基因OsBBX14在提高水稻白叶枯抗性中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911233041.4 (22)申请日 2019.12.05 (71)申请人 山东省水稻研究所 地址 250100 山东省济南市历城区桑园路2 号 (72)发明人 白波谢先芝郑崇珂 (74)专利代理机构 济南诚智商标专利事务所有 限公司 37105 代理人 韩百翠 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/46(2018.01) (54)发明名称 基因OsBBX。

2、14在提高水稻白叶枯抗性中的应 用 (57)摘要 本发明公开了基因OsBBX14在提高水稻白叶 枯抗性中的应用。 本发明通过PCR方法， 扩增出水 稻品种日本晴的OsBBX14基因的全长编码区， 正 向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上； 再 进行遗传转化至水稻中， 提高OsBBX14基因的表 达， 得到OsBBX14基因表达增强的转基因水稻植 株。 在转基因的T3代植株中发现， 阳性转基因水 稻植株的白叶枯抗性显著高于野生型。 权利要求书1页 说明书9页 序列表5页 附图2页 CN 110747203 A 2020.02.04 CN 110747203 A 1.基因OsBBX。

3、14在提高水稻白叶枯抗性中的应用， 所述基因OsBBX14的核苷酸序列如 SEQ ID NO： 1所示。 2.基因OsBBX14在提高水稻白叶枯抗性中的应用方法， 其特征是， 首先通过PCR方法， 扩 增出水稻品种日本晴的OsBBX14基因的全长编码区， 然后正向连接在植物表达载体 pCAMBIA1390-ubi上； 再进行遗传转化至水稻中， 提高OsBBX14基因的表达， 得到OsBBX14基 因表达增强的转基因水稻植株， 所述基因OsBBX14的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110747203 A 2 基因OsBBX14在提高水稻白叶枯抗性中。

4、的应用 技术领域 0001 本发明涉及植物基因工程技术领域， 具体涉及通过提高OsBBX14基因的表达水平 来提高水稻白叶枯抗性。 背景技术 0002 水稻(Oryza sativa L.)作为最重要的粮食作物之一， 为全球半数以上的人口提 供食物来源， 对于粮食安全至关重要(Tabien et al.,1996)。 而由黄单胞杆菌水稻致病变 种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae， Xoo)引起的水稻白叶枯病(Bacterial blight)已经 成为水稻生产中重要的病害之一， 常常引起水稻减产。 因此， 采用合适的方法对水稻白叶枯 病进行有效防治有着重要的意义。 0。

5、003 水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae， Xoo)所引起的系统性病害， 属维管束病害， 为水稻生产上的三大病害之一。 病原 菌Xoo主要通过气孔， 水孔或伤口侵染水稻叶片， 继而在维管束中大量繁殖， 分泌产生大量 的胞外多糖使维管束堵塞， 导致叶片组织失水产生灰褐色或白色病斑。 随着病原菌在维管 束中分布， 整个植株被病原菌侵染变成灰白色， 进而萎蔫干枯甚至死亡， 严重影响了水稻植 株的光合作用， 造成水稻减产(王春连， 2006)。 如果水稻在分蘖期遭受病害则会造成严重减 产甚至绝收(Reddy et al.,19。

6、89)。 对于该病害的防治主要包括化学防治和种植抗病品种。 由于是维管束病害， 所以化学防治很难取得良好的防治效果而且对环境会产生危害； 而种 植抗病品种不但能够有效地防止病害的发生， 而且节约防治成本不危害环境， 被认为是最 经济有效的方法(Suh et al.,2013)。 因此培育抗白叶枯病品种已经成为现代水稻育种的 主要目标之一， 相应的培育和推广抗白叶枯病品种成为各国育种家的首要任务。 然而传统 的育种方法存在着育种周期长， 工作量大和选择效率低等问题。 但病原菌的致病性变异， 新 致病小种的出现和扩散的速度却快得多。 因此在进行抗病基因鉴定， 定位和克隆的基础上， 采用分子标记选择。

