检测神经鞘氨醇己三糖苷的多通道质谱衍生试剂及其制备方法与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911257634.4 (22)申请日 2019.12.10 (71)申请人 曲阜师范大学 地址 273165 山东省济宁市曲阜市静轩西 路57号 (72)发明人 赵先恩胡静雯朱树芸 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 陈娟 (51)Int.Cl. C07D 498/06(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/32(2006.01) G01N 30/34(2006.01。

2、) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种检测神经鞘氨醇己三糖苷的多通道质 谱衍生试剂及其制备方法与应用 (57)摘要 本发明属于分析化学技术领域， 具体涉及一 种检测神经鞘氨醇己三糖苷的多通道质谱衍生 试剂及其制备方法与应用， 该检测分析方法利用 基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂， 虚拟磁 性表面分子印迹萃取联合超高效液相色谱三重 四极杆质谱检测对神经鞘氨醇己三糖苷进行检 测。 该衍生试剂的结构式为： ； 本发明首次设 计合成基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂， 衍生试剂独特的分子内永久正电荷以及9通道的 同位素质量差异基团， 本发明的方法具有分析通 量高、 特异性。

3、好、 准确度高、 灵敏度高的优点。 本 发明的分析方法适用性好， 对于药物治疗监控具 有重要意义。 权利要求书2页 说明书9页 附图3页 CN 111057067 A 2020.04.24 CN 111057067 A 1.一种基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂， 其特征在于， 所述试剂的结构式为： ； 所述R为CH3、 CH2D、 CHD2、 CD3、 13CD3、 C2H5、 C2H3D2、 C2H2D3或C2D5。 2.一种如权利要求1所述的多通道质谱衍生试剂的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： a. 将1.5 g左氧氟沙星溶于100 mL色谱乙腈中， 超声处理2分钟， 加入10。

4、.038 g 碳酸 氢铵、 48.6 mmol CH3I、 CH2DI、 CHD2I、 CD3I、 13CD3I、 C2H5Br、 C2H3D2I、 C2H2D3I或C2D5I， 放入磁子 后密封， 在室温下搅拌150小时； 抽滤得到的固体在50 的真空烘箱中干燥7-8h， 得白色固体； b. 取0.5 g 白色固体溶解在5 mL新蒸的氯化亚砜中， 磁力搅拌， 升温至80 ， 回流4 h， 减压蒸除氯化亚砜， 冷却至室温， 得到的红色固体即为CH3-LFC-Cl、 CH2D-LFC-Cl、 CHD2- LFC-Cl、 CD3-LFC-Cl、 13CD3-LFC-Cl、 C2H5-LFC-Cl、。

5、 C2H3D2-LFC-Cl、 C2H2D3-LFC-Cl或C2D5-LFC- Cl； C3H7-LFC-Cl的合成方法与上述9种质谱衍生试剂的合成过程相似， 不同在于， a步骤中 使用C3H7Br。 3.一种利用权利要求1或2所述的基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂检测神经鞘 氨醇己三糖苷的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 将9个基于左氧氟沙星的多通道质谱衍 生试剂对目标物进行衍生反应： 其中CH3-LFC-Cl与神经鞘氨醇己三糖苷(lyso-Gb3)的衍生 物作为质谱定量的内标物， 其余8个衍生试剂CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-。

6、 LFC-Cl分别标记8个实际样品； C3H7-LFC-Cl与lyso-Gb3的合成产物作为虚拟模板用于磁性 表面分子印迹材料的合成， 利用虚拟磁性表面分子印迹材料对上述9个衍生物进行萃取， 洗 脱液经滤膜过滤后联合超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 具体包括以下步骤： a. 标记衍生化过程： 取50 L标准品溶液或待测样品， 加入含有200 L pH 8.5-10.5 硼酸钠缓冲溶液的离心管中， 分别注入200 L 55-70 M的CH3/CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C2H5/ C2H3D2/C2H2D3/C2D5-L。

7、FC-Cl进行标记衍生， 其中CH3-LFC-Cl与lyso-Gb3的衍生物作为内标 物， 摇匀后密封， 在温度37-40 水浴中超声波振荡反应1-4分钟； b. 萃取过程： 从上述9份样品中各吸取100 L溶液于离心管中均匀混合， 加入200 L pH 7.5-9的硼酸钠缓冲溶液、 8-15 mg虚拟磁性表面分子印迹材料， 摇匀后密封， 在室温下 剧烈震荡10-20分钟， 最后用外部磁铁实现分离， 加入200 L解吸附溶液进行洗脱2-4分钟； c. 将步骤b中的洗脱液经滤膜过滤后定容至200 L后利用超高效液相色谱三重四极 杆质谱系统进行定量分析检测。 权利要求书 1/2 页 2 CN 11。

