MAFG/AS1/PCBP2/FPN1调控轴作为靶位点检测试剂的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911159971.X (22)申请日 2019.11.23 (71)申请人 中南大学湘雅三医院 地址 410013 湖南省长沙市桐梓坡路138号 中南大学湘雅三医院 (72)发明人 曹科向亮肖梦卿何东 朱煜星曾庆海 (74)专利代理机构 长沙优企知识产权代理事务 所(普通合伙) 43243 代理人 刘佳芳 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 33/574(2006.01) (54)发明名称 MAFG/AS1/PCBP2/FPN1调控轴。

2、作为靶位点检 测试剂的应用 (57)摘要 本发明公开了 “MAFG-AS1/PCBP2/FPN1” 调控 轴作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱癌药物 中的应用。 本发明研究证实， 在膀胱癌细胞中， 表 达升高的MAFG-AS1结合PCBP2后能通过招募去泛 素化酶UCHL5稳定PCBP2的表达， 进而通过PCBP2 的运输作用， 将铁离子传递给细胞膜上的FPN1， 促进铁转运出胞外， 导致铁死亡抵抗。 首次证实 膀胱癌中 “MAFG-AS1/PCBP2/FPN1” 调控轴的存 在， 是膀胱癌治疗领域的一种非常有价值的潜在 治疗药物。 因此， PCBP2可在制备治疗膀胱癌药物 中作为靶位点， 也是。

3、临床上预测膀胱癌癌患者的 分子标志物。 权利要求书1页 说明书6页 附图8页 CN 110806486 A 2020.02.18 CN 110806486 A 1.MAFG-AS1/PCBP2/FPN1调控轴作为靶位点检测试剂的应用,其特征是， MAFG-AS1/ PCBP2/FPN1调控轴作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱癌药物中。 2.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述膀胱癌是指BUC。 3.PCBP2作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用。 4.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， PCBP2作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱 癌分子标志物中的应用。 5.如权利要求3所述。

4、的应用， 其特征在于， 所述膀胱癌是指BUC。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110806486 A 2 MAFG/AS1/PCBP2/FPN1调控轴作为靶位点检测试剂的应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及 “MAFG/AS1/PCBP2/FPN1” 调控轴及PCBP2 作为靶位点检测试剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用。 背景技术 0002 顺铂 （DDP） 是治疗膀胱癌的一线化疗药物， DDP主要作用于细胞DNA的嘌呤和嘧啶 碱基， 与DNA形成顺铂-DNA加合物， 导致DNA损伤， 抑制DNA的复制和转录进而杀伤肿瘤细胞。 近年来， 膀胱癌细胞对顺铂耐药性的产。

5、生严重影响了顺铂的疗效。 目前多认为顺铂耐药的 机制主要存在两方面： 肿瘤细胞DNA被破坏减少基于顺铂于DNA结合减少； 损伤的DNA被DNA 修复系统修复及细胞死亡逃逸机制启动， 使得已经遭到顺铂破坏的细胞依旧存活。 目前多 种方式 （包括促进凋亡、 调控自噬等） 尝试增加膀胱癌对顺铂的敏感性， 但相当一部分膀胱 癌患者对顺铂仍然耐药， 严重影响膀胱癌患者的愈合。 因此探索逆转膀胱癌细胞对顺铂耐 药的方法是提高疗效的关键。 0003 铁死亡是一种铁依赖性的， 以细胞内活性氧堆积为特征的非细胞凋亡形式的细胞 死亡。 形态上发生铁死亡的细胞会出现比正常细胞小的线粒体， 且线粒体膜皱缩， 同时线粒。

