载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料及其制备方法及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911271136.5 (22)申请日 2019.12.12 (66)本国优先权数据 201911186486.1 2019.11.28 CN (71)申请人 中国科学院大学温州研究院 （温州 生物材料与工程研究所） 地址 325000 浙江省温州市高新区文昌路 156号科技城企业发展总部大楼 (72)发明人 石长灿席光辉刘雯杨啸 李徐坚季志孝 (74)专利代理机构 温州金瓯专利事务所(普通 合伙) 33237 代理人 林益建 (51)Int.Cl. A61L 24/00(。

2、2006.01) A61L 24/08(2006.01) (54)发明名称 一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料 及其制备方法及应用 (57)摘要 一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料 及其制备方法及应用， 制备的载凝血酶微球-膨 胀海绵复合止血材料将具有止血活性的凝血酶 负载在微球内部， 载有凝血酶的微球负载在具有 良好溶胀率和膨胀性质的海绵上， 协同发挥三者 优势， 具有良好溶胀率的膨胀海绵可以迅速吸收 血液中的水分从而浓缩凝血因子加快止血， 膨胀 海绵能够对受损组织产生物理压迫并促进止血， 通过微球负载凝血酶不仅可以避免凝血酶外泄 进入血管造成血管栓塞而且可以保留凝血酶活 性， 负载。

3、止血活性成分凝血酶可以激活凝血途径 加速止血， 并且， 本发明的微球-海绵复合止血材 料具有良好的生物相容性， 并且原材料来源丰 富， 成本可控， 具有良好的临床应用前景。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 111053944 A 2020.04.24 CN 111053944 A 1.一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料,其特征在于， 所述的复合止血材料包括 有具有多孔结构的膨胀海绵， 所述的膨胀海绵的多孔结构中包含有载凝血酶的微球,所述 的微球尺寸为50 m-200 m。 2.根据权利要求1所述的一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料， 其特征在于， 所 述的载凝血酶的微球由天。

4、然多聚糖溶液与凝血酶溶液制得。 3.根据权利要求2所述的一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料， 其特征在于， 所 述的天然多聚糖为透明质酸、 海藻酸钠、 羧甲基壳聚糖、 羟乙基纤维素、 壳聚糖、 葡聚糖、 淀 粉中的一种或几种。 4.一种权利要求1所述的载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料的制备方法， 其特征在 于， 包括以下步骤： （1） 包载凝血酶的微球的制备： 将天然多聚糖溶液与凝血酶溶液混合后进行静电喷雾 并收集到收集液中， 随后经超纯水洗涤后进行冷冻干燥得到天然多聚糖载凝血酶微球， 其 中静电喷雾的电压为5KV15KV， 流率1 mL/h10 mL/h, 针头到接收器的距离8cm20。

5、 cm； （2） 以PBS缓冲液为溶剂， 配置改性天然多聚糖溶液， 所述改性多糖为羧甲基壳聚糖接 枝甲基丙烯酸、 海藻酸钠接枝马来酰亚胺、 透明质酸接枝异氰酸酯、 淀粉接枝降冰片烯中的 一种； （3） 将质量浓度为5%50%的交联剂， 0.05%20%的包载凝血酶的微球加入到制备的改性 天然多聚糖溶液中； （4） 将质量浓度为0.01%5%的光引发剂加入上述混合溶液中， 剧烈搅拌发泡， 随后在光 照强度为50-600 w/cm2紫外光辐照30 s600 s， 用超纯水洗涤25次后， 经冷冻干燥， 得到 所述的一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料。 5.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在。

6、于， 所述的步骤 （1） 中的天然多聚糖为透 明质酸、 海藻酸钠、 羧甲基壳聚糖、 羟乙基纤维素、 壳聚糖、 葡聚糖、 淀粉中的一种或几种。 6.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 所述的步骤 （1） 中收集液为京尼平溶 液、 氯化钙溶液或戊二醛溶液中的一种， 其质量浓度为0.5%5%。 7.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 所述的步骤 （2） 中配置的改性天然多 聚糖溶液的质量浓度为1%50%。 8.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 所述的步骤 （3） 中交联剂为巯基-聚乙 二醇-巯基， 胱氨酸中的一种。 9.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 所。

