同步检测PnVY和TYLCCNV的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911262660.6 (22)申请日 2019.12.11 (71)申请人 云南农业大学 地址 650201 云南省昆明市盘龙区沣源路 452号云南农业大学 (72)发明人 李凡杨馨柳勤海谭冠林 兰平秀陈小姣 (74)专利代理机构 北京名华博信知识产权代理 有限公司 11453 代理人 李中强 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种同步检测PnVY。

2、和TYLCCNV的方法 (57)摘要 本发明涉及一种同步检测PNVY和TYLCCNV的 方法， 属于植物保护领域， 本发明涉及到的两种 病毒的核酸类型不同， 设计合成检测PnVY和 TYLCCNV的引物， 并筛选适用于两种病毒复合侵 染的特异性引物； 用CTAB法提取染病植物组织的 总核酸， 既能保证所提核酸中有DNA和RNA， 也能 降低检测成本； 优化一步法双重检测体系， 达到 对PnVY和TYLCCNV的同步快速检测。 该方法整个 检测过程所用时间短， 减少了试剂污染和反应中 的影响因素， 能够有效单一或复合识别PnVY、 TYLCCNV， 保证了检测结果的准确性。 权利要求书1页 说明。

3、书5页 附图1页 CN 111057789 A 2020.04.24 CN 111057789 A 1.一种同步检测PNVY和TYLCCNV的方法， 其特征在于： 包括如下步骤： 1） 引物设计合成： 分别设计合成检测PnVY和TYLCCNV的引物， 引物序列如下： PnVY： 正向引物(PnVYdF4 ) 5 -3 ： CGTACATCAAGTTCGGCTC 反向引物 （PnVYcRa2） 5 -3 ： TAATTGTCAGCACATCGTA TYLCCNV： 正向引物 （TYLCCNVF1） 5 -3 ： CCTGTATATGCGACTTTGAAAGT 反向引物 （TYLCCNVR1） 5。

4、 -3 ： CCCAATTCCAGCTATAAAGAGTA 2） CTAB法提取染病植物组织的总RNA和DNA， 作为RT-PCR扩增模板； 3） 一步法RT-PCR扩增； 4） 琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。 2.根据权利要求1所述的一种同步检测PNVY和TYLCCNV的方法， 其特征在于： 步骤1） 中， 所述的检测PnVY的引物为ssRNA， 其扩增片段大小为1032bp； 所述的检测TYLCCNV的引物为 ssDNA， 其扩增片段大小为650bp。 3.根据权利要求1所述的一种同步检测PNVY和TYLCCNV的方法， 其特征在于： 步骤2） 中， 所述CTAB法提取感病植物组织的总核酸步。

5、骤如下： 称取100mg液氮研磨成粉状的病叶样品 至1.5 mL离心管中， 加入1.2 mL CTAB缓冲液； 65温浴4560 min； 13000 r/min离心10 min， 取650 L上清至一新的1.5 mL离心管， 加入等体积氯仿/异戊醇 （24:1） ， 涡旋震荡混匀 30 s； 13000 r/min离心10 min， 小心转移5 00 L上清液至一新的1.5 mL离心管中， 加入 350 L异丙醇， 轻轻颠倒离心管充分混匀液体， 室温放置10 min， 13000 r/min离心15 min， 小心地用微量移液器吸出上清； 沉淀加入500 L 75% 乙醇， 13000 r/。

6、min离心10 min， 小心 地用微量移液器吸出上清， 室温下自然干燥沉淀1015 min； 加入100 LddH2O并置于冰上 30min， 用微量移液器反复吹打液体使沉淀充分溶解， -20保存备用。 4.根据权利要求3所述的一种同步检测PNVY和TYLCCNV的方法， 其特征在于： 所述的 CTAB缓冲液包括2% CTAB、 2% PVP-40、 100mM Tris-HCl、 1.4 M NaCl、 20mM EDTA、 0.2%巯基 乙醇， pH 8.0。 5.根据权利要求1-4任一项所述的一种同步检测PNVY和TYLCCNV的方法， 其特征在于： 步骤3） 中， 一步法RT-PCR。