8、1057067 A 2 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述虚拟磁性表面分子印迹材料通过以下 方法制备而成： a. 1 g 六水合三氯化铁， 2 g无水乙酸钠和6.5 g 1,6-己二胺在剧烈搅拌下依次分散 在30 mL乙二醇中， 室温下连续搅拌30分钟； 将上述溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中， 200 反应24小时； 所得产物用水和乙醇各洗三次， 60 下真空干燥24小时， 得到的黑色固体为Fe3O4 NH2； b. 100 mg Fe3O4NH2， 200 mg 4-甲酰基苯硼酸和250 mg 氰基硼氢化钠分散在25 mL 无水甲醇中， 超声处理20分钟， 65 下回流24小时。

9、， 水和甲醇各洗三次， 60 下真空干燥 24小时， 得到的黑色固体为Fe3O4NH2FPBA； c. 0.4 mg lyso-Gb3， 10 mL二氯甲烷和20 L吡啶在冰浴中均匀混合， 0.3587 mg C3H7-LFC-Cl溶解于10 mL二氯甲烷中， 倒入恒压漏斗， 缓慢滴加到反应瓶中， 2小时后移开 冰浴， 室温下继续搅拌2小时， 添加5 mL pH 9.5的碳酸钠缓冲液反应0.5小时， 过滤以获得 固体产物： C3H7-LFC-Cl-lyso-Gb3； d. 0.6 mg C3H7-LFC-Cl-lyso-Gb3、 50 mg Fe3O4NH2FPBA溶解于20 mL 20 mM。

10、 pH 8的 磷酸盐缓冲液中； 25 搅拌1小时， 用磷酸盐缓冲液漂洗两次， 水和乙醇洗两次， 60 下真空干燥24小 时； 10 mL乙腈做溶剂溶解前产物， 加入0.1422 mg丙烯酰胺， 超声15 min， 暗处理12 h； 1.9822 mg乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.1 mg偶氮二异丁腈均匀分散在预聚合溶液中， 超声15 min， 加入70 mL乙腈， 氮气净化， 机械搅拌下60 反应8 h， 75-80 反应2 h， 在外 磁铁作用下分离， 水和乙醇各洗三次， 60 下真空干燥24 h， 80 索式提取24 h除模板， 水和乙醇各洗三次， 60 真空干燥24 h， 得到的固体粉末为虚。

11、拟磁性表面分子印迹聚合 物。 6.根据权利要求4或5所述的方法， 其特征在于， 所述解吸附溶液为乙腈， 甲醇， 乙醇， 丙 酮， 0.01%-0.20%甲酸的甲醇/H2O (v/v, 1:1)溶液。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述解吸附溶液为0.1%甲酸的甲醇/H2O (v/v, 1:1)溶液。 8.根据权利要求3-7任一项所述的方法， 其特征在于， 所述超高效液相色谱三重四极杆 串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱： 2.1 mm 50 mm， 1.8 m， 进样体积 为2 L， 柱温30 ， 采用梯度洗脱法。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 。

12、所述梯度洗脱法， 时间为2.0 min， 流速为 0.2 mL/min， 流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸， 流动相B为乙腈含有0.1%甲酸， 0 min 流动相组成为40%A+60%B， 0.5 min时15%A+85%B， 1.5 min时8%A+92%B， 1.6 min时2%A+98%B， 2.0 min时0%A+100%B； 所述流动相中各分数均为体积分数。 10.根据权利要求8或9所述的方法， 其特征在于， 所述超高效液相色谱三重四极杆串联 质谱系统进行分析检测时的质谱的条件为： 干燥气温度300 ， 流速10 L/min， 喷雾器气压 40 psi， 鞘气温度280 ， 。

13、流速11 L/min， 毛细管电压3.5 kV。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111057067 A 3 一种检测神经鞘氨醇己三糖苷的多通道质谱衍生试剂及其制 备方法与应用 技术领域 0001 本发明属于分析化学技术领域,具体涉及一种检测神经鞘氨醇己三糖苷的多通道 质谱衍生试剂及其制备方法与应用， 尤其是涉及利用基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试 剂进行标记衍生， 虚拟磁性表面分子印迹萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测的 高通量分析方法。 背景技术 0002 随着医学的发展和进步,人们对罕见病的重视程度有了极大的提高。 法布里病是 由 -半乳糖苷酶A缺乏引起的X连锁的溶酶体贮积症， 。

