用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911001391.8 (22)申请日 2019.10.21 (71)申请人 深圳大学 地址 518055 广东省深圳市南山区学苑大 道1066号 (72)发明人 杨缜韦春媚 (74)专利代理机构 深圳市君胜知识产权代理事 务所(普通合伙) 44268 代理人 王永文刘文求 (51)Int.Cl. C12N 11/089(2020.01) C12N 9/02(2006.01) C12P 7/22(2006.01) C12P 13/22(2006.01) (54)发明名称 一。

2、种用酶固定化技术合成多酚类化合物的 制备方法 (57)摘要 本发明提供一种用酶固定化技术合成多酚 类化合物的制备方法， 所述制备方法包括： 将金 属离子或金属簇与有机配体和酪氨酸酶混合， 对 酪氨酸酶进行固定化， 得到酪氨酸酶-金属有机 骨架复合物； 用所述酪氨酸酶-金属有机骨架复 合物做为催化剂， 以单苯酚类化合物作为反应 物， 合成所述多酚类化合物。 本发明通过金属离 子或金属簇与有机配体在酪氨酸酶的诱导下配 位形成金属有机骨架， 同时金属有机骨架形成酪 氨酸酶的保护壳， 实现对酪氨酸酶的固定化， 得 到的固定化酪氨酸酶具有较高的催化性能。 固定 化酪氨酸酶催化单苯酚类化合物合成邻位羟基 。

3、化多酚类化合物， 并添加还原剂以抑制多酚类化 合物被进一步氧化， 从而提高多酚类化合物产 率。 权利要求书1页 说明书8页 附图8页 CN 110819617 A 2020.02.21 CN 110819617 A 1.一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其特征在于， 包括步骤： 将金属离子或金属簇、 有机配体及酪氨酸酶溶液混合， 使酪氨酸酶固定在金属离子或 金属簇与有机配体结合生成的金属有机骨架上， 得到酪氨酸酶-金属有机骨架复合物； 将所述酪氨酸酶-金属有机骨架复合物加入到单苯酚类化合物溶液中， 并加入还原剂， 在预定反应条件下反应， 合成所述多酚类化合物。 2.根据权利要求1。

4、所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其特征在于， 所 述金属离子包括Cu2+、 Fe3+、 Zn2+、 Mn2+、 Co2+、 Cr3+、 Ni2+、 Ag+和Ca2+中的一种或多种。 3.根据权利要求1所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其特征在于， 所 述有机配体为偶氮杂环有机配体和/或含羧基的有机化合物。 4.根据权利要求3所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其特征在于， 所 述偶氮杂环有机配体为2-甲基咪唑、 苯并咪唑、 N-乙酰基咪唑、 2， 4-二甲基咪唑、 2-十一烷 基咪唑、 1-三苯甲基咪唑、 2-巯基-1-甲基咪唑、 2,2 -联吡啶、 。

5、4,4 -联吡啶、 4,4-二甲氧 基-2,2-联吡啶、 2,4-二氨基吡啶、 1， 2， 4-三唑、 5-氨基四唑中的一种或多种。 5.根据权利要求1所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其特征在于， 所 述单苯酚类化合物为含有一个酚羟基的有机化合物。 6.根据权利要求1所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其特征在于， 所 述还原剂为L-抗坏血酸、 柠檬酸、 硫脲、 NaBH4和LiBH4中的一种或多种。 7.根据权利要求1所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其特征在于， 所 述金属离子或金属簇、 有机配体及酪氨酸酶溶液中， 所述酪氨酸酶的体积分数为50-8。

6、0。 8.根据权利要求1所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其特征在于， 所 述金属离子或金属簇、 有机配体及酪氨酸酶溶液中， 所述金属离子或金属簇的浓度为0.1 80mM。 9.根据权利要求1所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其特征在于， 所 述金属离子或金属簇、 有机配体及酪氨酸酶溶液中， 所述有机配体在混合溶液中的浓度为 0.1640mM。 10.根据权利要求1所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其特征在于， 所述预定反应条件为反应温度10-60， 反应pH值5.0-8.0。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110819617 A 2 一种用酶固定。