7、辅助育种和基因工程育种能够大大的提高工作效率缩短育种年限。 0004 对水稻抗白叶枯病基因的鉴定研究始于上世纪五十年代(章琦， 2005)。 截至2014 年3月， 国内外已报道的水稻抗白叶枯病基因有38个， 编号已排至Xa38， 其中Xa3和Xa26为同 一个基因(Xiang et al.,2006)， 同时还有4对基因Xa25/xa25， Xa26/xa26， Xa32/xa32和 Xa33/xa33为不同的水稻材料中鉴定的不同的抗白叶枯病基因， 而非等位基因。 在已经鉴定 的38个抗白叶枯病基因中隐性基因12个： xa5， xa8， xa13， xa15， xa19， xa20， xa2。

8、4， xa26(t)， xa28(t)， xa32(t)， xa33(t)和xa34(t)(Chen et al.,2011)， 其余为显性基因。 在38个抗白 叶枯病基因中被定位的有30个， 有9个基因已经被成功克隆， 分别为： 显性基因Xa1 (Yoshimura et al.,1998)， Xa3/Xa26(Sun et al.,2004； Xiang et al.,2006)， Xa10(Tian et al.,2014)， Xa21(Song et al.,1995)， Xa23(王春连， 2006)， Xa27(Gu et al.,2005)和 隐性基因xa5(Jiang et a。

9、l.,2006)， xa13(Chu et al.,2006a)， xa25(Liu et al.,2011)。 0005 抗白叶枯病基因的克隆为转基因育种提供了材料基础， 而转基因技术的成熟为转 基因育种提供了技术支持。 通过转基因的方法能够快速的获得纯合的含有抗病基因的中间 说明书 1/9 页 3 CN 110747203 A 3 材料， 大大缩短了育种年限， 提高育种效率。 目前主要应用于转基因育种的抗白叶枯病基因 为Xa21基因， 已经通过基因枪、 农杆菌介导等的方法将该基因转化到多个水稻品种中。 黄大 年等(1997)以基因枪法将Xa21基因转入 “中百4号” 和 “京引119” ，。

10、 获得6个转基因株。 经白叶 枯病抗性鉴定， 其中一个转基因植株 “京引119-B” 抗病性有明显改善， 其病斑长度与对照差 异达显著水平(黄大年等， 1997)。 Gao等(2011)用农杆菌介导的方法将Xa21转化到水稻D62B 中， 收获的T2代和D62A进行回交， 获得的后代对白叶枯病抗性明显提高， 但是对育性和其他 农艺性状没有显著影响(Gao et al.,2011)。 Zhai等(2000)通过农杆菌介导的方法将Xa21 基因转入5个水稻品种， 获得超过110株独立的转基因植株， 通过对转基因后代的PCR检测， Xa21基因整合到基因组中并能够稳定遗传(Zhai et al.,2。

11、000)。 张小红等(2008)通过农杆 菌介导的方法将Xa23基因的转入感病品种牡丹江8号， 通过对转基因后代的接种鉴定， 结果 表明Xa23基因的抗性可以准确、 稳定地遗传到T1代和T2代(张小红等， 2008)。 0006 由于人们对植物抗白叶枯病的分子机制缺乏了解， 抗白叶枯病分子育种还有很大 的盲目性。 而且水稻抗白叶枯病是众多抗病基因共同表达的结果， 采用单基因策略提高植 物的抗病性在实际生产应用中效果不明显， 如果改变一个基因的表达能够整体调控植物抗 白叶枯能力， 那将是一个理想的选择。 0007 在分析光敏色素调节水稻农艺性状形成机制过程中， 本课题组筛选到受phyB下调 的一。

12、个double B-box锌指蛋白基因。 进化树分析表明， 该基因编码蛋白与拟南芥的BBX22属 于同一个分支， Huang等人(2012)将其命名为OsBBX14。 在我们前期研究过程中发现， 亚细胞 定位和转录激活活性分析结果表明OsBBX14定位于细胞核， 并具有转录激活活性， 据此推测 OsBBX14可能是转录因子。 发明内容 0008 本发明从水稻品种日本晴中分离克隆到B-box锌指蛋白的OsBBX14基因， 转入水稻 中提高OsBBX14基因的表达水平， 显著提高了水稻的白叶枯抗性。 因此， 在水稻中过量表达 OsBBX14基因的表达对于提高水稻白叶枯抗性具有重要意义， 这为水稻的。

