防治畜禽腹泻的中药微生态制剂及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911136334.0 (22)申请日 2019.11.19 (83)生物保藏信息 CCTCC NO:M2019722 2019.09.16 (71)申请人 大连三仪动物药品有限公司 地址 116036 辽宁省大连市甘井子区营旭 路9号 申请人 江苏三仪生物工程有限公司 (72)发明人 江国托刘艳顾艳丽单春乔 刘秋晨王效禹林洋曹艳子 (74)专利代理机构 北京英创嘉友知识产权代理 事务所(普通合伙) 11447 代理人 耿超 (51)Int.Cl. A61K 36/84(2。

2、006.01) A61P 1/12(2006.01) A61P 31/04(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种防治畜禽腹泻的中药微生态制剂及其 制备方法 (57)摘要 本发明提供了一种防治畜禽腹泻的中药微 生态制剂的制备方法， 该制备方法包括： 在培养 基中接种种子液进行发酵； 所述培养基含有复方 中药提取液和基质培养基， 所述种子液含有中药 发酵菌种； 本发明还提供了一种防治畜禽腹泻的 中药微生态制剂和一种凝结芽胞杆菌CCTCCNO： M2019722。 该中药微生态制剂主要用于防治畜禽 腹泻， 疗效确切， 经。

3、过微生物的发酵， 不仅大大减 少了中药的使用量， 节省养殖户的管理成本， 而 且具有良好的预防和治疗效果。 权利要求书2页 说明书9页 附图1页 CN 110787247 A 2020.02.14 CN 110787247 A 1.一种防治畜禽腹泻的中药微生态制剂的制备方法， 其特征在于， 该制备方法包括： 在 培养基中接种种子液进行发酵； 所述培养基含有复方中药提取液和基质培养基， 所述种子 液含有中药发酵菌种； 其中， 所述复方中药由穿心莲、 白头翁、 黄连、 黄柏、 木香、 败酱草和甘草组成； 所述中药 发酵菌种包括： 保藏号为CCTCC NO： M2019722的凝结芽孢杆菌(Baci。

4、llus coagulans)、 保藏号为CGMCC NO： 2196的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、 商品号为CICC NO： 10020的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、 商品号为CICC NO： 31170的产朊假丝酵母(Candida utilis)、 商品号为ACCC NO： 20039的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、 商品号为CICC NO： 24498的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和 商品号为ACCC NO： 10649的沼泽红假单胞菌(Rhodosedoseudomouas 。

5、padustris)。 2.根据权利要求1所述的中药微生态制剂的制备方法， 其中， 所述复方中药提取液通过如下操作制备得到： 将所述复方中药进行烘干和粉碎后用10 20倍体积的乙醇水溶液在60-70下进行5070min的提取， 得到复方中药的乙醇提取 物， 然后将所述提取物进行浓缩， 得到浓缩后的物料； 所述乙醇水溶液含有6585体积的 乙醇； 所述浓缩后的物料为含有0.5-2g/ml生药量的药液。 3.根据权利要求1所述的中药微生态制剂的制备方法， 其中， 所述发酵为高密度液体深 层发酵； 发酵的温度为3037， 时间为25天。 4.根据权利要求1所述的中药微生态制剂的制备方法， 其中， 以。

6、重量份计， 所述复方中 药含有： 穿心莲1025份、 白头翁525份、 黄连412份、 黄柏520份、 木香412份、 败酱 草420份和甘草412份。 5.根据权利要求1所述的中药微生态制剂的制备方法， 其中， 以重量份计， 所述复方中 药含有： 穿心莲1520份、 白头翁1020份、 黄连610份、 黄柏1015份、 木香610份、 败 酱草1018份和甘草510份。 6.根据权利要求1所述的中药微生态制剂的制备方法， 其中， 所述种子液中的所述凝结 芽孢杆菌、 所述粪肠球菌、 所述枯草芽孢杆菌、 所述产朊假丝酵母、 所述植物乳杆菌、 所述丁 酸梭菌和所述沼泽红假单胞菌的活菌数量比为(10。

7、25)： (515)： (1025)： (1025)： (1020)： (515)： (515)； 优选为(1620)： (1013)： (1620)： (1620)： (1215)： (1013)： (912)； 所述种子液通过包括如下操作的方法制备得到： 将所述凝结芽孢杆菌、 所述粪肠球菌、 所述枯草芽孢杆菌、 所述产朊假丝酵母、 所述植物乳杆菌、 所述丁酸梭菌和 所述沼泽红假单胞菌分别进行培养得到培养液后混合。 7.根据权利要求1所述的中药微生态制剂的制备方法， 其中， 所述培养基含有5-20体积 ()的复方中药提取液和余量的所述基质培养基； 所述基质培养基含有： 红糖1050g/L、 。