14、该缺陷导致鞘糖脂的积聚， 主要是神 经酰胺己 三糖苷 (g lo botria osylceramid e ,G b3) 和神经 鞘氨醇己 三糖苷 (globotriaosylsphingosine,lyso-Gb3,CAS NO.:126550-86-5)贮积在人体的血管、 神经、 肾脏、 心脏等组织器官,引起相应组织器官的结构和功能障碍。 临床表现呈现多样性： 肢端 疼痛、 血管角质瘤、 肾功能衰竭、 心室肥厚、 焦虑抑郁等， 若不加以重视， 极易漏诊、 误诊。 然 而血浆中Gb3的浓度不能明显地与正常受试者区分， 大多数经典法布里病患者都可以通过 血浆中升高的lyso-Gb3来辨别， 因。

15、此准确定量lyso-Gb3可以用作临床检验的诊断指标。 0003 然而， 实际检测样品中存在严重的基质干扰， 且健康受试者的血浆lyso-Gb3浓度 极低， 建立一种高灵敏度、 高准确度的检测分析方法是十分必要的。 Breemen等人 (Biochimica et Biophysica Acta,2011,1812:70-76)公开了一种利用邻苯二甲醛作为衍 生化试剂， 通过高效液相色谱-荧光法对血浆中的lyso-Gb3分析检测的方法， 但该方法血浆 样品处理过程复杂， 衍生后直接进行色谱-荧光检测， 血浆样品中可能含有其他干扰lyso- Gb3检测的邻苯二甲醛反应性化合物， 并且该方法的检测。

16、限高、 灵敏度低； Gold等人 (Clinical Chemistry,2013,59:547-556)公开了一种利用13C5-lysoGb3作内标物， 结合超 高效液相色谱串联质谱法检测血浆中lyso-Gb3的分析方法， 但是稳定同位素内标物并非全 部商业化并且购买昂贵， 自合成条件苛刻， 并且合成物纯度决定定量结果的准确度。 因此， 继续开发一种高灵敏度、 高准确度的分析方法具有十分重要的意义。 发明内容 0004 本发明的目的在于解决现有检测技术的不足， 首次设计合成了一种基于左氧氟沙 星 (LFC)的多通道质谱衍生试剂。 0005 本发明还提供了一种上述基于左氧氟沙星(LFC)的多通。

17、道质谱衍生试剂的制备方 法。 0006 本发明还提供了一种利用上述多通道质谱衍生试剂在检测神经鞘氨醇己三糖苷 中的应用， 通过内标法定量， 建立一种高通量、 高灵敏度、 高准确度、 高特异性的虚拟磁性表 面分子印迹萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测的分析方法。 一次液质联用进样 可同时实现8个实际样品的准确定量分析， 提高准确度的同时大大缩短了分析时间。 说明书 1/9 页 4 CN 111057067 A 4 0007 本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为： 本发明提供了一种基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂， 所述试剂的结构式为： 所述R为CH3、 CH2D、 CHD2、 CD3。

18、、 13CD3、 C2H5、 C2H3D2、 C2H2D3或C2D5。 0008 本发明还提供了一种上述多通道质谱衍生试剂的制备方法， 包括以下步骤： a.将1.5g左氧氟沙星溶于100mL色谱乙腈中， 超声处理2分钟， 加入10.038g碳酸氢铵、 48.6mmol CH3I、 CH2DI、 CHD2I、 CD3I、 13CD3I、 C2H5Br、 C2H3D2I、 C2H2D3I或 C2D5I， 放入磁子后密 封， 在室温下搅拌150小时。 抽滤得到的固体在50的真空烘箱中干燥7-8h， 得白色固体； b.取0.5g白色固体溶解在5mL新蒸的氯化亚砜中， 磁力搅拌， 升温至80， 回流4h。

19、， 减压 蒸除氯化亚砜， 冷却至室温， 得到的红色固体即为CH3-LFC-Cl、 CH2D-LFC-Cl、 CHD2- LFC-Cl、 CD3-LFC-Cl、 13CD3-LFC-Cl、 C2H5-LFC-Cl、 C2H3D2-LFC-Cl、 C2H2D3-LFC-Cl或 C2D5-LFC-Cl。 0009 C3H7-LFC-Cl的合成方法与上述9种质谱衍生试剂的合成过程相似， 不同在于， a步 骤中使用C3H7Br。 0010 本发明还提供了一种利用上述基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂检测神经 鞘氨醇己三糖苷的方法， 包括以下步骤： 将9个基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂对目 标物进行衍。

