID 。

10、NO:2， 即5 -GTGAGGCACCTATCTCAGCG-3 。 说明书 1/4 页 3 CN 110747260 A 3 0012 如上所述的 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的特异性引物在检测 -内酰胺类 抗生素抗性基因blaTEM拷贝数方面中的应用。 0013 利用如上所述的特异性引物快速检测 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM拷贝数 的方法， 所述方法中使用到微滴数字PCR、 待测样品DNA和引物。 0014 而且， 所述方法包括如下步骤： 0015 样品的采集及处理； 0016 提取样品DNA的提取； 0017 微滴数字PCR： 使用微滴数字PCR进行PCR扩增， 分别以提。

11、取的待检样品DNA和 ddH2O为模板， 与ddPCR Supermix、 SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2和ddH2O充分混匀， 将反应混合 液加入微滴发生器， 进行微滴数字PCR， 检测荧光信号； 0018 结果的判断： 有荧光信号的微滴为阳性， 无荧光信号的微滴为阴性， 记录每个样 品里阳性微滴的比例， 最后分析数据， 并以多种方式显示检测结果； 0019 其中， 每次检测均设立阴性对照， 阴性对照为ddH2O。 0020 而且， 所述步骤中使用Quantasoft分析软件记录每个样品里阳性微滴的比例， 使用Quantasoft软件自动分析数据。 0021 而且， 所述步。

12、骤中微滴数字PCR的扩增反应体系总体积为20 L， 具体为： 0022 10 L 2ddPCR Supermix， 0.2 M SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各0.8 L， DNA模板2 L， ddH2O余量； 0023 反应程序为： 95， 5min； 95， 30s； 57， 30s； 40个循环； 72， 5s； 4， 5min； 90 ， 5min； 4， Hold。 升降温速率均为2/s。 0024 本发明取得的优点和积极效果为： 0025 1、 本发明快速检测 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM拷贝数的方法的检测过程 无需依靠标准曲线来测定核酸量， 而是可以直接读。

13、取DNA分子的拷贝数， 大大简化操作步 骤， 该方法结果判读直观准确、 精确度高、 灵敏度高， 重复性好， 同时具有高效性， 最低可检 测25.5个拷贝数。 0026 2、 本发明针对 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的特异性设计了一对引物， 具有 较高的特异性。 0027 3、 本发明快速检测 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM拷贝数的方法中运用了 ddPCR的方法， 该ddPCR方法具有技术可靠、 灵敏度高、 特异性强、 方便快捷等优点， 可实现对 blaTEM抗生素抗性记基因基因的绝对定量， 准确、 高效、 稳定。 附图说明 0028 图1为本发明中特异性分析结果图(注： 0为阴性。

14、对照； 1为环境样本； 2为待测样 本)； 0029 图2为本发明中阴性对照的样本分析结果图； 0030 图3为本发明中拷贝数为25.5的样本分析结果图； 0031 图4为本发明中拷贝数为45.5的样本分析结果图； 0032 图5为本发明中拷贝数为283的样本分析结果图； 0033 图6为本发明中拷贝数为1609的样本分析结果图； 说明书 2/4 页 4 CN 110747260 A 4 0034 图7为本发明中拷贝数为2010的样本分析结果图； 具体实施方式 0035 下面详细叙述本发明的实施例， 需要说明的是， 本实施例是叙述性的， 不是限定性 的， 不能以此限定本发明的保护范围。 003。

15、6 本发明中所使用的原料， 如无特殊说明， 均为常规的市售产品； 本发明中所使用的 方法， 如无特殊说明， 均为本领域的常规方法。 0037 一种 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的特异性引物， 所述引物的核苷酸序列 为： 0038 F1： SEQ ID NO:1， 即5 -CAGGACCACTTCTGCGC-3 ； 0039 R1： SEQ ID NO:2， 即5 -GTGAGGCACCTATCTCAGCG-3 。 0040 如上所述的 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的特异性引物在检测 -内酰胺类 抗生素抗性基因blaTEM拷贝数方面中的应用。 0041 利用如上所述的特异性引物快。

16、速检测 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM拷贝数 的方法， 所述方法中使用到微滴数字PCR、 待测样品DNA和引物。 0042 较优地， 所述方法包括如下步骤： 0043 样品的采集及处理； 0044 提取样品DNA的提取； 0045 微滴数字PCR： 使用微滴数字PCR进行PCR扩增， 分别以提取的待检样品DNA和阴 性对照为模板， 与ddPCR Supermix、 SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2和ddH2O充分混匀， 将反应混 合液加入微滴发生器， 进行微滴数字PCR， 检测荧光信号； 0046 结果的判断： 有荧光信号的微滴为阳性， 无荧光信号的微滴为阴性， 记录每个。

17、样 品里阳性微滴的比例， 最后分析数据， 并以多种方式显示检测结果； 0047 其中， 每次检测均设立阴性对照， 阴性对照为ddH2O。 0048 较优地， 所述步骤中使用Quantasoft分析软件(美国Bio-Rad公司)记录每个样 品里阳性微滴的比例， 使用Quantasoft软件自动分析数据。 0049 较优地， 所述步骤中微滴数字PCR的扩增反应体系总体积为20 L， 具体为： 0050 10 L 2ddPCR Supermix， 0.2 M SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各0.8 L， DNA模板2 L， ddH2O余量； 0051 反应程序为： 95， 5min；。