8、葡萄糖1050g/L、 蜂蜜1050g/L、 蛋白胨15g/L、 磷酸氢二钾15g/L、 乙酸钠15g/L、 硫酸镁0.11g/L、 L-半胱氨酸0.11g/L、 硫酸锰0.050.3/L、 碳酸钙0.13g/L； 所述基 质培养基的pH为6.08.0。 8.一种防治畜禽腹泻的中药微生态制剂， 其特征在于， 该中药微生态制剂根据权利要 求17任意一项权利要求所述的制备方法制得； 所述中药微生态制剂的剂型为散剂、 颗粒 权利要求书 1/2 页 2 CN 110787247 A 2 剂、 粉剂和溶液剂中的其中一种。 9.根据权利要求8所述的中药微生态制剂， 其中， 相对于1g中药微生态制剂或者1m。

9、L中 药微生态制剂， 活菌总数为(510)108cfu。 10.一种凝结芽胞杆菌， 其特征在于， 该凝结芽孢杆菌的保藏号为CCTCC NO： M2019722。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110787247 A 3 一种防治畜禽腹泻的中药微生态制剂及其制备方法 技术领域 0001 本申请涉及畜牧业和生物技术领域， 具体地， 涉及防治畜禽腹泻的中药微生态制 剂及其制备方法。 背景技术 0002 国家农业部公布在关于2018-2021年开展兽用抗菌药使用减量化行动试点工作的 通知中指出药物饲料添加剂将在2020年全部退出， 这意味着饲料的 “全程无抗” ， 也就更加 突出了种源净化， 提高。

10、畜禽免疫力的重要性。 同时， 由于免疫性疾病的普遍存在， 使用疫苗 免疫使体液免疫和细胞免疫功能遭受到严重损害， 这也降低了疫苗的防护作用。 0003 畜禽腹泻主要的病原菌为大肠杆菌和沙门氏菌。 由大肠杆菌引起的猪黄白痢、 禽 大肠杆菌病等是目前危害养殖业严重的疾病， 给集约化养鸡生产造成严重的经济损失， 有 效做好大肠杆菌病的防治工作已经成为集约化养鸡业迫切需要解决的重要问题之一。 由沙 门氏菌引起的鸡白痢和禽伤寒在养禽业中对鸡群的影响严重， 由于密集饲养， 导致整个养 鸡周期都受到危害。 0004 目前抗生素对于大肠杆菌病的治疗， 已导致大肠杆菌的耐药谱不断扩大， 防治效 果下降， 同时抗。

11、菌药物在机体内的残留， 易引起菌群失调， 既降低了肉蛋产品品质， 也影响 了人类健康和公共卫生安全。 而传统的中药复方， 由于药效吸收慢， 在提高免疫力方面的作 用不明显， 对突发事件的处理效果也不及时。 因此， 对于畜禽腹泻的防治， 亟待寻找一种能 够有效抑制致病菌、 替代抗生素的制剂。 发明内容 0005 本公开的目的在于提供一种既能够有效抑制畜禽腹泻的致病菌， 又能够替代抗生 素的制剂及其制备方法。 0006 为了实现上述目的， 本公开提供了一种防治畜禽腹泻的中药微生态制剂的制备方 法， 该制备方法包括： 在培养基中接种种子液进行发酵； 所述培养基含有复方中药提取液和 基质培养基， 所述。

12、种子液含有中药发酵菌种； 0007 其中， 所述复方中药由穿心莲、 白头翁、 黄连、 黄柏、 木香、 败酱草和甘草组成； 所述 中药发酵菌种包括保藏号为CCTCC NO： M2019722的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、 保藏号为CGMCC NO： 2196的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、 商品号为CICC NO： 10020 的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、 商品号为CICC NO： 31170的产朊假丝酵母(Candida utilis)、 商品号为ACCC NO： 20039的植物乳杆菌(Lactobacillus 。

13、plantarum)、 商品号为 CICC NO： 24498的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和商品号为ACCC NO： 10649的沼泽红 假单胞菌(Rhodosedoseudomouas padustris)。 0008 可选地， 所述复方中药的提取液通过如下操作制备得到： 将所述复方中药进行烘 干和粉碎后用1020倍体积的乙醇水溶液进行5070min的提取， 得到复方中药的乙醇提 取物， 然后将所述提取物进行浓缩， 得到浓缩后的物料； 所述乙醇水溶液含有6585体积 说明书 1/9 页 4 CN 110787247 A 4 的乙醇； 所述浓缩后的物料为含有0.5-。