20、生反应： 其中CH3-LFC-Cl与lyso-Gb3的衍生物作为质谱定量的内标物， 其余8个 衍生试剂CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-LFC-Cl分别标记8个实际样品； C3H7-LFC-Cl与lyso-Gb3的合成产物作为虚拟模板用于磁性表面分子印迹材料的合成， 利用 虚拟磁性表面分子印迹材料对上述9个衍生物进行萃取， 洗脱液经滤膜过滤后联合超高效 液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。 0011 本发明提供的检测方法具体包括以下步骤： a.标记衍生化过程： 取50 L标准品溶液或待测样品， 加入含有200 L pH 8.5-10。

21、.5硼酸 钠缓冲溶液的离心管中， 分别注入200 L 55-70 M的 CH3/CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C2H5/C2H3D2/ C2H2D3/C2D5-LFC-Cl进行标记衍生， 其中CH3- LFC-Cl与lyso-Gb3的衍生物作为内标物， 摇匀 后密封， 在温度37-40水浴中超声波振荡反应1-4分钟； b.萃取过程： 从上述9份样品中各吸取100 L溶液于离心管中均匀混合， 加入200 L pH 7.5-9的硼酸钠缓冲溶液、 8-15mg虚拟磁性表面分子印迹材料， 摇匀后密封， 在室温下剧烈 震荡10-20分钟， 最后用外部磁铁实现分离， 加入200 L解吸附溶液进行。

22、洗脱2-4分钟； c.将步骤b中的洗脱液经滤膜过滤后定容至200 L后利用超高效液相色谱三重四极杆 质谱系统进行定量分析检测。 0012 本发明检测过程中， 所使用的虚拟磁性表面分子印迹材料通过以下方法制备而 成： a.1g六水合三氯化铁， 2g无水乙酸钠和6.5g 1,6-己二胺在剧烈搅拌下依次分散在 说明书 2/9 页 5 CN 111057067 A 5 30mL 乙二醇中， 室温下连续搅拌30分钟。 将上述溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中， 200反 应 24小时。 所得产物用水和乙醇各洗三次， 60下真空干燥24小时， 得到的黑色固体为 Fe3O4NH2； b.100mg Fe3O4NH。

23、2， 200mg 4-甲酰基苯硼酸和250mg氰基硼氢化钠分散在25mL无水甲 醇中， 超声处理20分钟， 65下回流24小时， 水和甲醇各洗三次， 60下真空干燥 24小时， 得到的黑色固体为Fe3O4NH2FPBA； c.0.4mg lyso-Gb3， 10mL二氯甲烷和20 L吡啶在冰浴中均匀混合， 0.3587mg C3H7- LFC-Cl溶解于10mL二氯甲烷中， 倒入恒压漏斗， 缓慢滴加到反应瓶中， 2小时后移开冰浴， 室 温下继续搅拌2小时， 添加5mL pH 9.5的碳酸钠缓冲液反应0.5小时， 过滤以获得固体产物： C3H7-LFC-Cl-lyso-Gb3； d.0.6mg 。

24、C3H7-LFC-Cl-lyso-Gb3、 50mg Fe3O4NH2FPBA溶解于20mL 20mM pH 8的磷酸 盐缓冲液中。 25搅拌1小时， 用磷酸盐缓冲液漂洗两次， 水和乙醇洗两次， 60下真空干燥 24小时。 10mL乙腈做溶剂溶解前产物， 加入0.1422mg丙烯酰胺， 超声15min， 暗处理12h。 1.9822mg乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.1mg偶氮二异丁腈均匀分散在预聚合溶液中， 超声 15min， 加入70mL乙腈， 氮气净化， 机械搅拌下60反应8h， 75-80反应2h， 在外磁铁作用下 分离， 水和乙醇各洗三次， 60下真空干燥24h， 80索式提取 24h除模。

25、板， 水和乙醇各洗三 次， 60真空干燥24h， 得到的固体粉末为虚拟磁性表面分子印迹聚合物。 0013 进一步的， 所述解吸附溶液为乙腈， 甲醇， 乙醇， 丙酮， 0.01-0.20甲酸的甲醇 /H2O(v/v,1:1)溶液。 最优化的， 所述解吸附溶液为0.1甲酸的甲醇/H2O(v/v,1:1)溶液。 0014 本发明所使用的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷 伦SB C18色谱柱： 2.1mm50mm， 1.8 m， 进样体积为2 L， 柱温30， 采用梯度洗脱法。 0015 上述梯度洗脱法， 时间为2.0min， 流速为0.2mL/min， 流动相A为5乙腈水溶液含。