7、化技术合成多酚类化合物的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及酶的固定化及酶催化技术领域， 尤其涉及一种用酶固定化技术合成多 酚类化合物的制备方法。 背景技术 0002 多酚类化合物是指苯环上有两个或两个以上羟基的物质， 其独特的多羟基结构使 其性质更优于单酚类化合物， 其抗氧化、 抗菌、 抗癌抗肿瘤、 降血糖降血脂、 增强免疫功能等 作用均对人体健康有着重要意义， 在生物医学和保健领域都具有较大的应用和研究价值。 0003 目前多酚类化合物多采用化学法和生物法合成， 与化学法相比， 生物法利用酶催 化合成多酚类化合物， 具有高特异性、 高效、 环保、 容易回收等优势， 因此生物法在多酚类化。

8、 合物的合成技术中得到广泛关注。 0004 酪氨酸酶又称多酚氧化酶， 是一种含铜氧化还原酶， 能够催化一元酚氧化成邻位 的二元酚， 并进一步将二元酚氧化成邻苯醌。 游离酪氨酸酶由于存在稳定性差， 极端条件不 耐受以及不易回收等缺陷， 因此利用固定化技术对酪氨酸酶进行固定化， 可使固定化酪氨 酸酶催化合成多酚类化合物具有易于反应器操作、 便于产物分离和提高酶的重复利用性等 优势。 但目前的固定化技术存在使用的试剂和载体成本高、 固定化效率低、 稳定性差、 连续 操作使用的设备比较复杂等缺陷， 导致采用传统固定化技术合成多酚类化合物产率不高。 因此， 进一步开发更简便、 更适用的固定化方法以及性能。

9、更加优异的载体材料， 仍然是酶固 定化领域追求的目标。 0005 因此， 现有技术还有待于改进和发展。 发明内容 0006 鉴于上述现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种用酶固定化技术合成多酚 类化合物的制备方法， 所述固定化技术制备工艺简单， 用其固定酪氨酸酶， 旨在解决现有的 采用酪氨酸酶合成多酚类化合物产率不高的问题。 0007 本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下： 0008 一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其中， 包括步骤： 0009 将金属离子或金属簇、 有机配体及酪氨酸酶溶液混合， 使酪氨酸酶固定在金属离 子或金属簇与有机配体结合生成的金属有机骨架上，。

10、 得到酪氨酸酶-金属有机骨架复合物； 0010 将所述酪氨酸酶-金属有机骨架复合物加入到单苯酚类化合物溶液中， 并加入还 原剂， 在预定反应条件下反应， 合成所述多酚类化合物。 0011 所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其特征在于， 所述金属离子 包括Cu2+、 Fe3+、 Zn2+、 Mn2+、 Co2+、 Cr3+、 Ni2+、 Ag+和Ca2+中的一种或多种。 0012 所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其中， 所述有机配体为偶氮 杂环有机配体和/或含羧基的有机化合物。 0013 所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其中， 所述偶氮杂环有机配 说。

11、明书 1/8 页 3 CN 110819617 A 3 体为2-甲基咪唑、 苯并咪唑、 N-乙酰基咪唑、 2， 4-二甲基咪唑、 2-十一烷基咪唑、 1-三苯甲基 咪唑、 2-巯基-1-甲基咪唑、 2,2 -联吡啶、 4,4 -联吡啶、 4,4-二甲氧基-2,2-联吡啶、 2,4- 二氨基吡啶、 1， 2， 4-三唑、 5-氨基四唑中的一种或多种。 0014 所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其中， 所述酪氨酸酶来源于 动物、 植物和微生物。 0015 所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其中， 所述单苯酚类化合物 为含有一个酚羟基的有机化合物。 0016 所述用酶固。

12、定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其中， 所述还原剂为L-抗坏 血酸、 柠檬酸、 硫脲、 NaBH4和LiBH4中的一种或多种。 0017 所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其中， 所述金属离子或金属 簇、 有机配体及酪氨酸酶溶液中， 所述酪氨酸酶的体积分数为50-80。 0018 所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其中， 所述金属离子或金属 簇、 有机配体及酪氨酸酶溶液中， 所述金属离子或金属簇的浓度为0.180mM。 0019 所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其中， 所述金属离子或金属 簇、 有机配体及酪氨酸酶溶液中， 所述有机配体在混合溶液。

