水稻维管束特异性表达的启动子POs01g0699100及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910946363.7 (22)申请日 2019.10.04 (71)申请人 河北科技大学 地址 050000 河北省石家庄市裕华区裕翔 街26号 (72)发明人 艾鹏飞于可信孔德晶 (74)专利代理机构 北京汇捷知识产权代理事务 所(普通合伙) 11531 代理人 邢文月 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/46(2018.01) (54)发明名称 水。

2、 稻 维 管 束 特 异 性 表 达 的 启 动 子 POs01g0699100及其应用 (57)摘要 本发明公开了水稻维管束特异性表达的启 动子POs01g0699100及其应用。 本发明提供的水 稻维管束特异性表达的启动子POs01g0699100为 如下a)-c)中任一所述的DNA片段： a)SEQID No.1所示的DNA片段； b)与a)限定的核苷酸序列 具有99以上、 95以上、 90以上、 85以上或 者80以上的同源性， 且来自于水稻并具有启动 子功能的DNA片段； c)在严谨条件下与a)或b)限 定的核苷酸序列杂交， 且具有启动子功能的DNA 片 段 。 通 过 实 验 验 。

3、证明 ： 本 发 明 的 启动 子 POs01g0699100可有效启动目的基因在维管束中 特异性表达， 从而有效避免外源基因在植物其他 组织中持续表达所带来的不利影响。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 110885820 A 2020.03.17 CN 110885820 A 1.DNA分子， 是下述a)-c)中的任一DNA片段： a)SEQ ID No.1所示DNA片段； b)与a)限定的核苷酸序列具有99以上、 95以上、 90以上、 85以上或80以上同 源性， 且来源于水稻并具有启动子功能的DNA片段； c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交， 且具。

4、有启动子功能的DNA片段。 2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌。 3.根据权利要求2所述的表达盒， 其特征在于： 所述表达盒由具有启动子功能的所述 DNA分子和所述DNA分子启动表达的目的基因， 以及转录终止序列组成； 所述DNA分子以功能 性方式与所述目的基因连接， 且所述目的基因与所述转录终止序列连接。 4.权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述重组载体、 表达盒、 转基因细胞系、 重组菌 在启动目的基因表达中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于： 所述启动目的基因表达为在植物中启动目 的基因表达。 6.根据权利要求5所述的应用，。

5、 其特征在于： 所述基因表达为维管束特异性表达。 7.权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌 在植物遗传改良中的应用。 8.根据权利要求5-7任一所述的应用， 其特征在于： 所述植物为单子叶植物或双子叶植 物。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于： 所述单子叶植物为禾本科植物。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于： 所述禾本科植物为水稻。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110885820 A 2 水稻维管束特异性表达的启动子POs01g0699100及其应用 技术领域 0001 本发明涉及植物分子生物学领域， 具体涉及水稻维管束。

6、特异性表达的启动子 POs01g0699100及其应用。 背景技术 0002 高等植物的生长发育是不同基因在不同时空有序表达和协同作用的结果。 启动子 是基因表达的重要顺式作用元件， 其通过与转录因子的结合进而决定了基因的表达模式与 表达强度。 根据启动子调控基因转录的模式不同将其分为组成型、 诱导型和组织特异性启 动子三种类型。 0003 组织特异性启动子是指具有器官和组织特异性启动目的基因转录的启动子， 在这 类启动子的驱动下， 基因的表达往往只限定某些特定的器官和组织部位， 并表现出发育调 节等特性。 组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织中积累， 增 加区域性表达量。

7、， 采用组织特异性表达启动子来驱动目的基因的表达可有效地避免由组成 型表达启动子所带来的一些诸如代谢负担之类的负面效应。 但是目前调控机理清楚且可用 于作物遗传改良的组织特异性表达启动子较少， 需要开发和应用。 发明内容 0004 本发明的一个目的是提供一种具有维管束特异性启动子功能的DNA分子。 0005 本发明所提供的具有启动子功能的DNA分子， 命名为POs01g0699100启动子， 来源 于水稻(Oryza sativa)， 是下述a)-c)中任一的DNA片段： 0006 a)SEQ ID No.1所示DNA片段； 0007 b)与a)限定的核苷酸序列具有90以上同源性， 且具有启动。