14、2g/ml生药量的药液。 0009 可选地， 所述发酵为高密度液体深层发酵； 发酵的温度为3037， 时间为25 天。 0010 可选地， 以重量份计， 所述复方中药含有： 穿心莲1025份、 白头翁525份、 黄连4 12份、 黄柏520份、 木香412份、 败酱草420份和甘草412份。 0011 可选地， 以重量份计， 所述复方中药含有： 穿心莲1520份、 白头翁1020份、 黄连 610份、 黄柏1015份、 木香610份、 败酱草1018份和甘草510份 0012 可选地， 所述种子液中的所述凝结芽孢杆菌、 所述粪肠球菌、 所述枯草芽孢杆菌、 所述产朊假丝酵母、 所述植物乳杆菌、 。

15、所述丁酸梭菌和所述沼泽红假单胞菌的活菌数量比 为(1025)： (515)： (1025)： (1025)： (1020)： (515)： (515)； 优选为(1620)： (1013)： (1620)： (1620)： (1215)： (1013)： (912)； 所述种子液通过包括如下操 作的方法制备得到： 将所述凝结芽孢杆菌、 所述粪肠球菌、 所述枯草芽孢杆菌、 所述产朊假 丝酵母、 所述植物乳杆菌、 所述丁酸梭菌和所述沼泽红假单胞菌分别进行培养得到培养液 后混合。 0013 可选地， 所述培养基含有5-20体积()的复方中药的提取液和余量的所述基质培 养基； 所述基质培养基含有： 红。

16、糖1050g/L、 葡萄糖1050g/L、 蜂蜜1050g/L、 蛋白胨1 5g/L、 磷酸氢二钾15g/L、 乙酸钠15g/L、 硫酸镁0.11g/L、 L-半胱氨酸0.11g/L、 硫酸 锰0.050.3/L、 碳酸钙0.13g/L； 所述基质培养基的pH为6.08.0。 0014 另一方面， 本公开提供了一种防治畜禽腹泻的中药微生态制剂， 该中药微生态制 剂根据上述的制备方法制得； 所述中药微生态制剂的剂型为散剂、 颗粒剂、 粉剂和溶液剂中 的其中一种。 0015 可选地， 相对于1g中药微生态制剂或者1mL中药微生态制剂， 活菌总数为(510) 108cfu。 0016 再一方面， 一。

17、种凝结芽胞杆菌， 该凝结芽孢杆菌的分类命名为Bacillus coagulans， 并且， 该凝结芽孢杆菌的保藏号为CCTCC NO： M2019722。 0017 通过上述技术方案， 本公开提供了中药微生态制剂及其制备方法， 该中药微生态 制剂主要用于防治畜禽腹泻， 疗效确切， 经过微生物的发酵， 不仅大大减少了中药的使用 量， 节省养殖户的管理成本， 而且治愈效果能够与抗生素相当， 不仅能够替代抗生素治疗细 菌性腹泻， 而且有提高动物免疫力的能力。 本公开还提供了一株凝结芽胞杆菌， 该菌株具有 良好的耐酸耐胆盐等抗逆性， 还能够产生大量的乳酸， 协助并提高中药对致病菌的抑制作 用， 在含药。

18、量很高的液体发酵培养基中生长良好， 为发酵中药方向提供一株有价值的菌株。 0018 本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。 0019 生物材料保藏信息 0020 凝结芽孢杆菌， 该凝结芽孢杆菌的分类命名为凝结芽孢杆菌SAM-NJH-1Bacillus coagulans SAM-NJH-1， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地址为： 湖北省武汉市武汉 大学， 保藏日期为2019年9月16日， 菌种保藏号为： CCTCC NO： M2019722。 附图说明 0021 图1为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)菌落形态及镜检图。 说明书 2/9 页 5。

19、 CN 110787247 A 5 具体实施方式 0022 以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。 应当理解的是， 此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开， 并不用于限制本公开。 0023 本公开提供了一种防治畜禽腹泻的中药微生态制剂的制备方法， 该制备方法包 括： 在培养基中接种种子液进行发酵； 所述培养基含有复方中药提取液和基质培养基， 所述 种子液含有中药发酵菌种； 0024 其中， 所述复方中药由穿心莲、 白头翁、 黄连、 黄柏、 木香、 败酱草和甘草组成； 所述 中药发酵菌种包括保藏号为CCTCC NO： M2019722的凝结芽孢杆菌(Bacillus coag。

20、ulans)、 保藏号为CGMCC NO： 2196的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、 商品号为CICC NO： 10020 的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、 商品号为CICC NO： 31170的产朊假丝酵母(Candida utilis)、 商品号为ACCC NO： 20039的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、 商品号为 CICC NO： 24498的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和商品号为ACCC NO： 10649的沼泽红 假单胞菌(Rhodosedoseudomouas padustr。