18、 95， 30s； 57， 30s； 40个循环； 72， 5s； 4， 5min； 90 ， 5min； 4， Hold。 升降温速率均为2/s 0052 具体地， 相关制备实施例可以如下： 0053 实施例1： 用于快速检测 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的引物设计 0054 从NCBI中下载blaTEM型 -内酰胺类抗生素抗性基因序列， 利用DNAMAN 8软件进行 序列比对， 选择保守区域， 并用Primer Premier5软件设计引物， 序列如下： 0055 F1： SEQ ID NO:1， 即5 -CAGGACCACTTCTGCGC-3 ； 0056 R1： SEQ ID 。

19、NO:2， 即5 -GTGAGGCACCTATCTCAGCG-3 。 0057 实施例2： 特异性分析 0058 分别以待测样品DNA(含blaTEM基因的质粒)和样本DNA(含blaTEM基因的混合基因 说明书 3/4 页 5 CN 110747260 A 5 样本)为模板， 用实施例1中设计的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行定性PCR扩增。 0059 定性PCR反应体系总体积为20 L， 包括模板3 L， SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各1.5 L， Es Taq10 L， ddH2O余量。 反应程序为： 95， 5min； 95， 30s； 57， 30。

20、s； 35个循环； 72， 5s； 72， 1min。 0060 扩增结束后， 取4 L进行琼脂糖凝胶电泳检测。 在凝胶成像仪下观察凝胶上条带的 情况， 以已知的PCR产物标准DNA分子条带大小为基准， 检测目的基因blaTEM的存在， 结果见 图1。 并将PCR产物进行测序， 测序结果与目的基因在NCBI中进行比对， 比对结果显示PCR产 物与blaTEM基因序列同源性为100。 0061 实施例3： 用于快速检测 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的ddPCR定量方法的建 立 0062 本发明用于快速检测 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM拷贝数的方法是一种基 于ddPCR的方法， 其。

21、中扩增反应体系总体积为20 L， 包括： 10 L 2ddPCR Supermix， 0.2 M SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各0.8 L， DNA模板2 L， ddH2O余量。 0063 反应程序为： 95， 5min； 95， 30s； 57， 30s； 40个循环； 72， 5s； 4， 5min； 90 ， 5min； 4， Hold。 升降温速率均为2/s。 0064 实施例4： 一种基于ddPCR技术对 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的检测方法 0065 (1)样品的采集及处理 0066 (2)提取样品DNA： 运用FastDNA Spin Kit for 。

22、Soil试剂盒提取 0067 (3)ddPCR： 利用上述检测 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的方法， 进行PCR扩 增， 分别以提取的待检样品DNA和阴性对照为模板， 与ddPCR Supermix、 SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2和ddH2O充分混匀至20 L， 将反应混合液加入微滴发生器， 进行微滴数字PCR， 检测 荧光信号。 0068 (4)结果的判断 ： 有荧光信号的微滴为阳性 ， 无荧光信号的微滴为阴性 ， Quantasoft分析软件(美国Bio-Rad公司)记录每个样品里阳性微滴的比例， 最后 Quantasoft软件自动分析数据， 并以多种方式显示检。

23、测结果。 0069 实施例5： 灵敏度检测 0070 采用QX200型微滴式数字PCR系统， 利用实施例1中的引物、 实施例3、 4中的方法对 待测样品DNA进行检测， 将待测样品DNA按照10倍浓度依次稀释， 取梯度为10-4-10-10的基因 序列进行检测， 每个梯度设置三个重复， 每个检测样本的微滴数均在10000以上。 0071 结果显示： 待测样品DNA模板在稀释梯度为10-4-10-10的情况下， ddPCR反应都能有 效地进行。 根据微滴的生成数和有效微滴数和重复性结果显示， 在DNA模板稀释梯度为10-5- 10-9范围内， ddPCR的检测结果最佳。 它们的拷贝数分别为201。

24、0copies/ L、 1609copies/ L、 283copies/ L、 45.5copies/ L、 25.5copies/ L。 结果如图2至图7所示。 0072 本发明是一种基于ddPCR技术定量检测 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM拷贝数 的方法， 其灵敏度高， 重复性好， 同时具有高效性。 0073 尽管为说明目的公开了本发明的实施例， 但是本领域的技术人员可以理解： 在不 脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内， 各种替换、 变化和修改都是可能的， 因此， 本 发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。 说明书 4/4 页 6 CN 110747260 A 6 序列表。

25、 天津科技大学 一种 -内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM的特异性引物、 检测方法及应用 2 SIPOSequenceListing 1.0 1 17 DNA 引物F1(Unknown) 1 caggaccact tctgcgc 17 2 20 DNA 引物R1(Unknown) 2 gtgaggcacc tatctcagcg 20 序列表 1/1 页 7 CN 110747260 A 7 图1 图2 说明书附图 1/6 页 8 CN 110747260 A 8 图3 说明书附图 2/6 页 9 CN 110747260 A 9 图4 说明书附图 3/6 页 10 CN 110747260 A 10 图5 说明书附图 4/6 页 11 CN 110747260 A 11 图6 说明书附图 5/6 页 12 CN 110747260 A 12 图7 说明书附图 6/6 页 13 CN 110747260 A 13 。