7、述的步骤 （4） 中光引发剂为光引发 剂369、 光引发剂2959、 光引发剂1173、 光引发剂184中的一种或几种。 10.一种权利要求1-9所述的载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料在作为战伤、 创伤 急救止血材料， 围手术期止血材料， 或创面愈合止血材料上的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111053944 A 2 一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料及其制备方法及 应用 技术领域 0001 本发明具体涉及医用器械技术领域， 具体涉及一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合 止血材料及其制备方法及应用。 背景技术 0002 不可控的出血是战场创伤、 交通事故、 外科手术的主要死因之一，。

8、 传统的止血材料 比如纱布、 绷带、 棉球只能依靠单纯的物理压迫止血， 其止血能力十分有限， 仅限于浅表小 伤口的毛细血管出血； 新型的止血材料比如水凝胶、 微球、 海绵其对血液中的水分吸附能力 大幅提高， 可以通过浓缩凝血因子或封堵创面达到止血目的， 较传统止血材料的止血效果 有一定提升， 但对于出血量较大的情形， 仍存在止血材料有被血液冲走的风险， 血液来不及 凝固， 使用效果并不理想； 临床上， 对于出血量较大的情况， 主要是使用诸如纤维蛋白原、 凝 血酶等止血活性成分， 其可以激活凝血途径， 促进纤维蛋白的形成， 从而达到加速止血的目 的。 但此类止血活性成分不仅不易保存， 而且如果使。

9、用不当进入血管会造成血管栓塞， 带来 新的风险。 因此， 开发出一款既能够安全激活凝血途径又能够吸附血液中的水分浓缩凝血 因子的新型复合材料具有良好的临床应用前景。 0003 专利201210033793.8公开了一种壳聚糖基止血海绵及其制备方法， 该专利直接将 凝血酶与壳聚糖基溶液混合后再分别加入冻干保护剂、 交联剂， 最后经冷冻干燥制备该壳 聚糖基止血海绵。 该方法将凝血酶与交联剂直接接触， 存在凝血酶失活从而导致止血效果 下降的风险； 专利200480007509.3将凝血酶固定在生物可吸收的合成非纺织物上， 该生物 可吸收的合成非纺织物选自的聚羟基乙酸、 聚乳酸和羟基乙酸与乳酸的共聚物。

10、均属于疏水 材质， 存在与创伤表面贴合困难， 难以发挥凝血酶功效的不足。 发明内容 0004 为了解决现有技术存在的问题， 本发明将能够激活凝血途径的活性止血成分凝血 酶包载在天然多聚糖微球中， 继而再将该包载有凝血酶的微球负载在可膨胀海绵内， 该方 法制备的载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料充分发挥膨胀海绵和凝血酶的止血优势， 在保持凝血酶活性的情况下避免凝血酶的渗出造成血管堵塞的严重风险， 具有良好的临床 应用前景。 0005 本发明采用的技术解决方案是： 一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料,所述 的复合止血材料包括有具有多孔结构的膨胀海绵， 所述的膨胀海绵的多孔结构中包含有载 凝血酶。

11、的微球， 所述的微球尺寸为50 m-200 m。 0006 所述的载凝血酶的微球由天然多聚糖溶液与凝血酶溶液制得。 0007 所述的天然多聚糖为透明质酸、 海藻酸钠、 羧甲基壳聚糖、 羟乙基纤维素、 壳聚糖、 葡聚糖、 淀粉中的一种或几种。 0008 一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料的制备方法， 包括以下步骤： 说明书 1/5 页 3 CN 111053944 A 3 （1） 包载凝血酶的微球的制备： 将天然多聚糖溶液与凝血酶溶液混合后进行静电喷雾 并收集到收集液中， 随后经超纯水洗涤后进行冷冻干燥得到天然多聚糖载凝血酶微球， 其 中静电喷雾的电压为5KV15KV， 流率1 mL/h10。