21、is)。 0025 可选地， 该中药微生态制剂的制备方法具体包括以下步骤： 0026 所述复方中药的提取液通过如下操作制备得到： 将所述复方中药进行烘干和粉碎 后用1020倍体积的乙醇水溶液进行5070min的提取， 得到复方中药的乙醇提取物， 然后 将所述提取物进行浓缩， 得到浓缩后的物料。 所述乙醇水溶液含有6585体积的乙醇； 所 述浓缩后的物料为含有0.5-2g/ml生药量的药液。 0027 可选地， 所述发酵为高密度液体深层发酵； 发酵的温度为3037， 时间为25 天。 0028 畜禽腹泻按中兽医理论多属于湿热泄泻症， 一般由外感暑湿， 疫毒之邪， 湿热内 侵， 致使胃肠运化失调，。

22、 血瘀气滞， 湿热泄泻。 本公开从具有抑菌功能的单味中药中筛选出 对致病性大肠杆菌、 沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抑菌能力强的几味中药并做成复方中药。 0029 其中， 复方中药的具体筛选方法包括： 将具有抑菌功能的单味中药按照不同的组 合配比配制成不同的复方中药， 将各组合物提取后减压浓缩至1g/ml， 待测， 在灭菌的平板 中倒入15ml营养琼脂固体培养基(成分为： 蛋白胨10g、 牛肉膏5g、 NaCl 5g、 琼脂18g、 蒸馏水 1000mL， pH7.0)。 将过夜培养的致病性大肠杆菌、 沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌菌液与营养琼 脂培养基(含1.5琼脂， w/v)混匀， 使其指示菌浓度稀。

23、释2107CFU/ml左右， 取5ml倾注于 制备好的营养琼脂平板中。 将牛津杯用镊子轻轻放置于平板上， 将200 l药液加入牛津杯后 静置30min， 于37培养16h， 用游标卡尺测量抑菌圈大小。 0030 通过上述筛选方法， 最终筛选出的对致病性大肠杆菌、 沙门氏菌和金黄色葡萄球 菌菌有良好抑制作用的复方中药， 采用如下重量份的组分： 穿心莲1025份、 白头翁525 份、 黄连412份、 黄柏520份、 木香412份、 败酱草420份和甘草412份； 优选为穿心 莲1520份、 白头翁1020份、 黄连610份、 黄柏1015份、 木香610份、 败酱草1018份 和甘草510份。 诸。

24、药合用具有清热解毒、 燥湿止痢、 行气导滞的功效。 方中穿心莲和白头翁 为君药， 穿心莲入肺、 胃、 大肠、 膀胱经， 清热解毒、 凉血消肿， 对大肠杆菌有抑制作用； 白头 翁能够清热解毒、 凉血止痢， 其有效成分白头翁皂苷和香豆素类， 对绿脓杆菌、 金黄色葡萄 球菌、 副伤寒杆菌、 大肠杆菌有很好的抑菌效果； 该组合物以黄连之苦， 清热解毒、 燥湿厚 肠， 黄柏泻下焦湿热， 共奏燥湿止痢之效， 黄连和黄柏为臣药， 它们的有效成分小檗碱具有 说明书 3/9 页 6 CN 110787247 A 6 良好的抗菌、 抗炎、 抗病毒等生理活性； 方中败酱草归胃、 大肠、 肝经， 清热解毒， 对肠黄痢。

25、疾 有很好作用； 该复方中药中木香行气导滞、 健脾消食； 甘草调和诸药， 有解毒作用， 缓解病 症。 0031 发明人选出多株产酶能力强的芽孢菌、 产酸能力强并有一定抑菌作用的乳酸菌、 产纤维素酶和蛋白含量高的酵母菌等微生物作为目标菌株分别接种于添加520复方中 药提取液的液体培养基培养， 以含有中药提取物的液体发酵培养基中菌株的生长情况为指 标进行初筛， 选择3株芽孢杆菌、 3株乳酸菌、 2株产朊假丝酵母和1株光合菌作为目标菌种。 0032 将初筛的9株菌做共培养实验， 考察相互之间的作用关系。 选取菌种间互惠共生、 或无关共栖关系的7株菌作为中药发酵菌种， 分别为： 保藏号为CCTCC N。

26、O： M2019722的凝结 芽孢杆菌(Bacillus coagulans)(本文记载)、 保藏号为CGMCC NO： 2196的粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)(已由CN101220342B公开)、 商品号为CICC NO： 10020的枯草芽孢 杆菌(Bacillus subtilis)(购自CICC)、 商品号为CICC NO： 31170的产朊假丝酵母(Candida utilis)(购自CICC)、 商品号为ACCC NO： 20039的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) (购自ACCC)、 保藏号为CICC NO： 24498的丁。