7、的反应体系为10L， 包括0.4 L PrimeScript 1 Step Enzyme Mix、 5L 2 1 Step Buffer、 10 M正反向引物PnVYdF4/ PnVYcRa2各0.35 L、 10 M正反向 引物TYLCCNVF1/TYLCCNVR1各0.25L、 ddH2O 2.4L 和模板1L 。 6.根据权利要求1-5任一项所述的一种同步检测PNVY和TYLCCNV的方法， 其特征在于： 步骤3） 中， 所述一步法RT-PCR的反应条件为： 50反转录30 min， 94 2 min， 94 30 s、 55 30 s、 72 1 min， 扩增35个循环， 72延伸1。

8、0 min后4保存。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111057789 A 2 一种同步检测PnVY和TYLCCNV的方法 技术领域 0001 本发明属于植物保护领域， 具体的说， 涉及一种同步检测PNVY和TYLCCNV的方法。 背景技术 0002 近年来， 随着三七种植区域在云南的不断扩展， 病毒病逐渐在云南各三七产区发 生为害， 对三七的产量和质量造成了明显的影响， 对云南三七产业构成了严重的威胁。 目前 在三七上主要的的病毒病为三七Y病毒(Panax virus Y， PnVY)、 中国番茄黄化曲叶病毒 (Tomato yellow leaf curl China virus， T。

9、YLCCNV)及其卫星中国番茄黄化曲叶病毒 DNA (Tomato yellow leaf curl China betasatellite， TYLCCNB)和三七A病毒(Panax virus A， PnVA)， 其中TYLCCNV、 TYLCCNB为单链DNA病毒， TYLCCNV属于双生病毒科 (Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)， 自然条件下由粉虱通过持久性传毒 方式传播， 寄主范围广泛。 PnVY是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属 (Potyvirus)的病毒， 为单链RNA病毒， 2010 年由Yan等发现并证实。 Pn。

10、VA为单组分RNA病毒 科(Totiviridae)单组分RNA病毒属(Totivirus) 的新病毒， 根据ICTV报告最新数据显示， dsRNA病毒已有203个确定种， 单分病毒科为dsRNA 病毒中第3大科。 由于田间三七病毒病样 品中PnVY和TYLCCNV的检出率最高， 而且二者存在复合侵染现象， 为了能够对田间三七样品 及病毒的传毒媒介昆虫进行高效、 快速和准确的检测， 提高病害发生的准确预测预报， 有必 要建立能同时对PnVY和TYLCCNV开展快速、 灵敏及准确检测的技术体系。 0003 目前检测鉴定植物病毒的方法主要有常规生物学检测、 血清学技术、 电镜技术和 分子生物学技术。

11、等。 常规生物学检测主要包括寄主范围测定、 传播途径测定、 鉴别寄主反应 等， 但需要耗费大量时间， 还受到季节、 环境等限制。 电镜技术常被运用到植物病毒的鉴定 中， 但对制备病毒样品材料要求较高且设备昂贵， 限制了电镜技术的广泛应用。 RT-PCR检测 方法灵敏度高于血清学方法， 而且整个检测过程所需时间短， 因此RT-PCR技术被广泛的运 用到植物病毒的检测， 但常规的两步法RT-PCR技术每次只能检测一种病毒， 对于多种病毒 复合侵染的情况检测耗费时间长。 发明内容 0004 为了克服背景技术中存在的问题， 本发明目的在于提供了一种同步检测PNVY和 TYLCCNV 的方法， 通过一步。

12、法RT-PCR技术， 可高效、 快速、 准确的对三七上发生的PnVY和 TYLCCNV 进行检测和鉴定。 0005 为实现上述目的， 本发明是通过如下技术方案实现的： 0006 所述的同步检测PNVY和TYLCCNV的方法， 包括如下步骤： 0007 1)设计合成： 0008 分别设计合成检测PnVY和TYLCCNV的引物， 引物序列如下： 0009 PnVY： 正向引物(PnVYdF4) 5 -3 ： CGTACATCAAGTTCGGCTC 0010 反向引物(PnVYcRa2) 5 -3 ： TAATTGTCAGCACATCGTA 说明书 1/5 页 3 CN 111057789 A 3 。

13、0011 TYLCCNV： 正向引物(TYLCCNVF1) 5 -3 ： CCTGTATATGCGACTTTGAAAGT 0012 反向引物(TYLCCNVR1) 5 -3 ： CCCAATTCCAGCTATAAAGAGTA 0013 2)CTAB法提取染病植物组织的总RNA和DNA， 作为RT-PCR扩增模板； 0014 3)法RT-PCR扩增； 0015 4)凝胶电泳检测扩增结果。 0016 进一步优选， 步骤1)中， 所述的检测PnVY的引物为ssRNA， 其扩增片段大小为 1032bp； 所述的检测TYLCCNV的引物为ssDNA， 其扩增片段大小为650bp。 0017 进一步优选，。