13、高抗白叶枯育种 提供新的思路。 0009 本发明首先通过PCR方法， 扩增出水稻品种日本晴的OsBBX14基因的全长编码区， 包含1134个碱基， 正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上； 再进行遗传转化至水稻 中， 提高OsBBX14基因的表达， 得到OsBBX14基因表达增强的转基因水稻植株。 在转基因的T3 代植株中发现， 阳性转基因水稻植株的白叶枯抗性显著高于野生型水稻。 利用1个国际鉴定 菌株(PXO99)， 6个国内鉴定菌株(YN11、 SCYC-6、 YN17、 FuJ、 YN24、 YN-1)， 进行接种鉴定， 结果 显示pCAMBIA1390-ubi-BBX1。

14、4过表达转基因株系对上述菌株均表现为抗病， 而非转基因株 系表现为感病。 0010 本发明用于构建过量表达OsBBX14基因的植物表达载体、 增强OsBBX14基因表达的 基因OsBBX14的DNA序列如SEQ ID NO： 1所示， 氨基酸序列如SEQ ID NO： 2所示。 0011 本发明利用水稻品种日本晴的OsBBX14基因的cDNA片段作为应用基因， 将该基因 正向转入水稻中， 提高OsBBX14基因的表达水平， 转基因水稻植株表现出白叶枯抗性。 0012 本发明的优点在于： 0013 (1)本发明提供了一种提高水稻白叶枯抗性的基因OsBBX14。 申请人在水稻中过量 说明书 2/9。

15、 页 4 CN 110747203 A 4 表达OsBBX14基因后， 发现转基因阳性植株白叶枯抗病性显著提高， 为培育抗白叶枯水稻品 种提供了新的思路， 也为其它作物利用异源基因技术提高水稻白叶枯抗病性提供了理论支 持。 0014 (2)本发明首次初步揭示了水稻OsBBX14基因提高水稻白叶枯抗性的机制， 为提高 水稻等禾谷类作物的白叶枯抗病性研究提供支持。 附图说明 0015 图1为本发明的OsBBX14基因表达载体的构建示意图。 将克隆在pMD18-T载体上的 OsBBX14基因利用BamHI和SpeI酶切， 替换pCAMBIA1390-ubi植物表达载体上BamHI和SpeI之 间的D。

16、NA片段， 这样OsBBX14基因正向插入玉米泛素基因启动子(Pubi)后， 即pCAMBIA1390- ubi-BBX14植物表达载体； 0016 图2为检测T3代转基因水稻阳性植株中OsBBX14基因转录本相对表达水平结果图。 其中OsBBX14-OX表示过表达OsBBX14基因的植株， #3、 #5和#16代表独立的阳性转基因株系； WT代表野生型水稻植株。 EF-1a作为荧光定量PCR分析的内参基因； 0017 图3为过表达OsBBX14基因水稻植株和野生型植株， 在大田条件利用1个国际鉴定 菌株(PXO99)， 6个国内鉴定菌株(YN11、 SCYC-6、 YN17、 FuJ、 YN。

17、24、 YN-1)， 进行白叶枯抗性接 种鉴定。 其中OsBBX14-OX表示过表达OsBBX14基因的植株， #3、 #5和#16代表三个独立的阳性 转基因株系； WT代表野生型水稻植株； 0018 图4为过表达OsBBX14基因水稻植株和野生型植株接种不同白叶枯菌株菌斑长度 统计结果。 其中OsBBX14-OX表示转OsBBX14基因的植株， #3、 #5和#16代表三个独立的阳性转 基因株系； WT代表野生型水稻植株。 具体实施方式 0019 以下实施例定义了本发明， 并描述了本发明在分离克隆用于构建OsBBX14基因植 物表达载体的DNA片段， 以及验证功能的方法。 根据以下的描述和这。

18、些实施例， 本领域技术 人员可以确定本发明的基本特征， 并且在不偏离本发明精神和范围的情况下， 可以对本发 明做出各种改变和修改， 以使其使用不同的用途和条件。 0020 实施例1： 分离克隆用于构建OsBBX14基因植物表达载体的DNA片段 0021 采用TRIZOL试剂(Invitrogen)从水稻品种日本晴(公开报道的一个品种)的叶片 中提取总RNA。 具体步骤如下： 将20毫克叶片放至液氮预冷的研钵中， 加入液氮快速磨成粉 末， 将粉末装入1.5ml离心管中， 迅速加入1ml Trizol(Invitrogen)颠倒混匀， 室温静置5分 钟。 在4， 12000rpm离心10分钟， 取。