26、 有0.1甲酸， 流动相B为乙腈含有0.1甲酸， 0min流动相组成为40A+60B， 0.5 min时 15A+85B， 1.5min时8A+92B， 1.6min时2A+98B， 2.0min时 0A+100B； 所述流 动相中各分数均为体积分数。 0016 本发明所使用的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测时的质 谱的条件为： 干燥气温度300， 流速10L/min， 喷雾器气压40psi， 鞘气温度280， 流速 11L/min， 毛细管电压3.5kV。 0017 本发明提供了一种待测样品中lyso-Gb3的检测分析方法， 首先基于左氧氟沙星的 多通道质谱衍生试剂对所述的l。

27、yso-Gb3进行标记衍生， 随后进行虚拟磁性表面分子印迹萃 取， 得到的衍生物洗脱液经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行 分析检测， 可以实现实际样品的高通量分析检测。 0018 本发明所述的9个基于左氧氟沙星的质谱衍生试剂及其类似物C3H7-LFC-Cl的化学 结构和合成条件如下所示： 说明书 3/9 页 6 CN 111057067 A 6 本发明首次设计合成含有一个分子内永久正电荷的基于左氧氟沙星的多通道质谱衍 生试剂： CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-LFC-Cl分别衍生8个实际样品中的 lyso- Gb3，。

28、 CH3-LFC-Cl与lyso-Gb3的衍生物作为内标物。 Lyso-Gb3通过衍生标记反应得到 相应的衍生物， C3H7-LFC-Cl与lyso-Gb3的合成产物作为虚拟模板合成磁性表面分子印迹材 料， 结合虚拟磁性表面分子印迹萃取和内标法准确定量， 串联质谱多反应监测模式， 特异性 的产生了含有质量差异基团标记的左氧氟沙星结构的子离子， 质谱检测灵敏度显著提高的 同时大大提高了分析通量。 该检测方法具有高通量、 高灵敏度、 高准确度和高特异性的显著 优势。 以CH3-LFC-Cl为例， 其作为质谱衍生试剂的衍生化反应过程如下所示： 本发明采用虚拟磁性表面分子印迹材料萃取富集多种衍生物， 。

29、C3H7-LFC-Cl-lyso-Gb3 作虚拟模板合成分子印迹材料， 有效地解决了模板分子泄露造成定量不准确的问题。 材料 优势在于磁性表面分子印迹材料比表面积大， 传质速度快， 少量吸附剂和较短平衡时间即 可完成萃取富集； 经硼酸基和分子印迹层修饰， 本文合成的材料能对lyso-Gb3的衍生物实 现特异选择性萃取； 此外， 该材料仅需一外部磁铁即可轻松实现分离， 并且还具有优良的可 重复利用性。 虚拟磁性表面分子印迹技术是一种良好的富集痕量组分、 降低基质干扰、 提高 方法灵敏度的前处理技术， 联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测对8个实际样品中的 lyso-Gb3 同时进行定量分析， 具。

30、有显著优势。 0019 本发明的优点及有益效果： 1.本发明首次设计合成基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂， 衍生试剂独特的分子 内永久正电荷以及9通道的同位素质量差异基团， 显著提高了分析物的色谱分离度、 检测灵 敏度和分析通量。 0020 2.本发明所提供的虚拟磁性表面分子印迹萃取的前处理技术， 通过硼酸盐亲和力 和分子印迹空间匹配空腔的双重结合特异性地捕获并释放lyso-Gb3的衍生物， 联合超高效 液相色谱三重四极杆质谱检测手段， 具有特异性好、 准确度高、 灵敏度高的优点。 0021 3.本发明的分析方法适用性好， 对于药物治疗监控具有重要意义。 说明书 4/9 页 7 CN 111。

31、057067 A 7 附图说明 0022 图1为多通道质谱衍生试剂及其制备方法和应用的概览图。 0023 图2为实施例1中9个lyso-Gb3衍生物的质谱检测分离图。 0024 图3为实施例1中CH3-LFC-Cl-lyso-Gb3衍生物质谱裂解机理示意图。 0025 图4为实施例3模拟法布里病人血浆中lyso-Gb3衍生物质谱检测分离图。 具体实施方式 0026 下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述， 下述说明仅为了解释本发明， 并不 对其内容进行限定。 0027 本发明中衍生化萃取物经0.22 m滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串 联质谱系统进行分析检测， 图1为多通道质谱衍生试剂。

32、及其制备方法和应用的概览图。 0028 本发明所使用的基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂合成方法如下： a.将1.5g 左氧氟沙星溶于100mL色谱乙腈中， 超声处理2分钟， 加入10.038g碳酸氢铵、 48.6mmol CH3I， 放入磁子后密封， 在室温下搅拌150小时。 抽滤得到的固体在50的真空烘箱中干燥 7-8h。 得到的白色固体为： CH3-LFC。 0029 CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5LFC的合成方法与CH3-LFC的合成相 似， 用CH2DI、 CHD2I、 CD3I、 13CD3I、 C2H5Br、 C2H3D2I。