6、 体嵴减少、 消失， 外膜破碎。 细胞外三价铁离子 （Fe3+） 与transferrin （TF） 结合后形成TF- Fe3+， 在膜蛋白transferrin receptor protein 1 （TFR1） 的介导下进入细胞内， 并被还原成 Fe2+。 在divlent metal transporter （DMT1） 、 ZRT/IRT-like proteins 8/14( ZIP8/14)的 协助下存储到细胞内的labile iron pool （LIP） 中。 另外， 胞内Fe2+在PCBP2等铁伴侣蛋白的 协助下经过膜蛋白运铁蛋白1 (FPN1)泵出铁离子， 维持胞内铁平衡。。

7、 铁过载与细胞膜脂质 过氧化有关, 导致大量活性氧簇 （ROS） ， 促使细胞发生铁死亡。 多项研究证实促进铁死亡能 增加顺铂对肿瘤细胞的杀伤性。 因此深入研究铁死亡在膀胱癌顺铂耐药中的作用及分子机 制， 对膀胱癌的治疗具有重要意义。 0004 Long non-coding RNA (lncRNA)是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。 LncRNAs能通过转录调控、 组蛋白修饰、 结合蛋白、 ceRNA等机制参与多种生物学行为的调 控。 目前有少数文献报道LINC00336、 P53RRA等lncRNAs参与肿瘤细胞铁死亡的调控。 MAF BZIP Transcription Fa。

8、ctor G Antisense RNA 1 （MAFG-AS1） 是最新被报道的能促进肿 瘤增殖及转移的lncRNA， 但MAFG-AS1在膀胱癌中的作用尚不清楚。 发明内容 0005 本发明旨在提供一种可以用于制备膀胱癌顺铂增敏药物的新靶点。 在本研究中， 抑制MAFG-AS1表达能诱导铁死亡进而增加顺铂对膀胱癌细胞的杀伤力。 在本研究中， 我们 首次发现在膀胱癌细胞中高表达的MAFG-AS1与PCBP2结合后能促进胞内铁离子的泵出， 进 而诱导铁死亡抵抗。 首次证实膀胱癌中 “MAFG-AS1/PCBP2/FPN1” 调控轴的存在， 是膀胱癌治 疗领域的一种非常有价值的潜在治疗药物； 并。

9、提供了抑制膀胱癌顺铂耐药性的潜在治疗新 靶点。 说明书 1/6 页 3 CN 110806486 A 3 0006 本发明首次证实MAFG-AS1在膀胱癌中也发挥癌基因作用， 能促进膀胱癌细胞的增 殖能力。 本发明还首次揭示膀胱癌中表达升高的MAFG-AS1能抑制膀胱癌细胞的铁死亡， 且 细胞及动物层面均证实MAFG-AS1能通过抑制铁死亡增加膀胱癌细胞对顺铂的敏感性。 本发 明从铁离子水平改变角度探索的MAFG-AS1诱导膀胱癌铁死亡抵抗的新机制。 0007 通过ChIRP-MS高通量测序方法发现与MAFG-AS1探针结合差异表达的蛋白有26个， 其中包括PCBP2等蛋白。 我们通过PRM-。

10、MS 法验证了MAFG-AS1与PCBP2蛋白直接结合， 证实 MAFG-AS1与PCBP2相结合。 通过分析相关去泛素化酶在膀胱癌中的表达水平、 预后及与 PCBP2相关性， 最终筛选出在膀胱癌中高表达或预后相关或与PCBP2表达呈正相关性的5个 去泛素化酶UCHL5、 USP5、 COPS6、 PSMD14、 OTUB1。 通过GSE83586、 GSE87304、 GSE13507、 GSE31684等芯片分析发现在膀胱癌中UCHL5与PCBP2呈正相关； 并WB及COIP方法检测证实 MAFG-AS1通过招募去泛素化酶UCHL5从而上调PCBP2蛋白表达水平。 0008 蛋白结合预测发。