19、上清液移至新的1.5ml离心管中。 加入200 l氯仿， 用手 剧烈摇动15秒钟， 室温静置2-3分钟。 4， 12000rpm离心15分钟。 取无色水相至一新的1.5ml 离心管中， 加入250 l异丙醇， 250 l高盐溶液， 颠倒混匀， 室温静置10分钟。 4， 12000rpm离 心10分钟， 吸除上清液。 加入1ml冰冷的75乙醇， 上下倒置几次， 然后4， 7500rpm离心5分 钟， 弃上清， 在室温下干燥至沉淀变透明。 加入适量的DEPC水(一般为60 l)溶解沉淀， 利用 紫外分光光度计测定RNA的浓度。 0022 利用反转录酶SuperScript II(Invitroge。

20、n)将其反转录成cDNA， 具体步骤如下： 依次加入1 l 500 g/ml oligo(dT)12-18、 2 g总RNA、 1 l 10mM dNTP混合物和DEPC水至12 说明书 3/9 页 5 CN 110747203 A 5 l， 在65水浴中5分钟， 迅速冰浴5分钟， 稍微离心收集样品于管底。 然后依次加入4 l 5 第一链缓冲液、 2 l 0.1M DTT和1l RNaseOUT(40U/l)， 42， 2分钟。 然后加入1l SuperScript II， 轻微混合均匀， 42反应50分钟， 然后70水浴15分钟使酶失活， 这样就 合成了第一链cDNA， 以第一链cDNA为模。

21、板扩增目的基因。 用带有酶切位点的上游引物 OsBBX14F(5 -ATGGATCCATGTCGCCTCCTCCTCCACCATATTA-3 ， SEQ ID NO： 3， 序列特异引物外 加BamHI位点和两个保护碱基)和下游引物OsBBX14R(5 -AACTAGTTTATTGCCTCCGGCGTTTGGA GGTG-3 ， SEQ ID NO： 4， 序列特异引物外加SpeI位点和两个保护碱基)。 利用PrimerSTAR HS DNApolymerase with GC buffer(TaKaRa)扩增目的片段， PCR反应条件是94预变性1分 钟； 9810秒， 684分钟， 30个。

22、循环。 利用TArget Clone TM-Plus试剂盒(TOYOBO)在PCR产 物末端加A。 然后连接到pMD18-T载体(TaKaRa)。 筛选阳性克隆并测序， 获得所需DNA片段(序 列如SEQ ID NO： 1所示)， 将该克隆命名为pMD18-OsBBX14 cDNA。 0023 实施例2： OsBBX14基因植物表达载体的构建和遗传转化 0024 为了能更好地分析OsBBX14的功能， 申请人通过过量表达技术使OsBBX14基因在水 稻中表达水平提高。 根据转基因植株的农艺性状特征研究该基因的功能。 0025 OsBBX14基因植物表达载体的构建方法如下： 首先将实施例1中得到。

23、的阳性克隆 pMD18-OsBBX14用BamHI和SpeI双酶切， 回收插入片段； 并用同样的方法酶切pCAMBIA1390- ubi的植物表达载体， 回收载体片段。 用回收的插入片段和载体片段做连接反应， 转化大肠 杆菌XL1-Blue。 通过酶切筛选阳性克隆， 获得植物表达载体， 命名为pCAMBIA1390-ubi- BBX14(见图1)。 pCAMBIA1390-ubi是在国际常用的植物遗传转化载体(见图1)。 将 pCAMBIA1390-ubi-BBX14转化至农杆菌菌株EHA105。 0026 通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系(参见本发明后面的实施例)将其导入到水 稻品种日本晴中。

24、， 经过预培养、 侵染、 共培养、 筛选具有潮霉素抗性的愈伤、 分化、 生根、 移苗 得到转基因植株。 农杆菌介导的水稻遗传转化体系在Hiei等人报道的方法基础上进行改良 (Hiei等， 1994， Plant J.， 6:271-282)。 转化共获得20株独立的转基因水稻植株。 0027 具体步骤如下： 0028 (1)愈伤诱导： 去壳的野生型日本晴水稻种子， 用70乙醇表面消毒1分钟； 5(活 性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分钟； 无菌水冲洗4-5次； 播种于愈伤诱导培养基上诱导愈 伤组织(成分见后)， 于25-26暗培养4-7天后， 将从成熟胚盾片处诱导出初生愈伤组织， 同 时用。