13、中的浓度为0.1640mM。 0020 所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其中， 所述预定反应条件为 反应温度10-60， 反应pH值5.0-8.0。 0021 本发明优选Zn2+和2-甲基咪唑， 在酶分子诱导下Zn2+和咪唑基配位作用形成沸石 咪唑酯骨架-8(ZIF-8)晶体， 并生长成为酶的保护壳， 对酪氨酸酶进行固定， 形成酪氨酸酶 沸石咪唑酯骨架-8(TYRZIF-8)。 0022 有益效果： 本发明提供一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法。 通过 “一锅法” 合成酪氨酸酶-金属有机骨架复合物， 使金属离子或金属簇与有机配体在酪氨酸 酶的诱导下络合形成金属有机骨架。

14、， 同时在反应过程中金属有机骨架能进一步生长形成酪 氨酸酶的保护壳， 从而实现对酪氨酸酶的固定化， 固定化后的酪氨酸酶具有较高的催化性 能。 固定了酪氨酸酶的金属有机骨架复合物对单苯酚类化合物进行催化， 在反应体系中添 加还原剂以抑制醌类物质生成， 可以提高多酚类化合物产率。 附图说明 0023 图1是本发明实施例提供的一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法流 程图。 0024 图2为本发明实施例1提供的不同条件对酪氨酸酶沸石咪唑酯骨架-8(TYRZIF- 8)的活性的影响示意图。 其中图2A为2-甲基咪唑浓度对所生成的TYRZIF-8的活性的影响； 图2B为醋酸锌浓度对所生成的TYRZ。

15、IF-8的活性的影响； 图2C为反应时间对所生成的TYR ZIF-8的活性的影响。 0025 图3为本发明实施例2提供的白皮杉醇的HPLC检测图谱示意图。 0026 图4为本发明实施例3提供的各种因素对TYRZIF-8催化合成白皮杉醇的影响示意 图。 其中图4A为L-抗坏血酸浓度对白皮杉醇产率的影响； 图4B为酶促反应温度对白皮杉醇 产率的影响； 图4C为酶促反应pH对白皮杉醇产率的影响； 图4D为TYRZIF-8作为催化剂的用 量对白皮杉醇产率的影响。 说明书 2/8 页 4 CN 110819617 A 4 0027 图5为本发明实施例4提供的用响应曲面法对白皮杉醇产率优化示意图。 其中图。

16、5A 为响应曲面法优化三维图； 图5B为响应曲面法优化后白皮杉醇产率与反应时间的关系。 0028 图6为本发明实施例5提供的L-多巴的HPLC检测图谱示意图。 0029 图7为本发明实施例6提供的制备L-多巴产率与反应时间关系示意图。 0030 图8为本发明实施例7提供的3 -羟基紫檀茋的HPLC检测图谱示意图。 0031 图9为本发明实施例8提供的制备3 -羟基紫檀茋产率与反应时间关系示意图。 具体实施方式 0032 为使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚、 明确， 以下参照附图并举实施例对 本发明进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用 于限定本。

17、发明。 0033 请参阅图1， 图1为本发明提供的一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方 法较佳实施例的流程图， 如图所示， 其包括以下步骤： 0034 S10、 将金属离子或金属簇、 有机配体及酪氨酸酶溶液混合， 使酪氨酸酶固定在金 属离子或金属簇与有机配体结合生成的金属有机骨架上， 得到酪氨酸酶-金属有机骨架复 合物； 0035 S20、 将所述酪氨酸酶-金属有机骨架复合物加入到单苯酚类化合物溶液中， 并加 入还原剂， 在预定反应条件下反应， 合成所述多酚类化合物。 0036 通过本实施例提供的合成方法， 可以使酪氨酸酶得到更好的固定效果和催化性 能， 而且该合成方法操作简单， 可有效。