27、酸梭菌(Clostridium butyricum)(购自CICC)和 商品号为ACCC NO： 10649的沼泽红假单胞菌(Rhodosedoseudomouas padustris)(购自 ACCC)。 0033 其中， 所述种子液中的所述凝结芽孢杆菌、 所述粪肠球菌、 所述枯草芽孢杆菌、 所 述产朊假丝酵母、 所述植物乳杆菌、 所述丁酸梭菌和所述沼泽红假单胞菌的活菌数量比为 (1025)： (515)： (1025)： (1025)： (1020)： (515)： (515)； 优选为(1620)： (1013)： (1620)： (1620)： (1215)： (1013)： (912。

28、)； 所述种子液通过包括如下操 作的方法制备得到： 将所述凝结芽孢杆菌、 所述粪肠球菌、 所述枯草芽孢杆菌、 所述产朊假 丝酵母、 所述植物乳杆菌、 所述丁酸梭菌和所述沼泽红假单胞菌分别进行培养得到培养液 后混合。 0034 可选地， 所述培养基含有5-20体积的复方中药提取液和余量的所述基质培养 基； 所述基质培养基含有： 红糖1050g/L、 葡萄糖1050g/L、 蜂蜜1050g/L、 蛋白胨1 5g/L、 磷酸氢二钾15g/L、 乙酸钠15g/L、 硫酸镁0.11g/L、 L-半胱氨酸0.11g/L、 硫酸 锰0.050.3/L、 碳酸钙0.13g/L； 所述基质培养基的pH为6.08。

29、.0。 0035 另一方面， 本公开还提供了一种防治畜禽腹泻的中药微生态制剂， 所述中药微生 态制剂的剂型为散剂、 颗粒剂、 粉剂和溶液剂中的其中一种。 0036 可选地， 相对于1g中药微生态制剂或者1mL中药微生态制剂， 活菌总数为(510) 108cfu。 0037 本公开中的凝结芽胞杆菌、 粪肠球菌、 植物乳杆菌和丁酸梭菌本身就有降低肠道 pH值， 抑制腐败菌生长作用， 所产生的细菌素抑制或杀死肠道内的病原菌、 维持菌群平衡； 本公开中的芽孢杆菌、 酵母菌所产生的多种酶类， 不仅能够增强动物消化酶活性， 提高饲料 利用率， 而且能够拮抗动物机体病原菌， 增强机体免疫力和抗病能力， 对防。

30、治消化系统疾病 起到积极作用。 各菌种混合发酵中药复方提取物， 在发酵过程中产生的纤维素酶、 半纤维素 酶、 果胶酶等物质对中草药的细胞进行破壁使有效物质溶出， 同时中药成分经过微生物的 转化， 大分子物质转变成易吸收的小分子物质， 使血液中的有效成分迅速达到有效浓度， 使 发酵过的中药复方进入动物体后直接起到药效， 不存在分解转化过程， 改变中药药效慢的 说明书 4/9 页 7 CN 110787247 A 7 说法。 0038 再一方面， 本公开还提供了一种凝结芽孢杆菌， 该凝结芽孢杆菌的分类命名为 Bacillus coagulans， 并且， 该凝结芽孢杆菌的保藏号为CCTCC NO：。

31、 M2019722。 该菌株代谢 产生的乳酸对大肠杆菌、 沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均表现出很强的抑制能力。 0039 凝结芽孢杆菌CCTCC NO： M2019722的形态特征(图1)为： 菌落扁平、 微黄、 两端略有 拉伸； 革兰氏阳性； 镜检其芽胞体端生、 呈椭圆形， 菌体呈细杆状。 0040 对凝结芽孢杆菌CCTCC NO： M2019722的基因组进行16S rDNA扩增和测序， 发现该 菌株与10种凝结芽胞杆菌的同源性在99.65以上， 该菌株被鉴定为Bacillus coagulans (凝结芽孢杆菌)， 保藏至中国典型培养物保藏中心， 保藏号为： CCTCC NO： M20197。

32、22。 0041 以下结合实施例进一步详细说明本发明， 但是本发明的范围并不限制于以下实施 例中。 0042 实施例中使用的营养琼脂固体培养基成分包括： 蛋白胨10.0g/L、 牛肉膏5.0g/L、 NaCl 5.0g/L、 琼脂18g/L、 pH7.0。 0043 LB培养基成分包括： 胰化蛋白胨10.0g/L， 酵母提取物5.0g/L， NaCl10.0g/L。 0044 MRS培养基成分包括： 酪蛋白胨10.0g/L， 牛肉膏10.0g/L， 酵母粉5.0g/L， 葡萄糖 5.0g/L， 乙酸钠5.0g/L， 柠檬酸二铵2.0g/L， Tween 80 1.0g/L， K2HPO4 2.。