14、 步骤2)中， 所述CTAB法提取感病植物组织的总核酸步骤如下： 称取 100mg 液氮研磨成粉状的病叶样品至1.5mL离心管中， 加入1.2mL CTAB缓冲液； 65温浴45 60 min； 13000r/min离心10min， 取650 L上清至一新的1.5mL离心管， 加入等体积氯仿/异 戊醇(24:1)， 涡旋震荡混匀30s； 13000r/min离心10min， 小心转移500 L上清液至一新的 1 .5mL离心管中， 加入350L异丙醇， 轻轻颠倒离心管充分混匀液体， 室温放置10min， 13000r/min离心15min， 小心地用微量移液器吸出上清； 沉淀加入500 L 7。

15、5乙醇， 13000 r/min离心10min， 小心地用微量移液器吸出上清， 室温下自然干燥沉淀1015min； 加入100 LddH2O并置于冰上30min， 用微量移液器反复吹打液体使沉淀充分溶解， -20保存备用。 0018 进一步优选， 所述的CTAB缓冲液包括2CTAB、 2PVP-40、 100mM Tris-HCl、 1.4M NaCl、 20mM EDTA、 0.2巯基乙醇， pH 8.0。 0019 进一步优选 ， 步骤3)中 ， 一步法RT-PCR的反应体系为10L ， 包括0 .4L PrimeScript 1 Step Enzyme Mix、 5 L 21Step B。

16、uffer、 10 M正反向引物PnVYdF4/ PnVYcRa2各0.35 L、 10 M正反向引物TYLCCNVF1/TYLCCNVR1各0.25 L、 ddH2O 2.4 L和模板 1 L。 0020 进一步优选， 步骤3)中， 所述一步法RT-PCR的反应条件为： 50反转录30min， 94 2min， 94 30s、 55 30s、 72 1min， 扩增35个循环， 72延伸10min后4保存。 0021 本发明的有益效果： 0022 (1)本发明能有效单一或复合识别PnVY、 TYLCCNV， 保证了检测结果的准确性， 由于 本发明涉及到的这两种病毒的核酸类型不同， 因此针对P。

17、nVY和TYLCCNV设计了多对特异性 引物， 经过多次试验， 筛选出PnVYdF4/PnVYcRa2和TYLCCNVF1/TYLCCNVR1这两对引物作为一 步法双重检测的引物。 本发明对稀释至10-2的样品模板仍能同时检测到PnVY 和TYLCCNV， 特 异性强、 灵敏度高。 0023 (2)本发明使PnVY和TYLCCNV的检测比两步法RT-PCR更简便， 减少了检测时间和试 剂污染等因素。 附图说明 0024 图1： 田间三七样品复合感染PnVY和TYLCCNV的一步法RT-PCR扩增结果 0025 M： 2Kb Plus DNA Ladder； 1-4： 复合感染PnVY和TYLC。

18、CNV的三七样品； 5： 健康三七 样品； 0026 图2： 不同稀释倍数模板的一步法RT-PCR扩增结果 0027 M： 2Kb Plus DNA Ladder； 1： 100稀释； 2： 10-1稀释； 3： 10-2稀释； 4： 10-3稀 释； 5： 10-4稀释。 说明书 2/5 页 4 CN 111057789 A 4 具体实施方式 0028 为了使本发明的目的、 技术方案和有益效果更加清楚， 下面将对本发明的优选实 施例进行详细的说明， 以方便技术人员理解。 0029 实施例一： 0030 1、 实验材料 0031 以经单一RT-PCR证实单独感染了PnVY以及复合感染了PnVY。

19、、 TYLCCNV的田间感病 三七样品为材料， 以健康三七样品为阴性对照。 0032 2、 (1)引物设计合成 0033 分别设计合成检测PnVY和TYLCCNV的引物， 引物序列如下： 0034 PnVY： 正向引物(PnVYdF4) 5 -3 ： CGTACATCAAGTTCGGCTC 0035 反向引物(PnVYcRa2) 5 -3 ： TAATTGTCAGCACATCGTA 0036 TYLCCNV： 正向引物(TYLCCNVF1) 5 -3 ： CCTGTATATGCGACTTTGAAAGT 0037 反向引物(TYLCCNVR1) 5 -3 ： CCCAATTCCAGCTATAAA。

