肾胺酶相关活性多肽RP220在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911251380.5 (22)申请日 2019.12.09 (71)申请人 上海交通大学医学院附属仁济医院 地址 200001 上海市黄浦区山东中路145号 (72)发明人 王玲倪兆慧戚超君牟姗 (74)专利代理机构 上海骁象知识产权代理有限 公司 31315 代理人 赵峰 (51)Int.Cl. A61K 38/43(2006.01) A61P 13/12(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (54)发明名称 肾胺酶相关活性多肽RP220在制备治疗。

2、肾脏 疾病的药物中的用途 (57)摘要 本发明提供了一种肾胺酶相关活性多肽 RP220在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途， 所 述的肾胺酶相关活性多肽RP220的氨基酸序列如 SEQIDNO.1所示。 进一步的， 所述的肾脏疾病为 狼疮性肾炎。 本发明发现renalase相关活性肽 RP220可缓解LN小鼠疾病活动， 减轻肾组织损伤； RP220的肾脏保护作用是通过下调NLRP3表达， 抑 制LN模型小鼠肾脏促炎症因子表达； 同时调节巨 噬细胞活性， 减少炎症因子合成发挥作用。 RP220 可以作为将来LN干预治疗的新靶点和治疗措施。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图4页 CN 11。

3、0772634 A 2020.02.11 CN 110772634 A 1.一种肾胺酶相关活性多肽RP220在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途， 所述的肾胺 酶相关活性多肽RP220的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的用途， 其特征在于： 所述的肾脏疾病为狼疮性肾炎。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110772634 A 2 肾胺酶相关活性多肽RP220在制备治疗肾脏疾病的药物中的 用途 技术领域： 0001 本发明属于生物医药领域， 涉及一种肾胺酶相关活性多肽RP220， 具体来说是一种 肾胺酶相关活性多肽RP220在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途。 背景技。

4、术： 0002 系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus， SLE)是一种由多因素共同作 用引发自身免疫耐受缺失， 免疫系统功能紊乱所导致的多系统自身免疫性疾病， 好发于育 龄期女性， 患者临床表现多样， 组织损伤可累及皮肤、 关节、 肾脏、 中枢神经系统、 心血管系 统、 浆膜、 血液系统和免疫系统。 SLE的发病具有显著的人种、 性别和种族差异， 中国人群SLE 的发病率显著高于白种人。 0003 狼疮性肾炎(Lupus nephritis， LN)是SLE患者最常见的严重并发症之一， 约有 75的SLE患者疾病累及肾脏， 出现临床症状和体征； 近100的S。

5、LE患者存在肾脏病理损伤 表现。 SLE患者的肾脏受累程度是并发症发生和不良预后的重要影响因素。 LN也是我国常见 的继发性肾小球疾病， 尽管近年来不断有新型免疫抑制剂被研发并运用于临床， LN患者的 疗效也得到显著改善； 但仍有不少患者预后不佳， 其中约有20的LN患者最终会进展为 (end stage renal disease， ESRD)， 需肾脏替代治疗。 随着医疗事业的不断发展进步， LN患 者所需的医疗费用在近年来有上升趋势， 也给患者带来较重的心理和经济负担。 0004 目前对SLE这一自身免疫性疾病的研究正逐渐深入， 对其发病机制和药物干预的 基础研究常在多种自发自身免疫性疾。

6、病， 且症状与SLE患者类似的小鼠品系中进行。 主要研 究的小鼠品系包括MRL/lpr、 BSXB和NZB/W杂交一代， 这些小鼠以血循环自身抗体滴度显著 升高、 系统性血管炎、 皮肤及肾脏损伤为特征， 最终由于肾功能不全、 高血压或自发性出血 而导致早发死亡。 0005 LN发病机制非常复杂， 目前尚未完全阐明。 对LN发病机制的了解主要来自于多种 自发SLE并伴有显著肾小球肾炎小鼠模型的研究。 自发LN小鼠模型包括MRL/lpr小鼠， NZB/W F1代小鼠以及NZM2328和NZM 2410小鼠。 对LN模型小鼠的研究发现， 小鼠体内大量自身抗体 的产生导致循环免疫复合物形成并沉积于肾脏。

7、， 激活补体和Fc受体， 引起细胞增殖， 促进 促炎症因子和细胞因子释放， 参与肾脏损伤。 多种免疫细胞包括巨噬细胞， 树突状细胞， B淋 巴细胞， T淋巴细胞等均参与LN的发病； 固有免疫细胞和适应性免疫细胞在疾病时合成并释 放I型IFN(Interferon)， 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor- ， TNF- )、 单核细胞趋化 因子(monocyte chemotactic protein 1， MCP-1)、 IL-6、 调节活化正常T细胞表达与分泌的 趋化因子(regulated uponactivation normal T cell expressed 。