11、现PCBP2与FPN1相结合。 WB及COIP方法检测证实PCBP2结合FPN1之 后能够将携带的铁离子经由FPN1向胞外输出铁离子进而抑制铁死亡。 0009 总之， 本发明首次发现在膀胱癌细胞中， 表达升高的MAFG-AS1结合PCBP2后能通过 招募去泛素化酶UCHL5稳定PCBP2的表达， 进而通过PCBP2的运输作用， 将铁离子传递给细胞 膜上的FPN1， 促进铁转运出胞外， 导致铁死亡抵抗。 首次证实膀胱癌中 “MAFG-AS1/PCBP2/ FPN1” 调控轴的存在， 是膀胱癌治疗领域的一种非常有价值的潜在治疗药物； 并提供了抑制 膀胱癌顺铂耐药性的潜在治疗新靶点。 靶向MAFG-。

12、AS1/PCBP2/FPN1途径可能成为改善膀胱 癌或其他癌症患者的治疗和存活的新的治疗策略。 0010 附图说明 0011 图1： MAFG-AS1抑制膀胱癌细胞铁死亡。 A-B： MTT法检测MAFG-AS1敲除后T24/RT4细 胞的增殖情况， 联合应用凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK， 自噬抑制剂3-MA， 铁死亡抑制剂DFO或铁 死亡诱导剂Erastin。 C， D， E， F： 用相应的试剂盒检测Iron和Lipid-ROS水平。 G， H： PCR检测干 扰MAFG-AS1后T24/RT4细胞中MAFG-AS1的表达。 I， G： 克隆形成实验检测改变MAFG-AS1后的 细胞增殖。

13、。 K， L： 检测改变MAFG-AS1后T24/RT4细胞MDA、 Iron和Lipid-ROS水平。 p0.05， *p 0.01， *p0.001。 0012 图2： MAFG-AS1通过铁死亡途径调节膀胱癌细胞对顺铂的化疗敏感性。 A-D： MTT和 克隆形成试验检测经顺铂(DDP， IC50)处理的T24/RT4细胞在敲除MAFG-AS1和/或DFO处理后 的细胞增殖。 E-G： 用相应的试剂盒检测MDA、 Iron和Lipid-ROS的表达水平。 H-K： MTT和克隆 形成实验检测经顺铂(DDP， IC50)处理的T24/RT4细胞在过表达MAFG-AS1和/或Erastin后的。

14、 细胞增殖。 L-N： 用相应的试剂盒检测MDA、 Iron和Lipid-ROS的表达水平。 ns p0.05， *p 0.05， *p0.01， *p0.001。 0013 图3： 体内实验证实敲除MAFG-AS1可通过促进铁死亡增加膀胱癌细胞对顺铂化疗 的敏感性。 A， G： 在T24/RT4细胞中敲除MAFG-AS1和/或DDP处理后， 用PCR检测MAFG-AS1的表 达。 B， H： 处死后从指定小鼠分离的肿瘤组织。 C， I： 处死后指定小鼠的肿瘤体积。 D， J： 采用免 疫组化检测肿瘤组织中Ki67的表达。 E， F， K， L： 测定动物血清中MDA和Iron的含量。 ns 。

15、p 0.05， *p0.05， *p0.01， *p0.001。 说明书 2/6 页 4 CN 110806486 A 4 0014 图4： MAFG-AS1通过募集去泛素酶UCHL5来稳定PCBP2蛋白的表达水平。 A： Chirp-MS 用于鉴定与MAFG-AS1结合的蛋白质。 B： PRM-MS实验证实MAFG-AS1与PCBP2结合。 C： 图中显示 了MAFG-AS1与PCBP2蛋白之间的结合模式。 D， E： 敲除去泛素酶(UCHL5， USP5， COPS6， PSMD14 和OTUB1)后， 用WB法检测PCBP2的表达。 F-G： CO-IP法以PCBP2为沉淀抗体， 检测M。

