通过JNK/SAPK、ERK信号通路促进胃黏膜修复治疗胃溃疡的作用机制的研究方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911113608.4 (22)申请日 2019.11.14 (71)申请人 陕西中医药大学 地址 712046 陕西省咸阳市西咸新区西咸 大道 (72)发明人 林洁李智 (74)专利代理机构 西安研创天下知识产权代理 事务所(普通合伙) 61239 代理人 白志杰 (51)Int.Cl. A61K 36/8905(2006.01) A61K 49/00(2006.01) A61P 1/04(2006.01) (54)发明名称 通过JNK/SAPK、 ERK信号通路促进胃黏。

2、膜修 复治疗胃溃疡的作用机制的研究方法 (57)摘要 本发明公开了一种通过JNK/SAPK、 ERK信号 通路促进胃黏膜修复治疗胃溃疡的作用机制的 研究方法， 包括以下步骤： 步骤1.柴胡疏肝散的 制备； 步骤2.肝郁证及冰醋酸胃溃疡结合模型的 建立； 步骤3.免疫组化方法检测p38MAPK、 ERK蛋 白的表达； 步骤4.Westernblot法检测p38MAPK、 ERK蛋白的表达。 本发明观察疏肝解郁法对肝郁 证胃溃疡大鼠胃黏膜JNK/SAPK、 ERK的影响， 从分 子生物学上阐明疏肝解郁法治疗胃溃疡的内在 机制， 探索其对肝郁证胃溃疡大鼠胃黏膜损伤修 复的影响及其疗效的作用机制， 从。

3、而为治疗胃溃 疡的中医药治疗和新药开发奠定实验基础。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 110742954 A 2020.02.04 CN 110742954 A 1.一种通过JNK/SAPK、 ERK信号通路促进胃黏膜修复治疗胃溃疡的作用机制的研究方 法， 其特征在于， 包括以下步骤： 步骤1.柴胡疏肝散的制备； 步骤2.肝郁证及冰醋酸胃溃疡结合模型的建立； 步骤3.免疫组化方法检测p38MAPK、 ERK蛋白的表达； 步骤4.Westernblot法检测p38MAPK、 ERK蛋白的表达。 2.根据权利要求1所述的通过JNK/SAPK、 ERK信号通路促进胃黏膜修复治疗胃溃疡的作。

4、 用机制的研究方法， 其特征在于， 步骤1具体为： 按照以下配方准确称取各个原料药： 陈皮、 柴胡各6g， 川芎、 枳壳、 芍药各4.5g， 甘草1.5g， 香附4.5g， 然后充分混合制备得到柴胡疏肝 散， 以上原料药均购自华润三九医药股份有限公司。 3.根据权利要求1所述的通过JNK/SAPK、 ERK信号通路促进胃黏膜修复治疗胃溃疡的作 用机制的研究方法， 其特征在于， 步骤2.具体为： 60只SD大鼠随机分为正常对照组、 模型对 照组、 奥美拉唑组、 柴胡疏肝散组， 每组10只； 正常对照组无特殊处理正常饮食， 其余各组用 夹尾激怒法制作肝郁证大鼠模型； 每日四次8:00， 11:00。

5、， 14:00， 17:00用鼠夹夹大鼠尾巴远 端1/3处， 每次夹尾刺激持续30分钟， 如有破损用碘伏涂擦， 连续刺激7天后； 禁食24小时， 在 肝郁大鼠模型基础上运用改进后的Okabe冰醋酸方法制作肝郁大鼠胃溃疡模型。 4.根据权利要求3所述的通过JNK/SAPK、 ERK信号通路促进胃黏膜修复治疗胃溃疡的作 用机制的研究方法， 其特征在于， 所述柴胡疏肝散组， 所述柴胡疏肝散的浓度为2.5、 1.25、 0.75g/ml。 5.根据权利要求1所述的通过JNK/SAPK、 ERK信号通路促进胃黏膜修复治疗胃溃疡的作 用机制的研究方法， 其特征在于， 步骤3具体为： 采用各组小鼠胃组织切片。

6、， 脱蜡至水， 抗原 修复， 灭活内源性酶， 封闭， 滴加一抗： p38MAPK、 ERK， 滴加二抗， DAB显色， 复染、 脱水封片， 镜 检数据统计p38MAPK、 ERK表达及定位。 6.根据权利要求1所述的通过JNK/SAPK、 ERK信号通路促进胃黏膜修复治疗胃溃疡的作 用机制的研究方法， 其特征在于， 步骤4具体为： 称取冻存黏膜组织样本 0.1g， 按照碧云天蛋白抽提试剂盒说明书步骤操作， 加入裂解液在冰浴下3000r/min匀 浆， 充分裂解后， 离心收取上清液， 2， 2-联喹啉-4， 4-二羧酸二钠蛋白BCA法定量后， 加入 上样缓冲液并煮沸5min， 样本以Wester。