8、子功能的DNA片段； 0008 c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交， 且具有启动子功能的DNA片段。 0009 上述严格条件可为在6SSC， 0.5SDS的溶液中， 在65下杂交， 然后用2SSC， 0.1SDS和1SSC， 0.1SDS依次洗膜一次。 0010 其中， SEQ ID No.1共由2309个核苷酸组成。 0011 含有所述DNA分子(启动子)的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌也属于本 发明的保护范围。 0012 其中， 所述重组载体可为重组表达载体， 也可为重组克隆载体。 0013 在本发明的一个实施例中， 所述重组载体具体为将SEQ ID No.1所示。

9、的DNA分子插 入pCAMBIA1391Z载体的HindIII和EcoRI酶切位点间， 且保持pCAMBIA1391Z载体的其他序列 不变得到的载体。 0014 所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子， 由所述DNA分子启动表达的目的基 因及转录终止序列组成； 所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接， 且所述目的基因 与所述转录终止序列连接。 0015 在本发明的一个实施例中 ， 所述目的基因具体为GUS基因 (来源于所述 说明书 1/6 页 3 CN 110885820 A 3 pCAMBIA1391Z载体)； 所述转录终止序列具体为NOS转录终止子(来源于所述pCAMBIA139。

10、1Z 载体)。 0016 本发明的另一个目的是提供POs01g0699100启动子或上述重组载体、 表达盒、 转基 因细胞系、 重组菌的新用途。 0017 本发明提供了POs01g0699100启动子或上述重组载体、 表达盒、 转基因细胞系、 重 组菌在启动目的基因表达中的应用。 0018 在所述应用中， 所述启动目的基因表达为在植物中启动目的基因表达。 0019 进一步地， 所述表达为维管束特异性表达。 0020 进一步地， 所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。 0021 更进一步地， 所述单子叶植物可为禾本科植物。 0022 更加具体地， 所述禾本科植物可为水稻， 如水稻品种日本晴。 00。

11、23 上述POs01g0699100启动子或上述重组载体、 表达盒、 转基因细胞系、 重组菌在植 物遗传改良中的应用也属于本发明的保护范围。 0024 本发明与现有技术相比， 具有如下优点： 0025 (1)本发明的水稻维管束特异性表达启动子为POs01g0699100， 其来源于水稻粳稻 品种日本晴， 该启动子片段大小为2309bp， 所述POs01g0699100启动子具有以下特点： a)位 于Os01g0699100基因的5 端及其上游； b)碱基长度为2309bp； c)具有引发转录的必要位点 及转录起始点； d)在水稻维管束中特异性表达。 本发明提供启动子能够有效控制目的基因 特异表。

12、达于维管束， 在其他器官组织中不表达， 可避免外源基因在植物其他组织中持续表 达所带来的不利影响， 例如转基因漂移和花粉逃逸所带来的生物安全问题。 0026 (2)本发明的含有维管束特异表达启动子POs01g0699100的重组表达载体， 转入了 维管束特异表达的启动子， 在重组表达载体的维管束特异表达启动子POs01g0699100调控 下使下游基因定位于维管束表达， 为植物基因工程领域研究基因在维管束特异表达提供了 工具， 具有广泛的应用前景。 0027 通过实验证明： 本发明提供启动子POs01g0699100可有效启动目的基因在水稻维 管束中的特异性表达， 在其他器官组织中不表达， 可。

13、避免目的基因在植物其他组织中持续 表达所带来的不利影响， 还可以用于植物维管束生长发育相关基因的功能分析和鉴定。 其 不仅为转基因水稻育种服务， 也为长远的启动子改造和设计储备资源。 附图说明 0028 图1为POs01g0699100启动子分子检测结果图。 A为PCR结果； B为双酶切结果； M： DL5000Marker； 1： PCR扩增的2309bp条带； 2： HindIII和EcoRI双酶切的2309bp条带和1875bp 条带。 0029 图2为表达载体pCAMBIA1391Z-POs01g0699100的T-DNA区图谱。 其中， A为表达载体 pCAMBIA1391Z-POs。