18、提高多酚类化合物的产率， 实现上述效果的原理具体 如下： 0037 本发明通过金属离子或金属簇与有机配体、 酪氨酸酶混合， 采用 “一锅法” 固定酪 氨酸酶， 其中酪氨酸酶诱导金属离子或金属簇与有机配体通过配位作用形成杂化多孔金属 有机骨架， 成为酪氨酸酶的保护壳， 酪氨酸酶被固定在具有多孔结构的金属有机骨架中， 得 到酪氨酸酶-金属有机骨架复合物。 所述酪氨酸酶-金属有机骨架复合物具有良好的催化性 能， 在一定条件下可以使单苯酚类化合物氧化成邻位羟基化的多酚类化合物(如邻二酚)， 并将多酚类化合物氧化成醌类化合物(如邻醌)， 为此本实施例中还加入还原剂， 可以有效 抑制醌类化合物的生成， 从。

19、而进一步提高了多酚类化合物的产率。 0038 所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 其特征在于， 所述金属离子 包括Cu2+、 Fe3+、 Zn2+、 Mn2+、 Co2+、 Cr3+、 Ni2+、 Ag+和Ca2+中的一种或多种。 0039 在一些实施方式中， 所述金属盐中的阴离子为Cl-、 NO3-、 SO42-、 CH3COO-、 PO43+中的一 种或多种， 但不限于此。 0040 本实施例中， 金属离子与有机配体之间产生络合效应， 使得所形成的金属有机骨 架具有很好的热稳定性， 从而进一步提高酪氨酸酶-金属有机骨架复合物的环境耐受性。 0041 在一些实施方式中， 所述有机。

20、配体为偶氮杂环有机配体和/或含羧基的有机化合 物。 0042 在一些实施方式中， 所述偶氮杂环有机配体为2-甲基咪唑、 苯并咪唑、 N-乙酰基咪 唑、 2， 4-二甲基咪唑、 2-十一烷基咪唑、 1-三苯甲基咪唑、 2-巯基-1-甲基咪唑、 2,2 -联吡 啶、 4,4 -联吡啶、 4,4-二甲氧基-2,2-联吡啶、 2,4-二氨基吡啶、 1， 2， 4-三唑、 5-氨基四唑 说明书 3/8 页 5 CN 110819617 A 5 中的一种或多种。 0043 本实施例中， 采用金属离子Zn2+与有机配体2-甲基咪唑反应， 构建沸石咪唑酯骨 架-8(ZIF-8)。 ZIF-8是MOF家族的一种。

21、， 这种材料在孔体积、 孔道结构、 稳定性以及生物相容 性等方面都具有很好的优势。 在上述Zn2+和2-甲基咪唑反应体系中同时添加酪氨酸酶， 进行 “一锅法” 合成， 制备得到酪氨酸酶沸石咪唑酯骨架-8(TYRZIF-8)。 0044 具体的， 所述Zn2+在混合溶液中的浓度为0.180mM。 所述2-甲基咪唑在混合溶液 中的浓度为0.1640mM。 所述酪氨酸酶在混合溶液中的体积分数为50-80。 将混合溶液在 4条件下搅拌1-12小时， 离心收集沉淀， 磷酸缓冲液或去离子水洗涤沉淀数次， 室温真空 干燥过夜， 制备得到TYRZIF-8。 0045 具体的， 所述酪氨酸酶为酪氨酸酶粗酶液， 。

22、所述酪氨酸酶粗酶液的制备方法如下： 将白色双孢菇与磷酸缓冲液(如50mM， pH6.0)按1:2的质量(g)体积(mL)比在匀浆机中进行 捣碎， 并过滤、 离心处理， 取上清液即为酪氨酸酶粗酶液。 0046 本实施例中， 采用上述制备方法得到的酪氨酸酶粗酶液， 在酶固定化反应中， 酪氨 酸酶粗酶液体积分数为总反应体系体积的50-80， 在此用量范围内使得在酶固定化反应 过程中， 有较好的酶固定化效率， 并且固定化酶的酶活性高。 0047 一些实施方式中， 所述单苯酚类化合物为含有一个酚羟基的有机化合物。 所述含 有一个酚羟基的有机化合物为L-酪氨酸、 4-羟基苯乙酸、 4-羟基布洛芬苯酚酯、 。