7、n blot法检测p38MAPK、 ERK蛋白的表达量变化。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110742954 A 2 通过JNK/SAPK、 ERK信号通路促进胃黏膜修复治疗胃溃疡的作 用机制的研究方法 技术领域 0001 本发明属于生物医学技术领域， 具体地说， 涉及一种通过JNK/SAPK、 ERK信号通路 促进胃黏膜修复治疗胃溃疡的作用机制的研究方法。 背景技术 0002 胃溃疡属于祖国医学的胃脘痛、 心痛或肝胃气痛的范畴。 此证发生的原因通常有 两类， 一是由于忧思恼怒， 肝气失调， 横逆犯胃引起； 二是由于脾不健运、 胃气不降而导致。 0003 2.1肝气郁滞与胃溃疡的临床与基。

8、础研究 0004 胃溃疡的病位在胃， 但与肝、 胆、 脾却有密切关系， 情志不调、 饮食不规律、 气血运 行不通畅和外邪感受等脏腑功能的失调， 都会引起该病的发生和恶化。 0005 现代研究也表明， 肝气郁滞与胃溃疡二者有高度的相关性。 如沈舒文等认为消化 性溃疡虽病位在胃， 但肝主疏泄， 故其发病与肝脾失调最为相关， 肝失疏泄则脾失健运， 胃 病及脾则碍运， 而脾胃病又会涉及肝， 导致气郁。 高金莲、 于彦芳、 杨金池、 申广义、 高于英以 及蔡悦等人认为肝郁是胃肠运动障碍的病理基础， 应以肝为中心进行辨证， 治疗上理胃必 调肝脾， 同时部分医家以五行生克制化理论为依据， 认为胃脘痛多与木气。

9、偏胜， 肝胃失和有 关， 且先贤有 “肝为起病之源， 胃为传病之所” 及 “治脾胃必先调肝气” 的古训， 因此均以疏肝 健脾为治疗的不二法门， 并取得良好的临床疗效。 0006 胃溃疡的一个重要病理学特征就是胃黏膜组织存在大量炎性细胞浸润及明显的 炎症反应。 炎性细胞通过释放氧自由基和促炎性细胞因子等多种炎性介质， 产生瀑布级联 效应， 在胃黏膜损伤的发生和发展中发挥了关键作用。 0007 细胞外信号调节激酶(ERK)、 c-Jun氨基末端调节激酶(JNK)/应激活化蛋白激酶 (SAPK)、 p38MAPK和ERK5是MAPK信号转导通路的4个主要家族成员。 MAPK是细胞内的一类丝 氨酸/苏。

10、氨酸蛋白激酶， 在哺乳动物细胞多种信号转导通路中起重要作用。 研究证实， MAPK 信号转导通路存在于大多数细胞内， 在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内， 并引起细 胞生物学反应(如细胞增殖、 分化、 转化及凋亡等)的过程中具有至关重要的作用。 ERK信号 通路通常被认为在生长因子介导的细胞增殖和分化过程中发挥重要作用， 并可作为阻止细 胞凋亡的存活因子。 JNK/SAPK及p38MAPK为应激激活的蛋白激酶， 研究表明， 这两条通路的 激活参与多种应激所介导的细胞凋亡。 由此可见， MAPK信号传导通路的重要作用就是在胞 外环境发生变化时， 调节细胞反应， ERK通路主要参与细胞的增生和分。

11、化， JNK/SAPK通路和 p38MAPK通路则主要参与细胞的应激反应和凋亡。 0008 ERK通路可以在受体酪氨酸激酶、 Ca2+、 蛋白激酶C的介导下被激活。 激活过程首先 是Ras的活化， 然后活化的Ras与丝/苏氨酸蛋白激酶Raf-1的氨基端结合， 激活Raf-1， 进而 激活MEK， 最终导致ERK1/2的激活。 活化的ERK1/2移位至细胞核， 促进多种核内转录因子的 磷酸化， 如e-Jun、 e-Fos和ELK-1等， 从而调控基因表达， 促进细胞的增殖与分化。 ERK通路活 性增高不仅可促进胃黏膜细胞的增殖， 而且该通路的激活对于胃溃疡的愈合也具有重要意 说明书 1/5 页 。