14、01g0699100， LB和RB分别表示T-DNA的左边界和右边界， Hyg表示潮霉素 抗性基因， POs01g0699100表示启动子， NOS表示基因的终止子； B为表达载体pCAMBIA1391Z 的多克隆位点图(MCS)。 0030 图3为GUS基因的组织化学染色结果图。 其中， A表示根(上部是根段， 下部是横切 面)； B表示茎(横切面)； C表示叶(上部为叶段， 下部为横切面)； D为颖壳和种子。 说明书 2/6 页 4 CN 110885820 A 4 具体实施方式 0031 本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。 应该理解， 这些实施例仅用于说明 目的， 而不用于限制本发。

15、明范围。 0032 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0033 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径购置得到。 0034 下述实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平均值。 0035 下述实施例中的GUS染色液(pH7.0)： 溶剂为200mmol/L PBS缓冲液， 溶质及其在染 色液中的浓度分别为： 100mmol/L亚铁氰化钾、 100mmol/L氰化钾、 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)、 10mg/ml X-Gluc、 0.1(体积比)Triton X-100。 0036 下述实施例中所用引物均由北京睿博兴。

16、科生物技术有限公司合成， 睿博兴科生物 技术有限公司测序； Taq酶、 Trans5 感受态及相关的试剂盒均购自北京全式金生物技术有 限公司； pTOPO-Blunt Simple平末端克隆试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司； 限制 性内切酶HindIII和EcoRI、 T4连接酶均购自赛默飞世尔科技公司； 抗生素购自美国Sigma公 司； pCAMBIA1391Z载体和农杆菌AGL1均购自北京博艾永华生物科技有限公司； 其余试剂均 为国产分析纯。 0037 实施例1水稻维管束特异性启动子POs01g0699100的克隆 0038 1、 引物的设计 0039 根据NCBI网站上公布的POs0。

17、1g0699100启动子全长序列， 设计PCR扩增该片段的引 物， 上游引物加HindIII的AAGCTT酶切位点， 下游引物加EcoRI的GAATTC酶切位点。 0040 引物序列如下： 0041 引物1(上游引物)： 5 -TATAAGCTTTGGTATGTGTTGACTTGGGC-3 ； 0042 引物2(下游引物)： 5 -GGAATTCGTGGGTGTTGTTGGACTTCG-3 。 0043 2、 PCR扩增 0044 以全式金公司植物基因组试剂盒提取的水稻日本晴基因组DNA为模板， 用步骤1中 设计的上游引物和下游引物进行PCR扩增， 得到PCR产物。 0045 PCR反应条件如。

18、下： 98预变性2min， 98变性10s， 54退火30s， 72延伸 2min30s， 共32个循环； 72延伸8min。 0046 3、 PCR产物检测 0047 PCR反应结束后， 用1琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物； 然后回收并纯化目的DNA片 段； 参照pTOPO-Blunt Simple平末端克隆试剂盒的操作说明， 将回收的目的DNA片段与 pTOPO平末端克隆载体连接， 得到重组载体pTOPO Cloning Vector-POs01g0699100； 将重组 载体pTOPO Cloning Vector-POs01g0699100转化到大肠杆菌感受态Trans5 细胞中； 经P。

19、CR 和酶切检测筛选阳性克隆并进行测序验证。 0048 结果表明， PCR扩增得到大小为2309bp的DNA片段(图1)， 测序该2309bp的DNA片段， 其核苷酸序列如序列表1所示， 将序列表1所示的核苷酸序列命名为POs01g0699100， 其由 2309个碱基组成。 0049 实施例2 POs01g0699100启动子的功能验证 0050 一、 转基因株系的获得 0051 1、 表达载体的构建 说明书 3/6 页 5 CN 110885820 A 5 0052 用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切实施例1步骤3中的重组载体pTOPO Cloning Vector-POs01。