16、AFG-AS1在 T24/RT4细胞中过表达后的UCHL5水平。 H-L： GSE31189， GSE83586， GSE87304， GSE13507和 GSE31684芯片揭示了UCHL5和PCBP2之间的正相关。 M-N： CO-IP与PCBP2沉淀抗体共同检测过 表达MAFG-AS1和/或在T24/RT4细胞中敲除UCHL5后PCBP2的泛素水平。 ns p0.05， *p 0.05， *p0.01， *p0.001。 0015 图5： PCBP2与FPN1结合， 加速铁泵出并抑制膀胱癌细胞中的铁死亡。 A， B： MTT法检 测PCBP2表达改变后T24/RT4细胞的增殖能力。 C-。

17、D： 检测改变PCBP2后的Iron和Lipid-ROS水 平。 E， G： GSE31189， GSE87304和GSE83586芯片揭示了PCBP2和FPN1之间的正相关。 H： 图中显 示了PCBP2和FPN1之间的结合模式。 I， J： 以PCBP2为沉淀抗体的CO-IP法检测干扰PCBP2在 T24/RT4细胞中表达后的FPN1水平。 ns p0.05， *p0.05， *p0.01， *p0.001。 0016 图6： A-B： PCR法在T24/RT4两株细胞中分别过表达MAFG与MAFG-AS1及敲除PCBP2后 检测MAFG-AS1表达。 C、 F： MTT法检测MAFG-A。

18、S1/MAFG/PCBP2轴对细胞增值能力的影响。 D-E、 G-H： 使用Iron Colorimetric assay、 Lipid ROS assay using flow cytometer检测MAFG- AS1/MAFG/PCBP2轴对细胞铁死亡相关指标Iron、 Lipid-ROS水平的影响。 I、 M： 裸鼠皮下成瘤 模型。 J、 N: 各组瘤体体积大小。 K-L、 O-P： 使用Malondialdehyde (MDA) assay、 Iron Colorimetric assay检测动物血液 （血清） 中的MDA、 Iron水平。 Q： 免疫组织化学检测各组中 ki67的表达。

19、量。 Bars表示标准差， ns p0.05， *p0.05， *p0.01， *p0.001。 0017 图7： 3-MA、 Z-DEVD-FMK对自噬及凋亡水平的影响。 A， B： WB用于检测LC3B表达。 C， D： 使用Annexin V-Fict/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。 0018 图8： MAFG-AS1上调PCBP2水平。 A： 通过GSE31189芯片分析膀胱癌中MAFG-AS1与 PCBP2的相关性。 B： MAFG-AS1过表达后用PCR检测MAFG-AS1的表达， 并结合UCHL5敲除与否。 C： 用WB法检测新鲜临床膀胱癌及癌旁组织中MAFG和PCBP2的表。

20、达。 D： 用免疫组化方法检测 MAFG和PCBP2在石蜡包埋BUC组织和癌旁组织中的表达。 0019 图9： MAFG和PCBP2在异种移植小鼠模型肿瘤中的表达。 A： MAFG下调表达和/或DDP 干预后， WB检测肿瘤组织中MAFG和PCBP2的表达。 B： 上调MAFG-AS1和MAFG表达后， 结合PCBP2 下调与否， 用WB检测肿瘤组织中MAFG和PCBP2的表达。 具体实施方式 0020 下面结合附图和实验数据对本发明做进一步的解释和说明 1、 材料及方法 细胞培养及转染， qRT-PCR分析， RNA纯化分离染色质 （CHIRP） 、 平行反应监测(PRM)、 蛋 白质印迹分。

21、析， 免疫组化测定， MTT测定， 流式细胞术， 免疫沉淀， 染色质免疫共沉淀， 免疫荧 光， 双荧光素酶实验， 铁比色法， 丙二醛 （MDA） 测定， 流式细胞仪测定Lipid-ROS， 克隆形成测 定， 以上方法均是现有方法， 在此不再累述。 0021 、 结果 2.1 MAFG-AS1能抑制膀胱癌细胞的铁死亡 说明书 3/6 页 5 CN 110806486 A 5 我们在T24/RT4两株细胞中分别对MAFG-AS1敲除及过表达干预 （图1G,H） ， 在T24/RT4两 株细胞敲除MAFG-AS1后MTT实验进一步证实细胞增殖能力明显受抑制， 并且Iron、 Lipid- ROS水平。