12、3 CN 110742954 A 3 义。 Pai等研究发现， 在大鼠胃溃疡的愈合过程中， ERK 1/2活性显著增强， 阻断这一通路可 以明显延缓胃溃疡的愈合过程。 0009 同时， 已经有许多研究证实， 不同的细胞外刺激信号,如生长因子、 细胞因子、 环境 应激均可致JNK/SAPK激活， 使其从细胞质中移位到细胞核， 与其下游核转录因子NF-kB, ATF2或c-Jun的氨基末端区域结合， 使转录因子的活性区域发生磷酸化， 促进相关基因表 达， 提高核转录能力， 介导细胞生长、 基因转化、 细胞分化和细胞凋亡等多种生物学效应， 激 活的JNK/SAPK能够通过磷酸化转录因子和其他目的因子。

13、来调节基因转录， 启动凋亡程序诱 发细胞凋亡， 导致细胞损伤。 0010 综上所述， 胃溃疡的发生、 发展与JNK/SAPK、 ERK的调节密切相关。 所以， 我们的工 作假说是： 在肝郁证胃溃疡模型的作用下， 使胃黏膜JNK/SAPK上调、 ERK下调； 而疏肝解郁方 剂可能通过调节JNK/SAPK、 ERK水平使之恢复正常而治疗胃溃疡。 0011 现已知通过疏肝解郁法对胃溃疡大鼠血浆、 胃、 蓝斑中胃泌素、 生长抑素的干预作 用， 提示柴胡疏肝散可能通过神经内分泌网络调节胃溃疡大鼠中枢及外周水平的脑肠肽激 素水平， 恢复动态平衡， 从而修复溃疡， 但其对胃溃疡其他病理环节包括JNK/SAP。

14、K、 ERK改变 有何作用尚不可知。 发明内容 0012 本发明的目的在于提出了一种通过JNK/SAPK、 ERK信号通路促进胃黏膜修复治疗 胃溃疡的作用机制的研究方法。 该方法传统疏肝解郁法治疗肝气郁结的基础上， 运用夹尾 激怒结合冰醋酸方法制作肝郁证胃溃疡大鼠模型， 研究疏肝解郁法对其胃黏膜JNK/SAPK、 ERK的影响， 从分子生物学上阐明疏肝解郁法治疗胃溃疡的内在机制。 从而为胃溃疡的中医 药治疗和新药研究提供理论依据。 0013 其技术方案如下： 0014 一种通过JNK/SAPK、 ERK信号通路促进胃黏膜修复治疗胃溃疡的作用机制的研究 方法， 包括以下步骤： 0015 步骤1.。

15、柴胡疏肝散的制备； 0016 步骤2.肝郁证及冰醋酸胃溃疡结合模型的建立； 0017 步骤3.免疫组化方法检测p38MAPK、 ERK蛋白的表达； 0018 步骤4.Westernblot法检测p38MAPK、 ERK蛋白的表达。 0019 进一步， 步骤1具体为： 按照以下配方准确称取各个原料药： 陈皮(醋炒)、 柴胡各 6g， 川芎、 枳壳(麸炒)、 芍药各4.5g， 甘草(炙)1.5g， 香附4.5g， 然后充分混合制备得到柴胡 疏肝散， 以上原料药均购自华润三九医药股份有限公司。 0020 进一步， 步骤2.具体为： 60只SD大鼠随机分为正常对照组、 模型对照组、 奥美拉唑 组、 柴。

16、胡疏肝散组， 每组10只。 正常对照组无特殊处理正常饮食， 其余各组用夹尾激怒法制 作肝郁证大鼠模型。 每日四次8:00， 11:00， 14:00， 17:00用鼠夹夹大鼠尾巴远端1/3处， 每次 夹尾刺激持续30分钟， 如有破损用碘伏涂擦， 连续刺激7天后； 禁食24小时， 在肝郁大鼠模型 基础上运用改进后的Okabe冰醋酸方法制作肝郁大鼠胃溃疡模型。 0021 再进一步， 所述柴胡疏肝散组， 所述柴胡疏肝散的浓度为2.5、 1.25、 0.75g/ml。 0022 进一步， 步骤3具体为： 采用各组小鼠胃组织切片， 脱蜡至水， 抗原修复， 灭活内源 说明书 2/5 页 4 CN 1107。