20、g0699100， 得到POs01g0699100片段； 用限制性内切酶HindIII和 EcoRI双酶切pCAMBIA1391Z载体， 得到pCAMBIA1391Z载体骨架片段； 将POs01g0699100片段 与pCAMBIA1391Z载体骨架片段进行连接， 获得重组质粒pCAMBIA1391Z-POs01g0699100(图 2)。 0053 重组质粒pCAMBIA1391Z-POs01g0699100为将SEQ ID No.1(序列表1)所示的 POs01g0699100启动子插入pCAMBIA1391Z载体的HindIII和EcoRI酶切位点间， 且保持 pCAMBIA1391Z载。

21、体的其他序列不变得到的载体； POs01g0699100启动子用于启动 pCAMBIA1391Z载体中GUS基因的表达。 0054 2、 将重组质粒pCAMBIA1391Z-POs01g0699100导入农杆菌AGL1。 0055 3、 取步骤2制备的农杆菌重悬于液体共培养基(AAM液体培养基+50mg/L乙酰丁香 酮， pH5.2)中培养， 经调整得到OD600nm0.15的菌液。 0056 4、 取水稻材料日本晴(水稻材料日本晴购自中国农业科学院生物技术研究所)的 胚性愈伤组织， 用步骤3得到的菌液浸泡30min， 然后经共培养、 筛选、 生根、 壮苗， 得到T0代 转基因植株。 0057。

22、 5、 提取T0代转基因植株的DNA， 利用实施例1中的引物1和引物2进行PCR扩增， PCR 程序同上。 PCR扩增得到大小为2309bp的DNA片段即为阳性转POs01g0699100启动子植株。 最 终经PCR检测获得的18株T0代转基因植株中共有17株阳性转POs01g0699100启动子植株。 0058 二、 转POs01g0699100启动子植株的染色 0059 分别对阳性转POs01g0699100启动子植株不同部位进行GUS组织化学染色。 具体操 作步骤如下： 取阳性转POs01g0699100启动子植株的不同组织(根、 茎、 叶、 颖壳和种子)， 并 将各组织块移入加有适量的。

23、GUS染色液的试管中， 使GUS染色液浸没组织块， 37下保存4- 12h； 染色结束后， 将染色组织先置于75乙醇漂洗脱色， 再依次用50和20乙醇分别浸 泡20min以上， 直到材料呈白色； 最后在显微镜下观察染色处理过的组织块或组织块的切 片， 组织部位被染成蓝色即为GUS基因在该组织部位得到了表达。 0060 染色结果如图3所示。 其中， A表示根(上部是根段， 下部是横切面)； B表示茎(横切 面)； C表示叶(上部为叶段， 下部为横切面)； D为颖壳和种子。 从图中可以看出， GUS基因只在 转POs01g0699100启动子植株的维管束中特异性表达， 而在表皮、 叶肉和胚乳等部位。

24、都没有 不表达。 说明本发明的启动子POs01g0699100仅在水稻维管束中特异性表达， 可用于启动目 的基因在维管束中特异性表达。 说明书 4/6 页 6 CN 110885820 A 6 0061 说明书 5/6 页 7 CN 110885820 A 7 0062 说明书 6/6 页 8 CN 110885820 A 8 序列表 河北科技大学 水稻维管束特异性表达的启动子Pos01g0699100及其应用 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 2309 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 tggtatgtgt tgacttgggc cgtgg。

25、accat tgaatcgaac gtcgagttcg gcgtcgcagc 60 aaagcgatcg agcccctctg tctctctctc tctctctctc gcagatctcc agacgttcgg 120 tagttcggtt catgtgcaca ttgcacaagc cgccttgaaa aacgcagctc cctgcctccc 180 ttcaacgcgt ttgcaacgtg caggcaggca ggatctacga cgttgtgccg caccgacggg 240 tgtggtttgg ggccaacccg agatcggctc atgcagtcgc gcgc。