8、and secreted， RANTES)、 肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis， TWEAK)等多种细胞因子、 趋化因子和促炎症因子， 引起并放大炎症及免疫反 应， 导致并加重肾组织损伤。 0006 针对已知参与LN的发病机制， 自20世纪60年代起一系列免疫抑制剂被研发并逐步 说明书 1/5 页 3 CN 110772634 A 3 运用于临床， 有效地提高了LN患者的疗效。 在上世纪60年代起， 糖皮质激素首先被运用于LN 的治疗； 70-80年代， 美国国立卫生研究院对环磷酰胺(cycl。

9、ophosphamide， CTX)进行了多项 研究并确认CTX与糖皮质激素联用对LN的疗效优于单用糖皮质激素， CTX成为LN患者的首选 治疗用药。 自90年代起， 多种新型免疫抑制剂如硫唑嘌呤(azathioprine， AZA)， 霉酚酸酯 (Mycophenolatemofetil， MMF)和钙调磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitors， CNIs)相继 被运用于临床LN的治疗。 0007 近年来有关LN的诊疗指南均推荐根据患者不同病理分型， 选择CTX、 MMF、 CNIs或 AZA作为LN患者的首选药物。 21世纪以来， 生物制剂的研发增加了LN患者的治疗可选用。

10、药。 由于多种免疫细胞均参与LN的发病机制， 因此多种针对淋巴细胞的生物制剂包括抗CD-20 抗体利妥昔单抗、 抗BAFF(B细胞活化因子， B cell activating factor)抗体贝利木单抗， 抑制T淋巴细胞活化的阿巴西普等被研发。 研究证实， 利妥昔单抗和贝利木单抗均对LN有一 定疗效， 有望在进一步的临床试验中确认其疗效并运用于临床。 但II期和III期临床实验并 未能证实阿巴西普的疗效。 0008 虽然目前LN患者的治疗用药有一定可选择性， 但疗效仍不尽如人意。 研究显示， LN 患者体内存在高亲和力的自身免疫性T、 B淋巴细胞克隆大量增殖， 现有免疫抑制剂尚不能 完全清。

11、除这些自身免疫性细胞。 因此， 常规的治疗方案能减轻疾病活动， 但无法完全抑制LN 患者体内的自身免疫反应。 多项研究也报道， 目前LN患者的治疗有效率在50-70左右， 而 诱导期疗效不佳常常预示着患者预后不良。 同时， 免疫抑制剂存在诸多的毒副作用也进一 步限制了其临床的应用， 如1)糖皮质激素， CTX， MMF和CNIs类药物均会使患者免疫力显著下 降， 更易诱发严重感染； 2)免疫抑制药物会导致骨髓抑制， 严重者需停用药物； 3)肿瘤的发 生率升高， 多项调查报道， 在使用免疫抑制剂治疗的LN患者中并发肿瘤的增多； 4)高血糖， 糖皮质激素的使用会诱发类固醇性糖尿病， CNIs类药物。

12、也会影响患者的血糖； 5)性腺抑制。 因此， 仍需要寻找更多新干预靶点， 研发更有效的药物， 改善LN患者的疗效及远期预后。 0009 目前对SLE这一自身免疫性疾病的研究正逐渐深入， 对其发病机制和药物干预的 基础研究常在多种自发自身免疫性疾病， 且症状与SLE患者类似的小鼠品系中进行。 主要研 究的小鼠品系包括MRL/lpr、 BSXB和NZB/W杂交一代， 这些小鼠以血循环自身抗体滴度显著 升高、 系统性血管炎、 皮肤及肾脏损伤为特征， 最终由于肾功能不全、 高血压或自发性出血 而导致早发死亡。 发明内容： 0010 本发明的目的在于提供一种肾胺酶相关活性多肽RP220在制备治疗肾脏疾病。

13、的药 物中的用途， 所述的这种肾胺酶相关活性多肽RP220在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途 要解决现有技术中的药物改善LN患者的疗效及远期预后效果不佳的技术问题。 0011 本发明提供了一种肾胺酶相关活性多肽RP220在制备治疗肾脏疾病的药物中的用 途， 所述的肾胺酶相关活性多肽RP220的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0012 进一步的， 所述的肾脏疾病为狼疮性肾炎。 0013 RP220是renalase相关小分子活性肽， 由20个氨基酸残基构成(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)， 稳定表达于所有renalase蛋白亚型中。 RP220是介导renalase肾脏保护作用。