17、42954 A 4 性酶， 封闭， 滴加一抗： p38MAPK、 ERK， 滴加二抗， DAB显色， 复染、 脱水封片， 镜检数据统计 p38MAPK、 ERK表达及定位。 0023 进一步， 步骤4具体为： 称取冻存黏膜组织样本约0.1g， 按照碧云天蛋白抽提试剂 盒说明书步骤操作， 加入裂解液在冰浴下3000r/min匀浆， 充分裂解后， 离心收取上清液， 2， 2-联喹啉-4， 4-二羧酸二钠(bicinchoninic acid hydratedisodium salt， BCA)蛋白BCA 法定量后， 加入上样缓冲液并煮沸5min， 样本以Western blot法检测p38MAPK。

18、、 ERK蛋白的表 达量变化。 0024 本发明的有益效果为： 0025 JNK/SAPK、 ERK形成的信号传导通路在胃溃疡的发生进展中可能起了重要的作用。 本发明在传统疏肝解郁法治疗肝气郁结的基础上， 改进模型制作， 运用夹尾激怒结合冰醋 酸方法制作肝郁证胃溃疡大鼠模型， 在疾病模型的制作基础上结合证的改变， 观察疏肝解 郁法对肝郁证胃溃疡大鼠胃黏膜JNK/SAPK、 ERK的影响， 从分子生物学上阐明疏肝解郁法治 疗胃溃疡的内在机制， 探索其对肝郁证胃溃疡大鼠胃黏膜损伤修复的影响及其疗效的作用 机制， 从而为治疗胃溃疡的中医药治疗和新药开发奠定实验基础。 附图说明 0026 图1.柴胡疏。

19、肝散对肝郁证胃溃疡大鼠溃疡的治疗作用； 其中， 图1a为假手术组胃 组织； 0027 图1b为模型组胃组织溃疡面； 0028 图1C为奥美拉唑组胃组织溃疡面； 0029 图1d为柴胡疏肝散大剂量组胃组织溃疡面； 0030 图1e为柴胡疏肝散中剂量组胃组织溃疡面； 0031 图1f为柴胡疏肝散小剂量组胃组织溃疡面； 0032 图2 HE观察胃粘膜病理变化； 其中， 图2a为假手术组胃组织HE染色细胞改变情况； 0033 图2b为模型组胃组织HE染色细胞改变情况； 0034 图2C为奥美拉唑组胃组织HE染色细胞改变情况； 0035 图2d为柴胡疏肝散大剂量组胃组织HE染色细胞改变情况； 0036 。

20、图2e为柴胡疏肝散中剂量组胃组织HE染色细胞改变情况； 0037 图2f为柴胡疏肝散小剂量组胃组织HE染色细胞改变情况； 0038 图3免疫组化检测胃粘膜中p-38MAPK、 ERK的表达(400X)， *P0.01VS模型组， *P 0.05VS模型组； #P0.01VS正常组， #P0.05VS正常组； 其中， 图3a为Westernblot检测假手 术组、 模型组、 奥美拉唑组及柴胡疏肝散大、 中、 小剂量组胃粘膜胃粘膜中p38MAPK、 ERK蛋白 表达； 0039 图3b为Westernblot检测假手术组、 模型组、 奥美拉唑组及柴胡疏肝散大、 中、 小剂 量组胃粘膜胃粘膜组中ER。

21、K/ -actin蛋白表达； 0040 图3c为Westernblot检测假手术组、 模型组、 奥美拉唑组及柴胡疏肝散大、 中、 小剂 量组胃粘膜中p-38MAPK/ -actin蛋白表达； 0041 图4 Western blot检测胃粘膜中p-38MAPK、 ERK的表达， *P0.01VS模型组， *P 0.05VS模型组； #P0.01VS正常组， #P0.05VS正常组； 其中， 图4a为免疫组化检测假手术 说明书 3/5 页 5 CN 110742954 A 5 组、 模型组、 奥美拉唑组及柴胡疏肝散大、 中、 小剂量组胃粘膜中p-38MAPK、 ERK的表达； 0042 图4b为。

22、免疫组化检测假手术组、 模型组、 奥美拉唑组及柴胡疏肝散大、 中、 小剂量 组胃粘膜中ERK IOD/Area的表达； 0043 图4c为为免疫组化检测假手术组、 模型组、 奥美拉唑组及柴胡疏肝散大、 中、 小剂 量组胃粘膜中p-38MAPK IOD/Area的表达； 0044 图5为本发明通过JNK/SAPK、 ERK信号通路促进胃黏膜修复治疗胃溃疡的作用机制 的研究方法的流程示意图。 具体实施方式 0045 下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。 0046 1.柴胡疏肝散对肝郁脾虚证胃溃疡大鼠一般体征的影响给予乙酸造模后造模大 鼠于第2、 3天开始泄泻， 多为便溏。