25、镊子去掉胚上长出的胚芽， 继代于愈伤诱导培养基继续培养2周， 直至长出色泽淡黄， 质地坚硬呈颗粒状的胚性愈伤组织。 0029 (2)愈伤组织的预培养： 将愈伤组织转至新鲜的愈伤诱导培养基培养， 于25-26 暗培养4天。 0030 (3)农杆菌培养： 挑取农杆菌单克隆接种到5mL YEP液体培养基中(含有50mg/L的 卡那霉素)， 28， 220rpm， 培养至对数生长晚期(大约培养18-24小时)。 将获得的菌液按1 接种量转接到50mL新鲜的、 含有50mg/L卡那霉素的AB液体培养基中(成分见后)； 28， 220rpm， 培养至OD600值为0.5左右(培养5-6小时)。 0031 。

26、(4)农杆菌侵染： 把50mL菌液转入离心管， 4， 4000g离心10分钟， 弃上清， 加入等 体积的AAM培养基重悬菌体。 把(2)的日本晴胚性愈伤组织浸入上述AAM菌液， 侵染2分钟， 缓 慢摇动。 用无菌吸水纸将愈伤组织吸干， 置于共培养培养基上(培养基上铺一层无菌滤纸)， 说明书 4/9 页 6 CN 110747203 A 6 26， 黑暗共培养2-3天。 0032 (5)愈伤洗涤和选择培养： 共培养后的愈伤组织用无菌水洗4次， 然后再用含 500mg/L羧苄青霉素Cb的无菌水洗2次， 再用无菌吸水纸吸干后置于工作台吹30分钟。 将愈 伤组织置于固体筛选培养基(含有25mg/L潮霉。

27、素， 400mg/L羧苄青霉素)上， 26暗培养2周。 然后转移到固体筛选培养基(含有30mg/L潮霉素， 300mg/L羧苄青霉素)上， 26暗培养， 每2 周继代一次， 筛选4周。 0033 (6)分化培养： 把抗性愈伤组织转移至分化培养基上， 28光照培养7天， 转接一次 后， 培养至产生再生苗。 0034 (7)壮苗、 移栽： 将再生的小植株转至新鲜的1/2MS培养基上， 于培养瓶中生根壮 苗。 待小苗长至10cm左右， 打开封口膜， 炼苗2-3天， 将再生苗移至土中培养。 0035 试剂配方： 0036 (1) 试剂和溶液缩写 ： 本发明中作用到的植物激素的缩写表示如下 ： Cb (。

28、Cabenicillin,羧苄青霉素)； KT(Kinetin， 激动素)； NAA(Napthalene acetic acid， 萘乙 酸)； 2， 4-D(2， 4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸)； AS(Acetosyringone， 乙酰丁香酮)； DMSO(Dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜)。 0037 (2)用于水稻遗传转化的培养基配方： 0038 1)YEP液体培养基： 2g Bacto-蛋白胨， 2g酵母粉， 1g NaCl， 加水定容至200mL， 用5N NaOH调pH至7.0。 0039 2)愈伤诱导培养基：。

29、 N6大量， N6微量， 铁盐， N6维生素， 0.5g/L酸水解酪蛋白， 30g/L 蔗糖， 2mg/L 2,4-D， Gelrite(Sigma)4g/L， pH 5.8。 0040 3)AB液体培养基： 3g/L K2HPO4， 1g/L NaH2PO4， 1g/L NH4Cl， 300mg/L MgSO47H2O， 150mg/L KCl， 10mg/L CaCl22H2O， 2.5mg/L FeSO47H2O， 5g/L葡萄糖， pH 7.0。 0041 4)AAM培养基： AA大量， AA微量,0.9g/L L-谷氨酰胺， 0.3g天冬氨酸， MS维生素， 0.5g/L酸水解酪蛋白。