33、0g/L， MgSO4.7H2O 0.2g/L， MnSO4.H2O 0.05g/L， CaCO3 20.0g/L， pH6.8。 0045 麦芽汁培养基成分包括： 5 B麦芽汁1.0L， 自然pH。 0046 TSA培养基成分包括： 胰蛋白胨15.0g， 大豆胨5.0g， 氯化钠5.0g， pH7.30.2。 0047 实施例1 0048 本实施例中使用的培养基成分包括20体积的复方中药提取液和余量的基质培 养基； 其中基质培养基含有： 红糖30g/L、 葡萄糖30g/L、 蜂蜜30g/L、 蛋白胨3g/L、 磷酸氢二钾 3g/L、 乙酸钠3g/L、 硫酸镁0.5g/L、 L-半胱氨酸0.5。

34、g/L、 硫酸锰0.15/L、 碳酸钙0.20g/L， pH 6.08.0。 0049 复方中药为： 穿心莲18份、 白头翁15份、 黄连8份、 黄柏12份、 木香8份、 败酱草15份 和甘草6份。 将复方中药于55下烘干2.5h， 粉碎， 按照1:15的体积比加入75乙醇水溶液 进行提取， 提取2次， 每次1h， 将中药原料提取产物于4静置24h后浓缩成含有1g/ml生药量 的药液。 得到所述复方中药提取液。 0050 将保藏号为CCTCC NO： M2019722的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、 保藏号 为CGMCC NO： 2196的粪肠球菌(Enterococc。

35、us faecalis)、 商品号为CICC NO： 10020的枯草 芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、 商品号为CICC NO： 31170的产朊假丝酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 商品号为ACCC NO： 20039的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、 商品号 为CICC NO： 24498的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和商品号为ACCC NO： 10649的沼泽 红假单胞菌(Rhodosedoseudomouas padustris)先于培养基各自扩大培养(枯草芽孢杆菌、 凝结芽孢杆菌培养基。

36、为LB培养基； 丁酸梭菌、 植物乳杆菌、 嗜酸乳杆菌培养基为MRS培养基； 产阮假丝酵母培养基为麦芽汁培养基； 沼泽红假单胞菌培养基为TSA培养基)至有效活菌数 15108cfu/mL， 然后按所述凝结芽孢杆菌、 所述粪肠球菌、 所述枯草芽孢杆菌、 所述产朊 假丝酵母、 所述植物乳杆菌、 所述丁酸梭菌和所述沼泽红假单胞菌的活菌数量比为2： 1： 2： 2： 1.5： 1： 1进行混合， 得到种子液， 在培养基中接种种子液进行发酵， 37下培养3天， 使发 说明书 5/9 页 8 CN 110787247 A 8 酵液中有效活菌数达到5.0108cfu/mL， 即得到所述防治畜禽腹泻的中药微生态。

37、制剂， 剂 型为溶液剂。 0051 对比例1 0052 本对比例按照实施例1的方法制备中药微生态制剂， 所不同的是将保藏号为CCTCC NO： M2019722的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)替换为购自中国工业微生物菌种保藏 中心的凝结芽胞杆菌CICC NO： 10069。 0053 对比例2 0054 本对比例按照实施例1的方法制备中药微生态制剂， 所不同的是将保藏号为CCTCC NO： M2019722的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)替换为购自潍坊易昊生物公司的凝结 芽胞杆菌菌粉(市售菌粉)。 0055 对比例3 0056 将18份穿心莲、 15。

38、份白头翁、 8份黄连、 12份黄柏、 8份木香、 15份败酱草和6份甘草 混合， 得到复方中药。 将复方中药于55下烘干2.5h， 粉碎， 按照1:15的体积比加入75乙 醇水溶液进行提取， 提取2次， 每次1h， 将中药原料提取产物于4静置24h后进行浓缩， 相对 于1g的所述复方中药， 所述浓缩后的物料的体积为1mL， 得到所述复方中药的提取液， 将制 得的所述复方中药的提取液作为防治畜禽腹泻的中药制剂。 0057 对比例4 0058 本对比例按照对比例3的方法制备中药制剂， 所不同的是复方中药包括18份穿心 莲、 15份白头翁、 8份黄连、 12份黄柏、 8份木香和6份甘草。 0059 。