22、显著上升 （图1A-F） 。 加入铁死亡抑制剂DFO能够抑制Iron、 Lipid-ROS水平并拮抗敲 除MAFG-AS1诱导的细胞死亡， 而加入铁死亡诱导剂Erastin后能增加Iron、 Lipid-ROS水平， 并进一步促进敲除MAFG-AS1诱导的细胞死亡在T24/RT4两株细胞中分别对MAFG-AS1敲除及 过表达干预 （图1C-F） 。 但加入凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK和自噬抑制剂3-MA对Iron、 Lipid-ROS 水平及敲除MAFG-AS1诱导的细胞死亡影响轻微 （图1C-F） 。 3-MA、 Z-DEVD-FMK对自噬及凋亡 水平的影响见补充材料 （图6A-D） 。 。

23、克隆形成实验发现敲除MAFG-AS1显著抑制细胞克隆能力 以及上调MDA、 Iron、 Lipid-ROS水平， 而过表达MAFG-AS1结果相反 （图1I-L） 。 以上结果提示 MAFG-AS1能抑制膀胱癌细胞的铁死亡。 0022 通过铁死亡途径调节膀胱癌细胞对顺铂的化疗敏感性 有研究表明在肿瘤细胞内铁死亡抵抗是顺铂耐药的新机制之一， 那么MAFG-AS1能否通 过铁死亡来调节膀胱癌细胞的顺铂化疗敏感性呢， 在顺铂 （DDP） IC50处理下， 在T24/RT4两 株细胞中干扰MAFG-AS1表达， MTT实验及克隆形成实验证实敲除MAFG-AS1后促进DDP对细胞 的杀伤能力及铁死亡相关。

24、指标的表达， 加入DFO能抑制铁死亡相关指标及DDP的杀伤能力 （图2A-G） 。 过表达MAFG-AS1后抑制DDP对细胞的杀伤能力及铁死亡相关指标的表达， 而加入 Erastin能促进铁死亡相关指标及DDP的杀伤能力 （图2H-L） 。 上述结果证实MAFG-AS1通过铁 死亡途径来调节膀胱癌细胞的顺铂化疗敏感性。 0023 动物实验证实敲除MAFG-AS1能通过促进铁死亡增加膀胱癌细胞对顺铂化疗敏感 性 为从体内实验进一步验证我们上述的结论。 我们构建了裸鼠皮下成瘤模型， 结果发现 相对于对照组， DDP与敲除MAFG-AS1均能抑制对肿瘤的生长， 而在DDP干预的同时， 敲除 MAFG。

25、-AS1 （图3A、 G） 能进一步增强DDP对肿瘤组织的杀伤作用 （图3B-C、 H-I） 。 免疫组化检测 肿瘤增殖相关指标Ki67， 发现DDP干预及敲除MAFG-AS1后肿瘤组织中的Ki67阳性率下降， 而 DDP+MAFG-AS1敲除组瘤组织的Ki67阳性率下降更为明显 （图3D、 J） 。 以上表明敲除MAFG-AS1 增加膀胱癌细胞的顺铂化疗敏感性。 我们收集动物血液检测铁死亡相关指标， 发现相对于 对照组， 敲除MAFG-AS1及DDP干预组中的MDA、 Iron水平上升 （图E-F， K-L） 。 以上结果证明 MAFG-AS1在体内能通过铁死亡途径来调节膀胱癌细胞的顺铂化疗。