33、、 C2H2D3I和C2D5I代替CH3I； b.取0.5g CH3- LFC溶解在5mL新蒸的氯化亚砜中， 磁力搅拌， 升温至80， 回流4h， 减压蒸除氯化亚砜， 冷却 至室温， 得到的红色固体即为CH3-LFC-Cl。 CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5- LFC-Cl的合成方法与CH3-LFC-Cl的合成相似， 用CH2D-LFC、 CHD2-LFC、 CD3-LFC、 13CD3-LFC、 C2H5-LFC、 C2H3D2-LFC、 C2H2D3-LFC和C2D5-LFC代替CH3-LFC。 C3H7-LFC-Cl的合成方法与上述9。

34、 种质谱衍生试剂的合成过程相似， 不同在于， a步骤中使用C3H7Br代替CH3I， b步骤中使用a中 合成的 C3H7-LFC代替CH3-LFC。 0030 本发明实施例中进行应用检测时， 使用的血浆包括两种： 去脂血浆和正常人体血 浆。 去脂血浆中未发现待测物lyso-Gb3， 加标后用于分析方法建立； 正常血浆于当地医院获 得， 加标后来模拟法布里病患者， 通过控制加标浓度来模拟患病的不同阶段。 0031 实施例1 9个lyso-Gb3衍生物的色谱分离和质谱定性定量分析： 将去脂血浆添加到含有甲醇的离心管中， 血浆样品与甲醇的体积比为1:4， 涡旋两分钟 后离心去除不溶性蛋白质， 取上清。

35、液待用。 Lyso-Gb3(购自Sigma公司)， 用50乙腈/水/ 0.1甲酸溶液配制得到浓度为2000nM的lyso-Gb3标准品储备液， 稀释储备液以得到不同 浓度0.3-1800nM的lyso-Gb3标准品溶液， 将10 L不同浓度的lyso-Gb3标准品溶液分别添加 到 8份各50 L去脂血浆上清液中以获得不同浓度0.05-300nM的加标去脂血浆样品； CH3/ CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-LFC-Cl分别溶于乙腈得到60 M的衍生试剂乙 腈溶液。 取50 L摩尔浓度为5nM的lyso-Gb3标准品溶液和8份各50 L加标。

36、去脂血浆上清液， 加入含有200 L硼酸钠缓冲溶液(pH 9.5)的离心管中， 分别注入200 L摩尔浓度为60 M的9 个衍生试剂进行衍生， 其中CH3-LFC-Cl标记lyso-Gb3标准溶液所得的衍生物作为内标物。 摇匀后密封， 在温度40水浴中超声波振荡反应1分钟； 从上述9份样品中各吸取100 L溶液 于离心管中均匀混合， 加入200 L硼酸钠缓冲溶液(pH 8.5)、 10mg虚拟磁性表面分子印迹材 说明书 5/9 页 8 CN 111057067 A 8 料， 摇匀后密封， 在室温下剧烈震荡10分钟， 最后用外部磁铁实现分离， 加入200 L 0.1甲 酸的甲醇/H2O(v/v,。

37、1:1)溶液(0.1甲酸的甲醇/H2O (v/v,1:1)溶液作为解吸附溶液， 当该 处解吸附溶液改用乙腈， 甲醇， 乙醇， 丙酮， 0.01- 0.20甲酸的甲醇/H2O(v/v,1:1)溶液 时， 分析物萃取效率处于0.1甲酸的甲醇/H2O(v/v,1:1) 溶液做解吸附溶液时的59.7- 99.6之间)进行洗脱2分钟； 洗脱液经滤膜过滤后定容至200 L后进行UHPLC-MS/MS(MRM) 分析检测。 所述的梯度洗脱法， 时间为2.0min， 流速为 0.2mL/min， 流动相A为5乙腈水溶 液含有0.1甲酸， 流动相B为乙腈含有0.1甲酸， 0 min流动相组成为40A+60B， 。

38、0.5min时15A+85B， 1.5min时8A+92B， 1.6min 时2A+98B， 2.0min时0A+100 B； 质谱的条件为： 干燥气温度300， 流速10 L/min， 喷雾器气压40psi， 鞘气温度280， 流 速11L/min， 毛细管电压3.5kV。 0032 按照上述梯度洗脱程序能得到较好的分离度， 图2为9个lyso-Gb3衍生物的质谱检 测分离图， 9个衍生物之间分离度良好且保留时间相对紧凑。 质谱分析实验结果表明， 9个 lyso-Gb3的衍生物在多反应监测模式下产生m/z 359.16、 360.17、 361.18、 362.18、 363.19、 373。