39、对比例5 0060 本对比例按照对比例3的方法制备中药制剂， 所不同的是复方中药包括15份白头 翁、 8份黄连、 12份黄柏、 8份木香和6份甘草。 0061 对比例6 0062 购自福建宁德乐普生药业有限公司的白头翁散。 0063 对比例7 0064 购自大连三仪动物药品有限公司的硫酸新霉素。 0065 测试例1 0066 将实施例1中的凝结芽胞杆菌CCTCC NO： M2019722、 对比例1中的凝结芽胞杆菌 CICC NO： 10069和对比例2中的市售菌粉于LB培养基中各自扩大培养至有效活菌数15 108cfu/mL， 然后按照3接种量接入包括20体积的复方中药提取液和余量的基质培养。

40、基 中， 于50下， 180r/min摇瓶培养48h后， 活菌计数。 0067 将过夜培养的鸡大肠杆菌标准血清型(O78)菌液和金黄色葡萄球菌(金葡)菌液与 营养琼脂培养基(含1.5琼脂， w/v)混匀， 将各菌液浓度稀释至2107CFU/ml左右， 取5ml 倾注于制备好的营养琼脂平板中。 将牛津杯用镊子轻轻放置于接种不同菌株的平板上， 分 别将200 l经凝结芽胞杆菌CCTCC NO： M2019722、 凝结芽胞杆菌CICC NO： 10069和市售菌粉 的菌液发酵的复方中药发酵液加入牛津杯后静置30min， 于37培养16h， 用游标卡尺测量 测量其对鸡大肠杆菌标准血清型和金黄色葡萄球。

41、菌的抑菌圈大小， 如表1所示。 0068 表1 说明书 6/9 页 9 CN 110787247 A 9 0069 0070 由表1可以看出， 对比例1和对比例2中的凝结芽孢杆菌在本公开的培养基中生长 受到抑制， 而实施例1中的凝结芽胞杆菌CCTCC NO： M2019722不仅能在本公开的培养基中生 长良好， 有效活菌数达到1.63108CFU/ml； 还能够增强中药对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 的抑制能力。 0071 测试例2 0072 分别将过夜培养的鸡大肠杆菌标准血清型(O78)、 鸡大肠杆菌野株(O鸡)、 猪大肠杆 菌标准血清型(O139)、 猪大肠杆菌野株(O猪)、 致病性沙门氏菌(。

42、沙门)、 鸭大肠杆菌野株(O鸭) 和金黄色葡萄球菌(金葡)菌液与营养琼脂培养基(含1.5琼脂， w/v)混匀， 使其指示菌浓 度稀释为2107CFU/ml左右， 取5ml倾注于制备好的营养琼脂平板中。 0073 将牛津杯用镊子轻轻放置于接种不同菌株的平板上， 分别将200 l的中药微生态 制剂(1g/ml)和硫酸新霉素原粉稀释液(硫酸新霉素原粉加无菌水稀释成万分之四倍)加入 牛津杯后静置30min， 于37培养16h， 用游标卡尺测量抑菌圈大小。 0074 本测试例中使用的待测液为实施例1得到的防治畜禽腹泻的中药微生态制剂和对 比例7中购得的硫酸新霉素， 每组实验进行两次， 取均值， 具体结果。

43、见表2。 0075 表2 0076 0077 体外抑菌试验是检测药物对各种致病菌的抑菌能力， 是进行临床治疗的前提和基 础， 对大肠杆菌等致病菌的抑菌效果提供了非常有价值的素材与资料， 体外抑菌能力从侧 面也体现了药物的治疗效果。 通过表2数据可以看出， 本公开提供的中药微生态制剂的体外 抑菌试验与硫酸新霉素的体外抑菌试验比较， 对鸡大肠杆菌标准血清型(O78)、 鸡大肠杆菌 野株(O鸡)、 猪大肠杆菌标准血清型(O139)、 猪大肠杆菌野株(O猪)、 致病性沙门氏菌(沙门)、 鸭 大肠杆菌野株(O鸭)和金黄色葡萄球菌(金葡)的抑菌能力均显著增大， 说明本公开的中药微 说明书 7/9 页 10。

44、 CN 110787247 A 10 生态制剂对畜禽腹泻的致病菌抑菌能力非常好。 0078 测试例3 0079 选取山东省烟台市某养鸡场体重、 日龄相近的健康AA肉鸡400只， 雌雄各半。 进行 大肠杆菌和沙门氏菌混菌攻毒， 待鸡群发病后进行临床疗效验证。 0080 鸡群发病时临床症状主要表现为精神不振、 食欲废绝、 羽毛松乱、 闭眼倒卧， 扎堆 趴窝； 严重腹泻， 粪便呈灰白色、 水样； 肛门周围被粪便黏着、 偶有血便等。 0081 试验方法： 将鸡只随机分为8组， 每组50只： 空白对照组(阳性对照)， 攻毒不治疗组 (阴性对照)， 中药微生态制剂组(实施例2)， 西药组(对比例7)， 对。