26、敏感性。 0024 通过招募去泛素化酶UCHL5激活PCBP2/FPN1/铁离子轴进而抑制膀胱癌细胞的铁 死亡 我们为进一步研究MAFG-AS1调控铁死亡途径的具体分子机制， 通过ChIRP-MS高通量测 序方法发现与MAFG-AS1探针结合差异表达的蛋白有26个， 间接结合有15个蛋白， 总共有141 个蛋白 （图4A） ， 其中包括PCBP2等蛋白。 我们收集了14对膀胱癌与癌旁蜡块组织及6对临床 膀胱癌与癌旁新鲜组织， WB及免疫组化检测结果显示相对于癌旁组织， PCBP2在癌组织表达 相对增高 （图8H-I） 。 GSE31189芯片分析发现在膀胱癌中MAFG-AS1与PCBP2成正相。

27、关 （图8A） 。 catRAPID 证实MAFG-AS1与PCBP2相结合， 其中MAFG-AS1片段上黄色碱基为MAFG-AS1与 PCBP2蛋白 （红色为氨基酸识别结合位点） 结合区域 （图4C） 。 为此我们通过分析相关去泛素 化酶在膀胱癌中的表达水平、 预后及与PCBP2相关性， 最终筛选出在膀胱癌中高表达或预后 相关或与PCBP2表达呈正相关性的5个去泛素化酶UCHL5、 USP5、 COPS6、 PSMD14、 OTUB1 （图9A- 说明书 4/6 页 6 CN 110806486 A 6 E） 。 在T24和RT4两株细胞中分别敲除上述去泛素化酶后， WB结果发现抑制UCHL。

28、5后PCBP2表 达下降最为明显 （图4D-E） 。 通过GSE83586、 GSE87304、 GSE13507、 GSE31684等芯片分析发现 在膀胱癌中UCHL5与PCBP2呈正相关 （图4H-L） 。 以PCBP2为沉淀抗体， 用COIP方法检测UCHL5 表达， 结果表明PCBP2能与UCHL5结合 （图4F-G） 。 PCBP2蛋白表达水平明显上升， 而过表达 MAFG-AS1同时敲除UCHL5后PCBP2泛素化水平显著上调， 但PCBP2蛋白表达水平明显下降 （图 4M-N） 。 综上表明MAFG-AS1通过招募去泛素化酶UCHL5从而上调PCBP2蛋白表达水平。 0025 有。

29、研究报道PCBP2作为铁伴侣参与吸附和转运铁离子从而影响铁死亡途径。 在 T24/RT4两株细胞中敲除PCBP2后膀胱癌细胞增殖能力显著下降， Iron、 Lipid-ROS水平显著 上升， 过表达PCBP2其结果完全相反 （图5A-D） 。 提示PCBP2能够影响膀胱癌细胞的铁死亡。 运 铁蛋白1 (FPN1)是哺乳动物存在的一种出口铁蛋白， 其主要功能就是铁离子转运出细胞， 有文献报道表明FPN1输出胞外的铁来自铁伴侣PCBP2。 我们通过GEO （GSE31189、 GSE87304、 GSE83586） 芯片分析发现在膀胱癌中PCBP2与FPN1呈正相关 （图5E-G） ， 而蛋白结合。

30、预测发现 PCBP2与FPN1相结合 （图5H） 。 为了证实PCBP2与FPN1之间的关系， 在T24/RT4两株细胞中分别 干扰PCBP2后， WB发现敲除PCBP2后FPN1表达水平无明显改变， 以PCBP2为沉淀抗体， 行COIP 检测FPN1发现FPN1表达水平下调， 而过表达PCBP2则结果完全相反 （图5I-J） 。 上述表明 PCBP2能与FPN1结合， 但不影响FPN1表达。 提示PCBP2结合FPN1之后能够将携带的铁离子经 由FPN1向胞外输出铁离子进而抑制铁死亡。 综上表明MAFG-AS1结合PCBP2能招募去泛素化 酶UCHL5稳定PCBP2蛋白的表达， PCBP2结。