39、.18、 375.19、 376.20、 378.21的特征产物离子用作定量子离子， 上述9个衍生物都是在酰 胺键处发生断裂， 因此其质谱碎裂模式具有一致性。 以CH3-LFC-Cl-lyso-Gb3为例， 图3 为 CH3-LFC-Cl-lyso-Gb3质谱裂解机理示意图， 母离子为M+m/z 1143.60能够产生m/z 359.16的定量子离子。 对MRM模式的参数进行了优化， 9个LFC-Cl-lyso-Gb3的保留时间、 MRM 离子对、 最优化碎裂电压(V)和碰撞能(eV)， 以及分析方法的线性范围、 相关系数、 检出限、 定量限见表1。 0033 表1 实施例2 正常人血浆中ly。

40、so-Gb3的检测分析， 包括以下操作步骤： 从当地医院收集了八份正常人体血浆样本(男： 4名， 女： 4名； 不同年龄阶段)， 随后添加 到含有甲醇的离心管中， 血浆样品与甲醇的体积比为1:4， 涡旋两分钟后离心去除不溶性蛋 白质， 取上清液待用； 用50乙腈/水/0.1甲酸溶液稀释实例1中的储备液得到浓度为5nM 的lyso-Gb3标准品溶液。 取50 L摩尔浓度为5nM的lyso-Gb3标准品溶液和8份各50 L 正常 血浆上清液， 加入含有200 L硼酸钠缓冲溶液(pH 10.5)的离心管中， 分别注入200 L 摩尔 浓度为70 M的CH3/CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C。

41、2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-LFC-Cl进行标记衍生， 其中 CH3-LFC-Cl标记lyso-Gb3标准溶液所得的衍生物作为内标物。 摇匀后密封， 在温度37水 浴中超声波振荡反应4分钟； 从上述9份样品中各吸取100 L溶液于离心管中均匀混合， 加入 说明书 6/9 页 9 CN 111057067 A 9 200 L硼酸钠缓冲溶液(pH 9)、 8mg虚拟磁性表面分子印迹材料， 摇匀后密封， 在室温下剧烈 震荡15分钟， 最后用外部磁铁实现分离， 加入200 L 0.1甲酸的甲醇/H2O(v/v,1:1)溶液 进行洗脱3分钟； 洗脱液经滤膜过滤后定容至200 L后进行 。

42、UHPLC-MS/MS(MRM)分析检测。 检 测到正常人血浆中lyso-Gb3含量(n3)分别为： 四份正常男性血浆： 0.52nM、 0.60nM、 0.73nM、 0.58nM； 四份正常女性血浆： 0.34nM、 0.37 nM、 0.41nM、 0.50nM。 0034 实施例3 模拟法布里病患者血浆中lyso-Gb3的检测分析， 包括以下操作步骤： 从当地医院收集了二十份随机血浆样本(男： 10名， 女： 10名； 不同年龄阶段)， 将血浆样 品按性别混合成两份， 将血浆添加到含有甲醇的离心管中， 血浆样品与甲醇的体积比为 1: 4， 涡旋两分钟后离心去除不溶性蛋白质， 取上清液待。

43、用。 Lyso-Gb3用50乙腈/水/0.1甲 酸溶液配制得到浓度为2000nM的lyso-Gb3标准品储备液， 稀释储备液以得到不同浓度 (40nM、 60nM、 150nM、 250nM、 600nM、 1500nM)的lyso-Gb3标准品溶液， 将10 L 不同浓度的 lyso-Gb3标准品溶液分别添加到8份各50 L血浆上清液中以获得不同浓度的加标血浆样 品， 不同的加标浓度来模拟法布里病的不同患病阶段。 取单份的50 L 5nM lyso-Gb3标准品 溶液和6份各50 L的模拟法布里病血浆上清液和2份各50 L的正常人体混合血浆上清液， 加 入含有200 L硼酸钠缓冲溶液(pH 。

44、9)的离心管中， 分别注入200 L 摩尔浓度为65 M的CH3/ CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-LFC-Cl进行标记衍生， 其中CH3-LFC-Cl标记 lyso-Gb3标准溶液所得的衍生物作为内标物。 摇匀后密封， 在温度37水浴中超声波振荡 反应3分钟； 从上述9份样品中各吸取100 L溶液于离心管中均匀混合， 加入200 L硼酸钠缓 冲溶液(pH 8)、 15mg虚拟磁性表面分子印迹材料， 摇匀后密封， 在室温下剧烈震荡20分钟， 最后用外部磁铁实现分离， 加入200 L 0.1甲酸的甲醇/H2O(v/v,1:1)溶液进行洗脱4。