14、 的主要结构域， 研究证实RP220具有抗炎、 抗凋亡作用。 外源性注射此小分子活性肽能减少 说明书 2/5 页 4 CN 110772634 A 4 AKI小鼠模型肾脏巨噬细胞浸润、 减少肾小管上皮细胞凋亡， 减轻肾组织损伤。 体内外研究 均证实， RP220通过激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路(mitogen-activated protein kinase， MAPK)对肾小管上皮细胞起抗凋亡作用。 本发明的研究结果提示renalase相关小分 子活性肽RP220具有肾脏保护作用， 这些作用与其所具有的抗炎、 抗凋亡、 抗氧化应激作用 相关。 0014 本发明通过体内及体外实验， 探讨re。

15、nalase小分子活性肽RP220对LN的发生发展 是否具有一定干预及治疗作用， 并初步探索其可能存在的作用机理。 0015 本发明发现RP组小鼠尿白蛋白/肌酐比值显著下降， 明显低于veh组。 对小鼠血液 进行生化检测后发现， RP组和CTX组小鼠的尿素氮veh组显著下降， 三组小鼠间血肌酐并无 显著差异。 在研究中， 虽然有发现小鼠血尿素氮的显著差异， 但却未见明显的血肌酐差异， 这与多项对MRL/lpr小鼠的研究相同。 对各组小鼠肾组织的病理染色也发现， 与veh组相比， RP组小鼠肾小球损伤显著得到缓解， 未见小管管型形成， 炎症细胞浸润显著减少。 研究结果 提示， RP220与CTX。

16、相同， 具有一定的改善MRL/lpr小鼠疾病活动， 减轻肾组织损伤的作用。 与 veh组相比， RP组小鼠血清抗dsDNA抗体浓度有显著的下降， 仅为veh组的25。 免疫荧光染 色结果也发现， 在MRL/lpr小鼠肾组织中存在的大量IgG和C3沉积， 在使用RP220和CTX干预 治疗后， 肾组织中IgG和C3沉积显著减少， 提示RP220对LN小鼠体内自身抗体的产生及自身 免疫反应具有抑制作用。 0016 本发明发现RP220能够减轻LN小鼠疾病活动， 降低血清抗dsDNA抗体浓度， 减少肾 组织IgG和C3沉积， 这在国内外尚未见有报道。 附图说明 0017 图1显示CTX组及RP组小鼠。

17、尿白蛋白/肌酐比值较veh组显著下降， *CTX组与veh组 比较， P0.05， *RP220组与veh组比较， P0.05。 0018 图2显示RP220显著减轻MRL/lpr小鼠的肾脏病理损伤。 0019 图3显示三组不同处理小鼠肾脏病理改变的比较(100)。 0020 图4显示RP220可改善MRL/lpr小鼠肾脏病理损伤(400)。 (A-C)veh组小鼠肾脏出 现球性硬化、 管型形成， 大量炎症细胞浸润等病理改变； (D-F)RP组小鼠小球病变减轻， 未见 管型形成， 炎症细胞浸润减少； (G-I)CTX组小鼠肾组织病变显著减轻； (J)RP组和CTX组小鼠 肾脏损伤评分(小球、 。

18、小管及血管损伤评分)较veh组显著下降， *与veh组比较， P0.05。 0021 图5显示RP组和CTX组小鼠血清抗dsDNA抗体滴度显著下降， 与veh组相比， *P 0.05， *P0.005； 0022 图6显示不同干预治疗对MRL/lpr小鼠肾小球C3、 IgG沉积的影响Figure 6 C3 and IgG deposition in the glomerular of mice with different treatments 具体实施方式： 0023 实施例1 RP220减轻MRL/lpr小鼠白蛋白尿MRL/lpr小鼠为自发性狼疮小鼠模型 (来自上海斯莱克实验有限责任公司)。

19、。 0024 研究结果显示veh组小鼠自12周龄起尿白蛋白/肌酐比值逐渐增多(见图1)， 在24 周龄时尿白蛋白/肌酐比值显著高于12周龄(727.33104.46vs.80.4758.06， P0.005)。 说明书 3/5 页 5 CN 110772634 A 5 虽然RP组小鼠尿白蛋白/肌酐比值在治疗期间也有所升高， 但RP组小鼠尿蛋白发生时间较 veh组显著延迟， 且一直维持在较低水平， 在24周龄时尿白蛋白/肌酐比值较veh组显著下降 (127.67133.42vs.727.33104.46， P0.05， 图1)， 接近于其12周龄时的数值， 详见表1。 0025 实施例2 RP2。