31、合FPN1能加速铁离子泵出进而抑制膀胱癌细胞的 铁死亡。 0026 通过上调PCBP2表达从而抑制膀胱癌细胞的铁死亡 已证实MAFG-AS1/MAFG正反馈环存在情况下。 为了证实MAFG-AS1/MAFG正反馈环通过 PCBP2介导的铁死亡。 我们在T24/RT4两株细胞中分别过表达MAFG、 MAFG-AS1及敲除PCBP2并 行PCR检测MAFG-AS1表达 （图6A-B） ， 结果表明PCBP2不影响MAFG-AS1表达。 但过表达MAFG- AS1或MAFG后同时敲除PCBP2后细胞增殖能力明显受到抑制， 且铁死亡相关指标显著上升 （图6C-H） 。 上述结果表明MAFG-AS1/M。

32、AFG正反馈环通过PCBP2调控膀胱癌细胞的铁死亡。 为 了从体内实验进一步证实我们的结论， 我们构建了裸鼠皮下成瘤模型， 结果发现相对于对 照组， 过表达MAFG-AS1和过表达MAFG均能促进肿瘤的生长， 而在过表达MAFG-AS1和过表达 MAFG同时敲除PCBP2能抑制肿瘤组织的生长 （图6I-J、 M-N） 。 免疫组化检测肿瘤增殖相关指 标Ki67， 发现过表达MAFG-AS1和过表达MAFG后肿瘤组织中的Ki67阳性率上升， 而过表达 MAFG-AS1和过表达MAFG同时敲除PCBP2组中瘤组织的Ki67阳性率明显下降 （图6Q） 。 动物瘤 体行WB检测PCBP2与MAFG表达。

33、， 结果显示相对于对照组， 过表达MAFG-AS1和过表达MAFG同时 敲除PCBP2后PCBP2表达明显下降， 而MAFG表达无明显变化 （图10B） 。 在顺铂化疗敏感性体内 实验中， 瘤体行WB检测PCBP2与MAFG表达， 结果显示相对于对照组， 敲除MAFG-AS1后PCBP2与 MAFG的表达均下降 （图10A） 。 我们收集动物血液检测铁死亡相关指标， 发现相对于对照组， 过表达MAFG-AS1和过表达MAFG后MDA、 Iron水平下降； 而过表达MAFG-AS1和过表达MAFG同时 敲除PCBP2后MDA、 Iron水平上升 （图6K-L、 O-P） 。 以上结果证实MAFG。

34、-AS1通过上调PCBP2表达 从而抑制膀胱癌细胞的铁死亡。 0027 综上所述， 本发明首次发现在膀胱癌细胞中， 表达升高的MAFG-AS1结合PCBP2后 能通过招募去泛素化酶UCHL5稳定PCBP2的表达， 进而通过PCBP2的运输作用， 将铁离子传递 说明书 5/6 页 7 CN 110806486 A 7 给细胞膜上的FPN1， 促进铁转运出胞外， 导致铁死亡抵抗。 首次证实膀胱癌中 “MAFG-AS1/ PCBP2/FPN1” 调控轴的存在， 是膀胱癌治疗领域的一种非常有价值的潜在治疗药物； 并提供 了抑制膀胱癌顺铂耐药性的潜在治疗新靶点。 靶向MAFG/AS1/PCBP2/ FP。

35、N1途径可能成为改 善膀胱癌或其他癌症患者的治疗和存活的新的治疗策略。 说明书 6/6 页 8 CN 110806486 A 8 图1 说明书附图 1/8 页 9 CN 110806486 A 9 图2 说明书附图 2/8 页 10 CN 110806486 A 10 图3 说明书附图 3/8 页 11 CN 110806486 A 11 图4 说明书附图 4/8 页 12 CN 110806486 A 12 图5 说明书附图 5/8 页 13 CN 110806486 A 13 图6 说明书附图 6/8 页 14 CN 110806486 A 14 图7 图8 说明书附图 7/8 页 15 CN 110806486 A 15 图9 说明书附图 8/8 页 16 CN 110806486 A 16 。