30、， 36g/L葡萄糖， 68.5g/L蔗糖， 20mg/L AS， pH 5.2。 0042 5)共培养培养基： N6大量， N6微量， 铁盐， N6维生素， 30g/L蔗糖， 10g/L葡萄糖， 0.5g/L酸水解酪蛋白， 2mg/L 2,4-D， 20mg/L AS， Gelrite(Sigma)4g/L， pH 5.8。 0043 6)固体筛选培养基： N6大量、 N6微量和N6维生素， 0.5g/L酸水解酪蛋白， 30g/L蔗 糖， 2mg/L 2,4-D， Gelrite(Sigma)4g/L， pH 5.8， 合适浓度的潮霉素和羧苄青霉素。 0044 7)分化培养基： MS大量， 。

31、MS微量， 铁盐和MS维生素， 2g/L酸水解酪蛋白， 30g/L蔗糖， 30g/L山梨醇， 2mg/L KT， 0.2mg/L NAA， pH 5.8， 30mg/L潮霉素B， 200mg/L羧苄青霉素。 0045 8)1/2MS培养基： 1/2MS大量， 1/2MS微量， MS维生素， 30g/L蔗糖， 4g/L Gelrite， 30mg/L潮霉素B， 200mg/L羧苄青霉素， pH 5.8. 0046 (3)主要溶液配方： 0047 1)N6大量元素(10) 0048 说明书 5/9 页 7 CN 110747203 A 7 0049 0050 2)N6微量(1000)： 0051 。

32、0052 3)N6维生素(1000) 0053 0054 4)MS大量元素(10) 0055 0056 5)MS微量(1000)： 0057 说明书 6/9 页 8 CN 110747203 A 8 0058 0059 6)MS维生素(1000) 0060 0061 7)铁盐(200) 0062 FeSO4.7H2O 5.56g 0063 Na2EDTA.2H2O 7.46g； 0064 8)AA大量(200) 0065 0066 9)AA微量(1000) 0067 0068 10)2,4-D储存液(2mg/ml) 0069 称取2， 4-D 100mg,溶于1ml DMSO， 加入蒸馏水定溶。

33、至49ml， 然后加入0.5N NaOH， 至完全溶解， 于-20保存。 0070 11)Kinetin储存液(0.2mg/ml) 0071 称取Kinetin 10mg， 溶于1ml 1N KOH， 加蒸馏水定溶至50ml， 于4保存。 0072 12)NAA储存液(0.2mg/ml) 0073 称取NAA 10mg， 溶于0.5ml 1N KOH， 加蒸馏水定溶至50ml， 于4保存。 0074 13)乙酰丁香酮(100mg/ml) 说明书 7/9 页 9 CN 110747203 A 9 0075 称取乙酰丁香酮100mg， 溶于1ml DMSO， 于-20保存。 0076 14)卡那霉。

34、素(50mg/ml) 0077 称取卡那霉素500mg， 溶于8ml蒸馏水中， 加蒸馏水定溶至10ml， 然后用0.22 m滤器 过滤除菌， 于-20保存。 0078 实施例3： 检测转基因水稻植株和野生型水稻的OsBBX14基因的转录本水平 0079 以水稻野生型日本晴和8个独立的T3代转基因水稻植株为材料， 提取四叶期水稻 叶片的RNA， 利用RT-PCR检测水稻叶片中OsBBX14基因的转录本水平。 具体方法如下： 采用 TRIZOL试剂(Invitrogen)从上述材料收集0.03g水稻叶片提取总RNA， 具体步骤如实施例1 的描述。 0080 利用RNase-free DNase(T。

35、aKaRa)除去RNA中的DNA， 具体步骤如下： 依次加入Total RNA50 g， 10DNase I Buffer 5 l， DNase I(RNase-free， 5U/ l)2 l， RNase Inhibitor (50U/ l)0.4 l， 加DEPC水补足总体积至50 l。 反应体系混匀后在37反应30min。 然后在反 应体系中加入50 l DEPC水补足至100 l。 随后加入苯酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)混 合物100 l， 充分混匀， 4， 12000rpm离心15min。 将上层移至新的1.5ml离心管中。 加入100 l氯仿:异戊醇(体积比24:1)混。