45、比例3-6。 由于鸡只不能自 由饮食， 故采用灌胃方式， 将中药微生态制剂组(0.5g/ml稀释灌胃， 0.5ml/次， 2次/天)、 西 药组(按说明书用法用量:1L水0.771.15g)、 对比例3-6按试验组用法用量(0.5g/ml稀释 灌胃， 0.5ml/次， 2次/天)， 对攻毒鸡只灌胃治疗， 阳性对照组正常采食和饮水， 阴性对照组 灌胃生理盐水， 连续给药5天， 每天观察患鸡的临床变化， 统计治愈、 有效及无效数， 计算治 愈率和总有效率， 剖检后法氏囊、 胸腺、 脾脏称重计算免疫器官指数。 0082 疗效判断标准： 治愈： 试验结束后， 病鸡症状消失， 精神转好， 食欲增长， 完。

46、全恢复 正常， 无稀便， 剖检心、 肝、 脾、 肠检测无致病菌； 有效： 试验结束后， 鸡病症状、 精神、 食欲明 显好转， 无稀便； 无效： 试验期间出现症状， 试验结束后仍不见症状消失甚至死亡。 0083 具体治疗效果见表3。 0084 表3 0085 0086 由表3可见， 在56致死量的攻毒剂量下， 实施例2使用本公开的中药微生态制剂 试验组对由鸡大肠杆菌、 鸡沙门氏菌引起疾病的有效率为88， 治愈率为82， 无效率为 12， 其有效率与使用硫酸新霉素的对比例7(西药组)效果相当， 但当解剖后涂板验证致病 说明书 8/9 页 11 CN 110787247 A 11 菌后， 发现中药微。

47、生态制剂试验组的治愈率要比西药组高治愈率提高5.12、 胸腺指数提 高17.80、 脾脏指数提高18.63、 法氏囊指数提高29.47。 使用本公开的中药微生态制 剂试验组的鸡只免疫器官指数(胸腺指数、 脾脏指数、 法氏囊指数)高于西药组， 从而说明此 中药微生态制剂不仅能够替代抗生素治疗细菌性腹泻， 而且有提高鸡只免疫力的能力。 0087 由表3也可以看出， 与对比例3-6相比， 实施例2在鸡只的存活数量、 有效率、 治愈率 上都明显高于对比例。 所以从临床数据上进一步证实了本公开的中药微生态制剂的效果。 0088 测试例4 0089 选取山东省烟台市某猪场体重、 日龄相近的黄、 白痢仔猪共。

48、50头。 0090 将病猪随机分成2栏， 25只/栏， 受试动物饲养管理条件基本一致， 分为试验组(实 施例2)、 对照组(对比例7)。 给药方式及用量： 注射器沿仔猪口角灌服， 在同一时间用药， 试 验组(实施例2)用量0.2g/ml， 5ml/次， 对照组(对比例7)用量参考说明书(1kg体重0.75g)， 2 次/天， 连用5天。 治疗同时记录黄白痢仔猪发病时平均体重、 治愈后体重、 治愈情况、 60日龄 体重以及料肉比。 0091 疗效判断标准： 治愈： 试验结束后， 仔猪黄白痢现象消失， 粪便成形， 精神状态良 好； 有效： 治疗后仔猪黄白痢次数减少， 粪便性状有所恢复； 无效： 治。

49、疗后仔猪黄白痢次数同 治疗前无变化甚至死亡。 0092 具体治疗效果见表4。 0093 0094 由表4可见， 试验组(实施例2)对仔猪黄白痢的治疗效果显著， 有效率为96， 治愈 率为92。 与对照组(对比例7)比较： 有效率提高4.35、 治愈率提高9.52、 60日均重提高 9.34、 料肉比降低0.07。 实验结果说明， 本发明的中药微生态制剂可以有效治疗由大肠杆 菌、 沙门氏菌等细菌引起的畜禽腹泻， 并且治愈率要高于抗生素治疗组， 增重、 降低料肉比 等指标优化明显， 能显著提高经济效益。 0095 以上详细描述了本公开的优选实施方式， 但是， 本公开并不限于上述实施方式中 的具体细节， 在本公开的技术构思范围内， 可以对本公开的技术方案进行多种简单变型， 这 些简单变型均属于本公开的保护范围。 0096 另外需要说明的是， 在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征， 在不矛 盾的情况下， 可以通过任何合适的方式进行组合。 为了避免不必要的重复， 本公开对各种可 能的组合方式不再另行说明。 0097 此外， 本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合， 只要其不违背本 公开的思想， 其同样应当视为本公开所公开的内容。 说明书 9/9 页 12 CN 110787247 A 12 图1 说明书附图 1/1 页 13 CN 110787247 A 13 。