20、GAGTA 0038 每对引物扩增片段大小及待测病毒为： 0039 0040 (2)CTAB法提取染病植物组织的总RNA和DNA， 作为RT-PCR扩增模板； 0041 (3)一步法RT-PCR扩增； 0042 (4)琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。 0043 3、 CTAB法提取感病植物组织的总核酸： 将35片病叶叠加在一起， 称取500mg左右 至研钵中， 加入液氮充分研磨。 称取100mg研磨成粉状的样品至1.5mL离心管中， 加入1.2 mL CTAB缓冲液(2CTAB， 2PVP-40， 100mM Tris-HCl， pH 8.0， 1.4M NaCl， 20mM EDTA， 0.2 。

21、巯基乙醇)； 65温浴4560min； 13000r/min离心10min， 取650 L上清至一新的1.5 mL离心 管， 加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)， 涡旋震荡混匀30s； 13000r/min离心10min， 小心转移 500 L上清液至一新的1.5mL离心管中， 加入350 L异丙醇， 轻轻颠倒离心管充分混匀液体， 室温放置10min， 13000r/min离心15min， 小心地用微量移液器吸出上清； 沉淀加入500 L 75乙醇， 13000r/min离心10min， 小心地用微量移液器吸出上清， 室温下自然干燥沉淀10 15min； 加入100 LddH2O并置于冰上30。

22、min， 用微量移液器反复吹打液体使沉淀充分溶 解， -20保存备用。 0044 4、 一步法RT-PCR运用到的试剂是TaKaRa的PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2， 经过优化的反应体系为10 L， 包括0.4 L PrimeScript 1Step Enzyme Mix、 5 L 2 1Step Buffer、 10M正反向引物PnVYdF4/PnVYcRa2各0 .35L、 10M正反向引物 TYLCCNVF1/TYLCCNVR1各0.25 L、 ddH2O 2.4 L和模板1 L。 0045 5、 一步法RT-PCR的反应条件为： 50反转。

23、录30min， 94 2min， 94 30s、 55 30 s、 72 1min， 扩增35个循环， 72延伸10min后4保存。 0046 6、 电泳检测 0047 配制1.0的琼脂糖凝胶(含5ul/100ml Gold View)， 在0.5TBE缓冲液环境中， 说明书 3/5 页 5 CN 111057789 A 5 80V稳压电泳50min， 然后于凝胶成像仪观察拍照。 0048 7、 检测结果分析 0049 单独感染了PnVY的三七叶片中检测到1032bp的单一核酸条带； 复合感染了PnVY、 TYLCCNV的三七病叶中检测到了1032bp和650bp两条条带， 而健康三七样品中未。

24、检测到任何 条带。 0050 8、 扩增产物真实性验证 0051 随机挑选上述扩增产物中的1032bp、 650bp条带， 在紫外灯下从凝胶中分别切下相 应条带， 采用TIANGEN universal DNA Purification Kit DNA纯化回收试剂盒纯化后， 将 回收产物连接至宝生物工程(大连)有限公司的19-T Vector载体， 按常规分子克隆 方法转化至 E.coli DH5， 每个片段选3个阳性克隆送测序公司进行测序。 经序列比对， 1032bp的片段与 GenBank中登录的PnVY的核苷酸一致性达98， 650bp的片段与GenBank中 登录的 TYLCCNV的核。

25、苷酸一致性达96， 表明本发明从田间感病三七中获得的1032bp和 650bp 条带就是PnVY和TYLCCNV的相应cDNA扩增产物， 本发明的扩增产物真实可信， 能够对 同时感染PnVY和TYLCCNV的三七样品开展快速检测。 0052 实施例二： 0053 1、 实验材料 0054 以经单一RT-PCR证实单独感染了TYLCCNV以及复合感染了PnVY、 TYLCCNV的田间感 病三七样品为材料， 以健康三七样品为阴性对照。 0055 2、 (1)引物设计合成 0056 分别设计合成检测PnVY和TYLCCNV的引物， 引物序列如下： 0057 PnVY： 正向引物(PnVYdF4) 5。