23、对苯氧基苯 酚、 3-氯苯酚、 对甲基苯酚、 2， 4-二氯苯酚、 白藜芦醇和紫檀茋中的一种或多种， 但不限于 此。 0048 一些实施方式中， 所述还原剂为L-抗坏血酸、 柠檬酸、 硫脲、 NaBH4和LiBH4等具有强 还原性的有机或无机化合物， 但不限于此。 0049 本实施例中， 单苯酚类化合物优选L-酪氨酸、 白藜芦醇、 紫檀茋， 还原剂优选L-抗 坏血酸。 用TYRZIF-8作为催化剂， 将单苯酚类化合物氧化成邻位羟基化的多酚类化合物， 其中， L-酪氨酸、 白藜芦醇和紫檀茋依次被催化形成L-多巴、 白皮杉醇和3 -羟基紫檀茋。 0050 在一些实施方式中， 在步骤S20的酶催化反。

24、应中， 反应温度为10-60， 反应pH值 为5.0-8.0。 0051 在一些实施方式中， 步骤S20的反应体系中， 所述单苯酚类化合物占溶质总质量 15-40(wt.)， 所述还原剂占溶质总质量25-60(wt.)， 所述酪氨酸酶-金属有机 骨架复合物(TYRZIF-8)的用量为2.5-10mg/mL。 0052 本实施例中， 采用TYRZIF-8作为催化剂， 将单苯酚类化合物氧化成邻位羟基化的 多酚类化合物， 酪氨酸酶是含铜氧化还原酶， 在O2分子参与下， 将单苯酚类化合物氧化成多 酚类化合物后， 还会进一步催化多酚类化合物得到醌类化合物， 对多酚类化合物的产率造 成不良影响。 本发明在。

25、催化反应体系中添加还原剂， 可以有效抑制醌类化合物的生成， 进一 步提高多酚类化合物的产率。 0053 本发明提供一种多酚类化合物， 所述多酚类化合物采用上述方法制备得到。 0054 下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。 0055 实施例1 0056 不同条件对TYRZIF-8的活性的影响。 0057 探究2-甲基咪唑浓度对所生成的TYRZIF-8的活性的影响： 制备总体系为200mL， 说明书 4/8 页 6 CN 110819617 A 6 100mL酪氨酸酶液、 80mL不同浓度2-甲基咪唑溶液和20mL醋酸锌溶液(0.4M)混合， 在4下 搅拌1h， 将混合液离心(4,8000rp。

26、m,10min)并磷酸缓冲液(50mM， pH6.0)清洗沉淀数次， 真 空干燥沉淀， 研磨样品至粉末状。 其中2-甲基咪唑终浓度分别为80mM、 160mM、 320mM、 640mM， 醋酸锌终浓度为40mM。 通过测定TYRZIF-8的酶活力获得最佳2-甲基咪唑浓度， 其中酶活力 测定方法是以L-多巴为底物， 利用紫外-可见分光光度计测定在A475nm处的吸光值大小， 再 根据朗伯-比尔定律AKbc(K为摩尔吸光系数； c为吸光物质的浓度， 单位为mol/L； b为比色 皿厚度， 单位为cm)计算酶活力。 结果如图2A所示。 0058 探究Zn2+浓度对所生成的TYRZIF-8的活性的影。

27、响： 制备总体系为200mL， 100mL酪 氨酸酶液、 40mL 2-甲基咪唑溶液(1.6M)和60mL不同浓度醋酸锌溶液混合， 在4下搅拌1h， 将混合液离心(4,8000rpm,10min)并磷酸缓冲液(50mM， pH6.0)清洗沉淀数次， 真空干燥 沉淀， 研磨样品至粉末状。 其中醋酸锌终浓度分别为20mM、 40mM、 80mM， 2-甲基咪唑终浓度为 320mM。 通过测定TYRZIF-8的酶活力获得最佳醋酸锌浓度。 结果如图2B所示。 0059 探究反应时间对所生成的TYRZIF-8的活性的影响： 制备总体系为200mL， 100mL酪 氨酸酶液、 2-甲基咪唑溶液(0.8M，。