36、合物， 充分混匀， 4， 12000rpm离心15分钟。 取最上层移至另 一新的1.5ml离心管中， 加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积的冷无水乙醇， -80 放置1小时， 4， 12000rpm离心10分钟， 吸除上清液。 加入1ml冰冷的75乙醇， 上下倒置 几次， 然后4， 7500rpm离心5分钟， 弃上清， 在室温干燥至沉淀变透明。 加入25 l DEPC水溶 解沉淀， 利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。 0081 根据PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I(TaKaRa)说明书合成cDNA第一链。 具体步骤 如下： 依次加入上述总RNA。

37、1 g、 5PrimeScript buffer 2 l、 PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 l、 Random 6mers(100 M)和Oligo dT Prime(50 M)各0.5 l， 最后用RNase Free dH2O 补充至总体积为10 l。 然后将反应体系在37下保温15分钟， 使反转录反应进行， 然后用85 高温处理5秒使酶失活， 即完成了cDNA第一链的合成。 0082 以上述cDNA为模板， 用OsBBX14基因的特异性上游引物OsBBX14qF1(5 - TCCTCCACCATATTACCACCA-3， SEQ ID NO： 5) ， 和下游。

38、引物OsBBX14qR1(5 - GCGCTGCACAGTAGCTTCAT-3 ， SEQ ID NO： 6)进行荧光定量PCR分析。 同时用水稻内源翻译延 伸因子基因作为荧光定量PCR分析的内参基因， 其特异上游引物为OsEF-1aF(5 - TTTCACTCTTGGTGTGAAGCAGAT-3 ， SEQ ID NO： 7)， 特异下游引物为OsEF-1aR(5 - GACTTCCTTCACGATTTCATCGTAA-3 ， SEQ ID NO： 8)。 利用SYBR Premix Ex TaqTMPCR试剂盒 (TaKaRa)进行荧光定量PCR反应。 具体步骤如下： 依次加入10 l 2。

39、SYBR Premix Ex TaqTM、 2.0 l cDNA模板、 0.2 M基因特异性引物对， 用RNase-free H2O补足反应体系为20 l。 PCR反 应条件是95预变性30秒； 95变性30秒， 60退火延伸30秒， 40个循环。 PCR反应结束后， 分析各个样品的扩增曲线和溶解曲线以确定实验结果的可信度。 然后用Excel通过2- Ct法 处理荧光定量PCR获得的Ct值并计算标准误差， 对最终处理结果作图。 结果表明过表达株系 中OsBBX14基因的转录本水平是非转基因水稻植株的50-150倍， 从而证明OsBBX14基因已整 合到水稻基因组中并且在水稻中大量表达(图2)。。

40、 0083 实施例4： 转OsBBX14基因水稻在大田处理条件下白叶枯抗性增强 0084 于5月中旬， 将转基因植株和野生型植株用70乙醇表面消毒1分钟； 5(活性氯 说明书 8/9 页 10 CN 110747203 A 10 含量)NaClO溶液表面消毒20分钟； 无菌水冲洗4-5次； 16浸种36小时， 37催芽24小时， 播 种于大田秧床上， 保持水层生长30天后， 水稻秧苗移栽到大田(株距15厘米， 行距25厘米)， 生长至抽穗期后， 利用1个国际鉴定菌株(PXO99)， 6个国内鉴定菌株(YN11、 SCYC-6、 YN17、 FuJ、 YN24、 YN-1)对水稻进行接种鉴定， 。

41、结果显示pCAMBIA1390-ubi-BBX14过表达转基因株 系对上述菌株均表现为抗病， 而非转基因株系表现为感病(如图3)。 转基因株系病斑长度显 著短于野生型水稻(如图4)。 相同实验重复3次， 结果表明， 发现转基因阳性植株白叶枯菌抗 性较强(菌斑长度为野生型的一半左右)， 而对应的野生型植株无白叶枯抗性。 说明书 9/9 页 11 CN 110747203 A 11 SEQUENCE LISTING 山东省水稻研究所 基因OsBBX14在提高水稻白叶枯抗性中的应用 0 8 PatentIn version 3.3 1 1134 DNA 水稻 （Oryza sativa） CDS (。

42、1).(1134) 编码B-box型锌指蛋白的OsBBX14基因 1 atg tcg cct cct cct cca cca tat tac cac cac ctc ctc ctc ctc cgc 48 Met Ser Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Tyr His His Leu Leu Leu Leu Arg 1 5 10 15 tcc tcg ccc acc acc act gga gga gga gct cgg gtt ctt gcc gcg gcg 96 Ser Ser Pro Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Arg Val Leu Ala A。