23、； 第6、 7天， 各组大鼠逐渐出现萎靡倦怠、 眯眼、 少动、 被毛 散乱无光泽， 受刺激反应更加迟钝， 行走匍匐状， 食量减少等脾虚证的表现； 10天以后， 出现 明显成群蜷缩， 扎堆， 拱背， 精神倦怠， 嗜卧， 懒动， 四肢无力， 反应迟钝， 拉尾排便次数增多， 同时出现毛发枯槁， 甚至稀少； 动物明显消瘦， 体重明显减轻。 柴胡疏肝散大、 中剂量给药组 对胃溃疡大鼠一般体征均有明显的改善作用。 柴胡疏肝散对胃溃疡大鼠体重的影响结果见 表1。 研究结果表明， 与模型组比较， 柴胡疏肝散大、 中剂量组能抑制胃溃疡引起的动物体重 下降(P0.05或P0.01)。 0047 表1 柴胡疏肝散对。

24、肝郁脾虚证胃溃疡大鼠体重的影响 0048 0049 *P0.01 VS模型组， *P0.05 VS模型组； #P0.01 VS正常组， #P0.05 VS正常 组； &P0.01 VS阳性对照组， &P0.05 VS阳性对照组 0050 2.柴胡疏肝散对肝郁证胃溃疡大鼠溃疡指数的影响柴胡疏肝散对胃溃疡大鼠溃 疡指数的影响结果见表2， 图1。 实验结果显示， 柴胡疏肝散大、 中剂量给药组能明显减轻胃 溃疡大鼠的溃疡指数。 柴胡疏肝散低剂量组改善不明显， 中剂量组(P0.01)、 大剂量组(P 0.01)溃疡指数与模型组比较显著性下降。 0051 表2 柴胡疏肝散对肝郁证胃溃疡大鼠溃疡指数 005。

25、2 说明书 4/5 页 6 CN 110742954 A 6 0053 0054 *P0.01 VS模型组， *P0.05 VS模型组； #P0.01 VS正常组， #P0.05 VS正常 组； &P0.01 VS阳性对照组， &P0.05 VS阳性对照组 0055 3.柴胡疏肝散对肝郁证胃溃疡大鼠胃病理损伤程度的影响 0056 胃组织做HE病理检测， HE光镜下病变主要表现为黏膜上皮细胞变性、 坏死， 固有层 充血， 皮胃固有层充血。 柴胡疏肝散对胃溃疡大鼠胃病理损伤程度的影响结果见图2。 实验 结果显示， 柴胡疏肝散大、 中剂量给药组能明显减轻胃溃疡大鼠的胃黏膜损伤程度。 柴胡疏 肝散中剂。

26、量组、 高剂量组剂量组胃病理评分与模型组比较显著性下降(P0.01)， 并具有明 显的量效关系。 0057 4.柴胡疏肝散对肝郁证胃溃疡大鼠胃黏膜细胞p38MAPK、 ERK蛋白表达水平的影响 0058 Western blot结果显示： 模型对照组大鼠胃粘膜组织中p38MAPK、 ERK蛋白表达明 显升高， 与正常组比较， 差异有统计学意义(P0.02)， 柴胡疏肝散大、 中剂量组p38MAPK、 ERK蛋白表达较模型组明显降低， 差异有统计学意义(P0.05)， 奥美拉唑组p38MAPK、 ERK蛋 白表达也降低， 与柴胡疏肝散大剂量组比较有统计学意义(P0.05)， 见图3。 0059 。

27、免疫组化结果显示： 胃粘膜组织中p38MAPK、 ERK的阳性细胞多为棕黄色或褐色表 达于细胞核， 部分呈棕黄色或褐色细小颗粒见于细胞浆。 模型组大鼠胃粘膜组织p38MAPK、 ERK表达较正常对照组明显增多， 其差异有统计学意义(P0.05)奥美拉唑组和柴胡疏肝散 组大、 中剂量组大鼠胃粘膜组织p38MAPK、 ERK的表达与模型对照组比较具有显著性差异(P 0.05)， 同时柴胡疏肝散大剂量组组大鼠p38MAPK、 ERK的表达与奥美拉唑组比较差异亦有统 计学意义(P0.05)。 见图4。 0060 以上所述， 仅为本发明较佳的具体实施方式， 本发明的保护范围不限于此， 任何熟 悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内， 可显而易见地得到的技术方案的简 单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。 说明书 5/5 页 7 CN 110742954 A 7 图1 说明书附图 1/3 页 8 CN 110742954 A 8 图2 图3 说明书附图 2/3 页 9 CN 110742954 A 9 图4 图5 说明书附图 3/3 页 10 CN 110742954 A 10 。