28、 80mL)和醋酸锌溶液(20mL， 0.4M)混合， 在4下分别搅拌 1h、 5h、 12h， 将混合液离心(4,8000rpm,10min)并磷酸缓冲液(50mM， pH6.0)清洗沉淀数 次， 真空干燥沉淀， 研磨样品至粉末状。 其中2-甲基咪唑终浓度为320mM， 醋酸锌终浓度为 40mM。 在通过测定TYRZIF-8的酶活力获得最佳搅拌时间。 结果如图2C所示。 0060 从图2A、 2B、 2C中可以看出， TYRZIF-8最佳制备条件为： 2-甲基咪唑终浓度为 320mM， Zn2+终浓度为40mM， 2-甲基咪唑/Zn2+8， 4下搅拌1h。 0061 实施例2 0062 白皮。

29、杉醇的HPLC检测图谱。 0063 岛津高效液相色谱仪， 采用反向C18柱(日本GLSciences， Inc公司， InertsilODS- SP， 4.6150mm， 5 m)， 该液相条件为： 流动相A为0.5乙酸/乙腈95/5(v/v)， 流动相B为 乙腈/0.5乙酸95/5(v/v)， A/B75/25(v/v)， 进样量10 L， 总流速为1.0mL/min， 检测波 长为320nm， 柱温为29。 0064 用50乙腈(v/v)精确配制系列浓度的白皮杉醇标准液， 经HPLC检测白皮杉醇出 峰图谱。 TYRZIF-8催化所产生的白皮杉醇经适当稀释后以HPLC检测定性定量分析。 白皮。

30、杉 醇的HPLC检测图谱如图3。 0065 如图3所示， TYRZIF-8催化白藜芦醇所产生的产物与白皮杉醇标准品出峰时间一 致， 表明TYRZIF-8催化生成的物质确定为白皮杉醇。 0066 实施例3 0067 各种因素对TYRZIF-8合成白皮杉醇(多酚类化合物)的影响。 0068 L-抗坏血酸浓度对白皮杉醇产率的影响： 反应体系体积2mL,用磷酸缓冲液(100mM 或者200mM)配制含不同L-抗坏血酸浓度的白藜芦醇底物溶液， 其中L-抗坏血酸浓度分别为 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80mM， 白藜芦醇浓度为20mM， 反应体系pH保持在6.0-6.28之间， TYR。

31、 ZIF-8质量为10mg， 在30， 220rpm的摇床中反应3h。 得到不同L-抗坏血酸浓度对白皮杉醇 产率的影响， 结果如图4A所示。 当L-抗坏血酸等于60mM时， 反应3h， 产率达到最大为73.8。 0069 反应体系温度对白皮杉醇产率的影响： 反应体系体积2mL,100mM磷酸缓冲液配制 含L-抗坏血酸的白藜芦醇底物溶液， 其中L-抗坏血酸浓度为60mM,白藜芦醇浓度为20mM,反 说明书 5/8 页 7 CN 110819617 A 7 应体系pH为6.02， TYRZIF-8质量为10mg， 在不同温度10、 15、 20、 25、 30、 35、 40 、 50， 220r。

32、pm的摇床中反应3h， 得到不同温度对白皮杉醇产率的影响。 结果如图4B所示。 15-30范围内， 温度对白皮杉醇产率影响不大， 其中20时， 反应3h产率达到最大为 74.6。 0070 反应体系pH对白皮杉醇产率的影响:反应体系体积2mL， 磷酸缓冲液(100mM或者 200mM)配制含L-抗坏血酸的白藜芦醇底物溶液， 其中L-抗坏血酸浓度为60mM,白藜芦醇浓 度为20mM,在不同反应pH5.0、 5.64、 6.04、 6.65、 7.09、 7.5条件下， 加入10mg TYRZIF-8， 在 30， 220rpm的摇床中反应3h， 得到不同pH对白皮杉醇产率的影响。 结果如图4C所。