43、la Ala 20 25 30 gag ctc gca cgc atg aag cta ctg tgc agc gcg tgc gag gcg gcg gag 144 Glu Leu Ala Arg Met Lys Leu Leu Cys Ser Ala Cys Glu Ala Ala Glu 35 40 45 gcc agc gtc ctc tgc tgc gcc gac gag gcc gcc ctg tgc gcg cgc tgc 192 Ala Ser Val Leu Cys Cys Ala Asp Glu Ala Ala Leu Cys Ala Arg Cys 50 55 60 ga。

44、c cgc gac atc cac gcc gcc aac cgc ctc gcc ggg aag cac ctc cgc 240 Asp Arg Asp Ile His Ala Ala Asn Arg Leu Ala Gly Lys His Leu Arg 65 70 75 80 ctc cct ctc ctc tcc ccc gcc tcc tcc tcc tcc tcc tcc gcc gcc gcc 288 Leu Pro Leu Leu Ser Pro Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala 85 90 95 ctc gcg ccg ccg c。

45、cg ccg tcg ccg ccc aag tgc gac ata tgc cag gag 336 Leu Ala Pro Pro Pro Pro Ser Pro Pro Lys Cys Asp Ile Cys Gln Glu 100 105 110 agc cac gcg tac ttc ttc tgc ctc gag gac cgc gcg ctg ctg tgc cgg 384 Ser His Ala Tyr Phe Phe Cys Leu Glu Asp Arg Ala Leu Leu Cys Arg 序列表 1/5 页 12 CN 110747203 A 12 115 120 12。

46、5 agc tgc gac gtg gcg gtg cac acg gcc aac gcc ttc gtc tcc gcg cac 432 Ser Cys Asp Val Ala Val His Thr Ala Asn Ala Phe Val Ser Ala His 130 135 140 cgc cgt ttc ctc ctc acc ggc gtg cag gtc ggg cag gag cag gac gag 480 Arg Arg Phe Leu Leu Thr Gly Val Gln Val Gly Gln Glu Gln Asp Glu 145 150 155 160 cac tc。

47、c cct gac ccg cct gag ccg tct cct cct cct ccg ccg ccg ccg 528 His Ser Pro Asp Pro Pro Glu Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 165 170 175 cct gca tcc aag agc gac cac ccg gcg ccg ctc tac ggc gag ggc gga 576 Pro Ala Ser Lys Ser Asp His Pro Ala Pro Leu Tyr Gly Glu Gly Gly 180 185 190 gga ggg ttc agc tg。

48、g gac gcc gcc gac tcg ccg gcc gcg ggc ggc ctc 624 Gly Gly Phe Ser Trp Asp Ala Ala Asp Ser Pro Ala Ala Gly Gly Leu 195 200 205 ccc gac tgg tcg gcc gtc gtc gac cag ttc ggc tcc ccg ccg ccg cgc 672 Pro Asp Trp Ser Ala Val Val Asp Gln Phe Gly Ser Pro Pro Pro Arg 210 215 220 cac acg gac acc gcg acc gtg ac。

49、g acc ccg ccg ccg acc aag agg agc 720 His Thr Asp Thr Ala Thr Val Thr Thr Pro Pro Pro Thr Lys Arg Ser 225 230 235 240 cca cgc gcg ccg gcg ttc ggc ggc cag ggc ggc atg atg gat tgg ccc 768 Pro Arg Ala Pro Ala Phe Gly Gly Gln Gly Gly Met Met Asp Trp Pro 245 250 255 ctc ggc gag ttc ttc ggc ggc ttc acc ga。

50、c ttc acc ggc ggc ttt ggc 816 Leu Gly Glu Phe Phe Gly Gly Phe Thr Asp Phe Thr Gly Gly Phe Gly 260 265 270 ttc ggc ttc ggc gac agt ggc acc tcc aag gct gac agc ggg aag ctg 864 Phe Gly Phe Gly Asp Ser Gly Thr Ser Lys Ala Asp Ser Gly Lys Leu 275 280 285 gga ggg agc acg gac ggc tcg ccg tac tac cgg tcg tc。