45、分 钟； 洗脱液经滤膜过滤后定容至200 L后进行 UHPLC-MS/MS(MRM)分析检测。 检测到模拟法 布里患者血浆中lyso-Gb3含量(n3)分别为： 正常男性： 0.63nM， 正常女性： 0.40nM， 治疗前 法布里男性(min)： 101.43nM， 治疗前法布里男性(max)： 241.26nM， 治疗前法布里女性 (min)： 10.07nM， 治疗前法布里女性 (max)： 25.94nM， 治疗后法布里男性： 40.08nM， 治疗后 法布里女性： 6.73nM， 该样品质谱检测图见图4。 0035 实施例4 尿液中lyso-Gb3的检测分析， 包括以下操作步骤： 随。

46、机收集了二十份正常人尿液样本(男： 10名， 女： 10名)， 将尿液样品按性别混合成两 份， 将尿液添加到含有甲醇的离心管中， 尿液样品与甲醇的体积比为1.5:1， 涡旋5分钟后离 心， 取上清液待用。 Lyso-Gb3用50乙腈/水/0.1甲酸溶液配制得到浓度为2000nM的 lyso-Gb3标准品储备液， 稀释储备液以得到不同浓度(960pM、 3000pM、 12000pM、 24000pM) 的lyso-Gb3标准品溶液， 将10 L不同浓度的lyso-Gb3标准品溶液分别添加到8 份各50 L尿 液上清液中以获得不同浓度(160pM、 500pM、 2000pM、 4000pM)的。

47、加标尿液样品。 取50 L摩尔 浓度为5nM的lyso-Gb3标准品溶液和8份各50 L的加标尿液样品， 加入含有200 L硼酸钠缓 冲溶液(pH 8.5)的离心管中， 分别注入200 L摩尔浓度为 55 M的CH3/CH2D/CHD2/CD3/13CD3/ C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-LFC-Cl进行标记衍生， 其中CH3-LFC-Cl标记lyso-Gb3标准溶液所得 的衍生物作为内标物。 摇匀后密封， 在温度40 水浴中超声波振荡反应2分钟； 从上述9份 样品中各吸取100 L溶液于离心管中均匀混合， 加入200 L硼酸钠缓冲溶液(pH 7.5)、 10mg 说明书 7。

48、/9 页 10 CN 111057067 A 10 虚拟磁性表面分子印迹材料， 摇匀后密封， 在室温下剧烈震荡10分钟， 最后用外部磁铁实现 分离， 加入200 L 0.1甲酸的甲醇 /H2O(v/v,1:1)溶液进行洗脱2分钟； 洗脱液经滤膜过 滤后定容至200 L后进行UHPLC- MS/MS(MRM)分析检测。 检测到加标尿液样品中lyso-Gb3含 量(n3)分别为： 四份男性加标尿液样品中分析物的浓度： 162.4pM、 489pM、 1978pM、 4080pM， 四份女性加标尿液样品中分析物的浓度： 154.9pM、 490.5pM、 2038pM、 4124pM。 0036 对。

49、比例1 该对比例过程与实施例3相同， 检测血浆中的lyso-Gb3。 不同在于： 样品前处理过程中， 先对血浆中的lyso-Gb3进行提取， 然后进行衍生， 衍生试剂采用Breemen等人(Biochimica et Biophysica Acta,2011,1812:70-76)公开的邻苯二甲醛， 所得的衍生物直接进行高效 液相色谱- 荧光检测； 未在衍生后进行磁分散固相萃取。 0037 对比例2 该对比例过程与实施例3、 4相同， 检测血浆和尿液中的lyso-Gb3。 不同在于： 样品前处 理过程中， 采用Gold等人(Clinical Chemistry,2013,59:547-556)。

50、公开的未使用衍生试剂 衍生和未在衍生后进行磁分散固相萃取， 先对血浆和尿液中的lyso-Gb3进行提取， 自合成 13C5- lysoGb3作为内标结合超高效液相色谱串联质谱系统进行检测。 0038 对比例3 该对比例操作步骤与实施例4相同， 检测尿液中的lyso-Gb3。 不同在于： 样品前处理过 程中， 采用Auray-Blais等人(Clinica Chimica Acta,2010,411:1906-1914)公开的未使用 衍生试剂衍生和未在衍生后进行磁分散固相萃取， 先采用固相萃取法提取尿液中的lyso- Gb3， 然后使用1- -D-葡糖鞘氨醇作为内标进行液-质联用检测。 0039。