33、示。 pH6.0-7.0范围内， pH对TYRZIF-8催化白藜芦醇的影响不大， 其中pH6.65时， 反应3h产率达 到最大为77.1。 0071 反应体系TYRZIF-8作为催化剂的用量对白皮杉醇产率的影响:反应体系体积 2mL， 100mM磷酸缓冲液配制含L-抗坏血酸的白藜芦醇底物溶液， 其中L-抗坏血酸浓度为 60mM， 白藜芦醇浓度为20mM， 反应体系pH为6.02， 加入不同TYRZIF-8质量5mg、 7.5mg、 10mg、 15mg、 20mg、 30mg， 在30， 220rpm的摇床中反应3h， 得到不同TYRZIF-8质量对白皮杉醇产 率的影响。 结果如图4D所示。 。

34、TYRZIF-8为15mg时， 反应3h产率达到最大为79.8。 0072 所述实施例3， 其中添加终体积分数为25DMSO(v/v)到磷酸缓冲液中对底物助 溶， 反应过程每隔0.5h， 取出反应液进行离心(1min， 10000rpm)， 而后从反应体系中取出50 L上清液， 并用50的乙腈溶液稀释20倍(稀释至1000 L)， 经过0.22 m滤膜过滤， 以HPLC测 定底物和产物含量。 0073 实施例4 0074 响应曲面法对白皮杉醇产率优化 0075 利用响应曲面法(Response surface methodolog， RSM)， 选择Central Composite Desi。

35、gn(CCD)作为优化反应的模型,以L-抗坏血酸浓度(50-70mM)、 温度(15-25)、 TYR ZIF-8(10-20mg)为三个自变量进行试验设计， 根据软件给出的20个实验组进行试验， 底物 白藜芦醇浓度为20mM， 利用HPLC检测每个实验组的产物与底物含量， 其3D模型结果如图5A 所示。 0076 根据软件给出最优条件设计实验组， 其中实验组条件为L-抗坏血酸浓度68mM、 温 度15、 TYRZIF-8质量18.6mg， 以白藜芦醇浓度20mM为底物溶液， 得到白皮杉醇产率与反 应时间的关系。 结果如图5B所示。 经过RSM优化后， 反应3h得到白皮杉醇产率最大为86.0。。

36、 0077 实施例5 0078 L-多巴的HPLC检测图谱。 0079 岛津高效液相色谱仪， 采用反向C18柱(日本GLSciences， Inc公司， InertsilODS- SP， 4.6150mm， 5 m)， 该液相条件为流动相A:去离子水： 甲醇： 磷酸979.5： 19.5:1(v/v/ v),PH2.0； 进样量10 L； 总流速为1.0mL/min， 检测波长为282nm； 柱温为27。 0080 用磷酸缓冲液(pH7.0， 100mM)精确配制系列浓度的L-多巴标准液， 经HPLC检测L- 多巴出峰时间。 TYRZIF-8催化所产生的L-多巴以HPLC检测定性定量分析。 L。

37、-多巴的HPLC检 测图谱如图6所示。 0081 如图6所示， TYRZIF-8催化酪氨酸所产生的产物与L-多巴标准品出峰时间一致， 表明TYRZIF-8催化生成的物质确定为L-多巴。 说明书 6/8 页 8 CN 110819617 A 8 0082 实施例6 0083 TYRZIF-8催化酪氨酸制备L-多巴。 0084 反应体系体积10mL,磷酸缓冲液(pH6.7， 50mM)配制含L-抗坏血酸的酪氨酸底物溶 液， 其中L-抗坏血酸浓度为12mM,酪氨酸浓度为2mM， 反应体系pH为6.15， 加入40mg的TYR ZIF-8作为催化剂， 在30， 250rpm的摇床中反应1.5h， 其中。