26、tcgccg aatcaaaccc 300 ggcgtccggc tcgaccgggt tcgcgttcgt cggcgagctt ttagcttctg ttgttgtctc 360 tcgtctggct cctgtgcgtt cgcgaccgcg catcaatcat accgagcagg cgcgcgtgcc 420 gcccgccggt ttggcggcga ggcgggatgc gtgacgagtt tttgccagtt cgagcggcgc 480 tgggacgcac gcgcgcgcgg gcgcggcgtg ctgcgctctc cgacgacgag gaggcccacc 54。

27、0 aggccaccac caccttgtat gttggggggg cacgagaccg caagagggaa tgaaccgtga 600 acgtacgatg caaaagcgag cggacaaggc ggcattgcgg ccaggcatct cgtgctcgct 660 gtgcggaatg gaagcggaat ggaaggggat gatgcatccg atctgacgca taccccaact 720 gctagtgcac tgcagtgcag ggcagtgcag cgcagcgcag cgcgttgctg catgccaggt 780 cggtctggcc ctctggc。

28、cca tttggccgcc gacctctccc aaaaaatatg caggcatcca 840 cctgcacgaa actgcgaggt ccgattcctt tattggtcgg agacaagaga gtgttgccag 900 ttccccccac cgattaatcc caagagcaat ccggatgaac aagcaagcca cagcaggtaa 960 ctaggtaagc tgtggcgtct aagttctaac tgtaacactc agatagctgg ctgcttgcta 1020 gtaggtgaat gcaccaactc ctgaacggaa ttgg。

29、tcacat tcggaggaag agggacctga 1080 atggccgaat acctgatcta taatctgaac ttgacccaaa tttgatccca ccaaagtcgt 1140 tacaggattt ttctcaggat gttgttgggc caaagtacaa ccgtagaagt catgtactac 1200 cttacctgct cgtccgggtg ggtttggtgg agcaaactgc cgcttacccc gaactaccat 1260 aattctgttg cagactcaca aagccacaat gtcaaaccat caggcagca。

30、g ccatttatgt 1320 cccttccccc acaaaaaaga cccctttagg cgcatgcgtt gacccccccc cccccccccg 1380 ggacctggca tgtttatatt gcgttgagct atagtgcctt ccaatgtcag ccgaatcacc 1440 aaacacttgg cccgctagac tttgctttcg ctgcgctctc tctctctctc accgtgtacg 1500 accgacgacg ggggaagagg ttgttcggca aagccgttgt acgtccaatc ttgactggtg 156。

31、0 ccgcggcacc gctgattaat tgggcacaac cgatgaacta aaaacgggat cgcacaatct 1620 tggcccgtgc tgcaaaggcg attagattag cgagcaccgc acacccgaac gccaaatttt 1680 序列表 1/2 页 9 CN 110885820 A 9 gatagctaag ctcgtgtttc ataccgtgat acggcacgga gtactgctat tttggctctt 1740 aactaatgct agctctacgc acgacctata cgactctgca gaaattaaca t。

32、cttgaccgt 1800 tttctaattt ctaatcgtca atttggataa cacactagca cagtagcaac atctcgtgtt 1860 tctcgttcac aggcacctga gaaacgcata aatgcagcgt tttcccactg caaaggcaag 1920 gaggccgtcc gttgatgagc cggtcgttaa ttagccgcgc gttcccaccc acacacacac 1980 gcgaacacgc gcagtccagt agccgcgcgt gcccacgacg caccacccac acacactttc 2040 t。

33、gcccccgcc catcgccaag ttgagcatcc acgcacacca aacaccttgc acatttccta 2100 atcttaacac ccccacccaa ttaacgccaa gtcgtcttct ccttcgcctt cccctctcca 2160 ccctttgtat ataaacgcac acaagcgctc ggaaagccaa ctcagaccga acaaaaggat 2220 caccagctca gagctcacca ccaccaccac caacaacaac aacaacgcat tgcaaagcaa 2280 ggagaaatcc gaagtccaac aacacccac 2309 序列表 2/2 页 10 CN 110885820 A 10 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 11 CN 110885820 A 11 。