20、20显著减轻MRL/lpr小鼠肾脏病理损伤 0026 如图2A所示， 药物干预治疗12周后， RP组和CTX组小鼠血尿素氮浓度较veh组显著 下降， RP组小鼠血尿素氮浓度仅为veh组的50不到(12.984.68vs.27.593.25， P 0.005)， CTX组小鼠血尿素氮浓度仅为veh组的25(6.180.74vs.27.593.25， P 0.005)， RP组和CTX组小鼠血尿素氮浓度无差异。 三组小鼠血肌酐浓度并无显著差异， 见图 2B和表1。 0027 表1不同处理组小鼠各项指标比较 0028 Table 1 Comparison of various variables i。

21、n mouse with different treatment 0029 0030 *与veh组比较， P0.05； *与veh组比较， P0.005； #与CTX组比较， P0.05； 0031 HE染色结果显示， veh组小鼠系膜细胞和基质重度增生， 可见部分小球球性硬化， 部分小球新月体形成， 小管内大量管型形成， 间质可见大量炎症细胞浸润(图3)。 如图4A、 4D、 4G所示， 与veh组相比， CTX组和RP组小鼠系膜细胞增生和基质增多显著缓解， 小球损伤 有所改善。 CTX组和RP组小鼠未见肾小管管型形成(图4B、 4E、 4H)， 血管周和间质炎症细胞浸 润显著减少(图4C、。

22、 4F、 4I)。 病理损伤评分结果也提示CTX组和RP组小鼠肾小球、 小管间质及 血管病变均较veh组有所减轻(见图4J)。 提示RP220具有与CTX相似的作用， 能够明显减轻 MRL/lpr小鼠肾组织损伤。 0032 实施例3 RP220改善MRL/lpr小鼠疾病活动及免疫学指标 0033 血清抗dsDNA抗体是目前反应系统性红斑狼疮患者疾病活动的主要监测指标， 因 此， 我们采用ELISA法检测小鼠血清dsDNA抗体浓度。 结果发现， MRL/lpr小鼠经CTX和RP220 干预12周后， 血清dsDNA抗体浓度较veh组均有显著的下降(3330 .43676 .3U/ml vs.14。

23、479.91293.1U/ml， P0.05； 572.7355.1U/ml vs.14479.91293.1U/ml， P 0.005)， 见表1； CTX组和RP组两组间血清dsDNA抗体浓度并未见显著性差异， 见图5。 我们的 说明书 4/5 页 6 CN 110772634 A 6 结果提示， RP220对MRL/lpr小鼠血清自身抗体的产生具有抑制作用， 从另一方面印证了 RP220对MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎的缓解作用。 0034 我们进一步检测了MRL/lpr小鼠肾脏免疫复合物的沉积情况。 如图6所示， veh组小 鼠24周龄时， 免疫荧光染色可见肾组织内有大量IgG和C3呈颗。

24、粒状沉积。 RP组小鼠肾组织 IgG和C3沉积较veh组显著减少， 与CTX组小鼠则无显著差异。 这一结果进一步提示， RP220具 有抑制MRL/lpr小鼠体内自身免疫反应的作用。 0035 结论： 0036 renalase相关活性肽RP220可缓解LN小鼠疾病活动， 减轻肾组织损伤； RP220的肾 脏保护作用是通过下调NLRP3表达， 抑制LN模型小鼠肾脏促炎症因子表达； 同时调节巨噬细 胞活性， 减少炎症因子合成发挥作用。 RP220可以作为将来LN干预治疗的新靶点和治疗措 施。 说明书 5/5 页 7 CN 110772634 A 7 序列表 上海交通大学医学院附属仁济医院 肾胺酶。

25、相关活性多肽RP220在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 20 PRT Homo sapiens 1 Cys Ile Arg Phe Val Ser Ile Asp Asn Lys Lys Arg Asn Ile Glu Ser 1 5 10 15 Ser Glu Ile Gly 20 序列表 1/1 页 8 CN 110772634 A 8 图1 图2 图3 说明书附图 1/4 页 9 CN 110772634 A 9 图4 说明书附图 2/4 页 10 CN 110772634 A 10 图5 说明书附图 3/4 页 11 CN 110772634 A 11 图6 说明书附图 4/4 页 12 CN 110772634 A 12 。