38、反应过程每隔0.5h， 取出反应液 进行离心(1min， 10000rpm)， 而后从反应体系中取出1mL上清液用HPLC测定底物和产物含 量。 得到L-多巴产率与反应时间的关系。 结果如图7所示。 反应进行到1.5h时,L-多巴的最大 产率为52.5。 0085 实施例7 0086 3 -羟基紫檀茋的HPLC检测图谱。 0087 岛津高效液相色谱仪， 采用反向C18柱(日本GLSciences， Inc公司， InertsilODS- SP， 4.6150mm， 5 m)， 该液相条件为： 流动相A为0.5乙酸/乙腈95/5(v/v)， 流动相B为 乙腈/0.5乙酸95/5(v/v)， A/。

39、B50/50(v/v)； 进样量10 L； 总流速为1.0mL/min， 检测波 长为306nm； 柱温为29。 0088 用50(v/v)乙腈精确配制系列浓度的3 -羟基紫檀茋标准液， 经HPLC检测3 -羟 基紫檀茋出峰图谱。 TYRZIF-8催化所产生的3 -羟基紫檀茋以HPLC检测定性定量分析。 3 - 羟基紫檀茋的HPLC检测图谱如图8所示。 0089 如图8所示， TYRZIF-8催化紫檀茋所产生的产物与3 -羟基紫檀茋出峰时间一致， 表明TYRZIF-8催化生成的物质确定为3 -羟基紫檀茋。 0090 实施例8 0091 TYRZIF-8催化紫檀茋制备3 -羟基紫檀茋。 0092。

40、 反应体系体积2mL， 磷酸缓冲液(pH8.0， 50mM)配制含L-抗坏血酸的紫檀茋底物溶 液， 其中L-抗坏血酸浓度为30mM， 紫檀茋浓度为20mM， 反应体系pH为5.95， 加入30mg的TYR ZIF-8作为催化剂， 在25， 250rpm的摇床中反应3h， 其中反应过程每隔0.5h， 取出反应液进 行离心(1min， 10000rpm)， 每0.5h将5mL离心管取出， 离心(10000rpm， 1min)， 取40 L上清液 用50(v/v)乙腈稀释20倍(稀释至800 L)， 涡旋震荡混合均匀后， 0.22 m滤头过滤后用 HPLC测定底物和产物含量。 得到3 -羟基紫檀茋产。

41、率与反应时间的关系。 结果如图9所示。 反 应进行到3h时,3 -羟基紫檀茋的最大产率为64.8。 0093 综上所述， 本发明提供一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法， 通过 “一锅法” 合成酪氨酸酶-金属有机骨架复合物， 使金属离子或金属簇与有机配体在酪氨酸 酶的诱导下络合形成金属有机骨架， 同时在反应过程中金属有机骨架能进一步生长形成酪 氨酸酶的保护壳， 从而实现对酪氨酸酶的固定化， 固定化后的酪氨酸酶具有较高的催化性 能。 酪氨酸酶-金属有机骨架复合物作为催化剂， 以单苯酚类化合物作为反应物， 在一定反 应条件下合成所述多酚类化合物， 在反应体系中添加还原剂以抑制醌类物质生成，。

42、 可以进 一步提高多酚类化合物产率。 本发明提供的一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备 方法合成工艺简单， 容易操作， 对反应条件要求低， 对于工业生产多酚类化合物有潜在应 用。 0094 应当理解的是， 本发明的应用不限于上述的举例， 对本领域普通技术人员来说， 可 以根据上述说明加以改进或变换， 所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保 说明书 7/8 页 9 CN 110819617 A 9 护范围。 说明书 8/8 页 10 CN 110819617 A 10 图1 图2A 说明书附图 1/8 页 11 CN 110819617 A 11 图2B 图2C 说明书附图 2/8 页 12 CN 110819617 A 12 图3 图4A 说明书附图 3/8 页 13 CN 110819617 A 13 图4B 图4C 说明书附图 4/8 页 14 CN 110819617 A 14 图4D 图5A 说明书附图 5/8 页 15 CN 110819617 A 15 图5B 图6 说明书附图 6/8 页 16 CN 110819617 A 16 图7 图8 说明书附图 7/8 页 17 CN 110819617 A 17 图9 说明书附图 8/8 页 18 CN 110819617 A 18 。