26、 -3 ： CGTACATCAAGTTCGGCTC 0058 反向引物(PnVYcRa2) 5 -3 ： TAATTGTCAGCACATCGTA 0059 TYLCCNV： 正向引物(TYLCCNVF1) 5 -3 ： CCTGTATATGCGACTTTGAAAGT 0060 反向引物(TYLCCNVR1) 5 -3 ： CCCAATTCCAGCTATAAAGAGTA 0061 每对引物扩增片段大小及待测病毒为： 0062 0063 (2)CTAB法提取染病植物组织的总RNA和DNA， 作为RT-PCR扩增模板； 0064 (3)一步法RT-PCR扩增； 0065 (4)琼脂糖凝胶电泳检测扩增。

27、结果。 0066 3、 CTAB法提取感病植物组织的总核酸： 将35片病叶叠加在一起， 称取500mg左右 至研钵中， 加入液氮充分研磨。 称取100mg研磨成粉状的样品至1.5mL离心管中， 加入1.2 mL CTAB缓冲液(2CTAB， 2PVP-40， 100mM Tris-HCl， pH 8.0， 1.4M NaCl， 20mM EDTA， 0.2 巯基乙醇)； 65温浴4560min； 13000r/min离心10min， 取650 L上清至一新的1.5 mL离心 管， 加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)， 涡旋震荡混匀30s； 13000r/min离心10min， 小心转移 500。

28、 L上清液至一新的1.5mL离心管中， 加入350 L异丙醇， 轻轻颠倒离心管充分混匀液体， 室温放置10min， 13000r/min离心15min， 小心地用微量移液器吸出上清； 沉淀加入500 L 说明书 4/5 页 6 CN 111057789 A 6 75乙醇， 13000r/min离心10min， 小心地用微量移液器吸出上清， 室温下自然干燥沉淀10 15min； 加入100 LddH2O并置于冰上30min， 用微量移液器反复吹打液体使沉淀充分溶 解， -20保存备用。 0067 4、 一步法RT-PCR运用到的试剂是TaKaRa的PrimeScriptTM One Step R。

29、T-PCR Kit Ver.2， 经过优化的反应体系为10 L， 包括0.4 L PrimeScript 1Step Enzyme Mix、 5 L 2 1Step Buffer、 10 M正反向引物PnVYdF4/PnVYcRa2各0.35 L、 10 M正反向引物TYLCCNVF1/ TYLCCNVR1各0.25 L、 ddH2O 2.4 L和模板1 L。 0068 5、 一步法RT-PCR的反应条件为： 50反转录30min， 94 2min， 94 30s、 55 30 s、 72 1min， 扩增35个循环， 72延伸10min后4保存。 0069 6、 电泳检测 0070 配制1.。

30、0的琼脂糖凝胶(含5ul/100ml Gold View)， 在0.5TBE缓冲液环境中， 80V稳压电泳50min， 然后于凝胶成像仪观察拍照。 0071 7、 检测结果分析 0072 单独感染了PnVY的三七叶片中检测到1032bp的单一核酸条带； 复合感染了PnVY、 TYLCCNV的三七病叶中检测到了1032bp和650bp两条条带， 而健康三七样品中未检测到任何 条带。 0073 8、 扩增产物真实性验证 0074 随机挑选上述扩增产物中的1032bp、 650bp条带， 在紫外灯下从凝胶中分别切下相 应条带， 采用TIANGEN universal DNA Purification。

31、 Kit DNA纯化回收试剂盒纯化后， 将 回收产物连接至宝生物工程(大连)有限公司的18-T Vector载体， 按常规分子克隆 方法转化至 E.coli DH5， 每个片段选3个阳性克隆送测序公司进行测序。 经序列比对， 1032bp的片段与 GenBank中登录的PnVY的核苷酸一致性达98， 650bp的片段与GenBank中 登录的 TYLCCNV的核苷酸一致性达96， 表明本发明从田间感病三七中获得的1032bp和 650bp 条带就是PnVY和TYLCCNV的相应cDNA扩增产物， 本发明的扩增产物真实可信， 能够对 同时感染PnVY和TYLCCNV的三七样品开展快速检测。 0075 最后说明的是， 以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述， 但本领域技术人员应当理解， 可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 说明书 5/5 页 7 CN 111057789 A 7 图 1 图 2 说明书附图 1/1 页 8 CN 111057789 A 8 。