12、 mL/h, 针头到接收器的距离8cm20 cm； （2） 以PBS缓冲液为溶剂， 配置改性天然多聚糖溶液， 所述改性多糖为羧甲基壳聚糖接 枝甲基丙烯酸、 海藻酸钠接枝马来酰亚胺、 透明质酸接枝异氰酸酯、 淀粉接枝降冰片烯中的 一种； （3） 将质量浓度为5%50%的交联剂， 0.05%20%的包载凝血酶的微球加入到制备的改性 天然多聚糖溶液中； （4） 将质量浓度为0.01%5%的光引发剂加入上述混合溶液中， 剧烈搅拌发泡， 随后在光 照强度为50-600 w/cm2紫外光辐照30 s600 s， 用超纯水洗涤25次后， 经冷冻干燥， 得到 所述的一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料。 0。

13、009 所述的步骤 （1） 中的天然多聚糖为透明质酸、 海藻酸钠、 羧甲基壳聚糖、 羟乙基纤 维素、 壳聚糖、 葡聚糖、 淀粉中的一种或几种。 0010 所述的步骤 （1） 中收集液为京尼平溶液、 氯化钙溶液或戊二醛溶液中的一种， 其质 量浓度为0.5%5%。 0011 所述的步骤 （2） 中配置的改性天然多聚糖溶液的质量浓度为1%50%。 0012 所述的步骤 （3） 中交联剂为巯基-聚乙二醇-巯基 （重均分子量为200010000） ， 胱 氨酸中的一种。 0013 所述的步骤 （4） 中光引发剂为光引发剂369、 光引发剂2959、 光引发剂1173、 光引发 剂184中的一种或几种。 。

14、0014 一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料在作为战伤、 创伤急救止血材料， 围 手术期止血材料， 或创面愈合止血材料上的应用。 0015 本发明的有益效果是： 本发明提供了一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料 及其制备方法及应用， 制备的载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料将具有止血活性的凝 血酶负载在微球内部， 载有凝血酶的微球负载在具有良好溶胀率和膨胀性质的海绵上， 协 同发挥三者优势， 具有良好溶胀率的膨胀海绵可以迅速吸收血液中的水分从而浓缩凝血因 子加快止血， 膨胀海绵能够对受损组织产生物理压迫并促进止血， 通过微球负载凝血酶不 仅可以避免凝血酶外泄进入血管造成血管栓塞而且可以保。

15、留凝血酶活性， 负载止血活性成 分凝血酶可以激活凝血途径加速止血， 并且， 本发明的微球-海绵复合止血材料具有良好的 生物相容性， 并且原材料来源丰富， 成本可控， 具有良好的临床应用前景。 附图说明 0016 图1： 负载凝血酶的微球的扫描电子显微镜图。 0017 图2： 膨胀海绵的扫描电子显微镜图。 0018 图3： 载凝血酶微球-膨胀海绵的扫描电子显微镜图。 0019 图4： 不同材料的溶胀率比较。 0020 图5： 不同材料的全血凝血比较。 0021 图6： 肝脏贯穿伤模型中， 不同材料出血时间和出血量的比较。 0022 图7： 不同材料细胞相容性比较。 说明书 2/5 页 4 CN 。

16、111053944 A 4 具体实施方式 0023 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明， 本发明实施例是为了使本领域的技 术人员能够更好地理解本发明， 但并不对本发明进行任何限制。 0024 实施例1: 一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料的制备方法， 包括以下步骤: (1) 海藻酸钠载凝血酶微球的制备， 将质量浓度为2%的海藻酸钠溶液与凝血酶溶液混 合后(酶活力为20 iu/mL)进行静电喷雾并收集到质量浓度为0.5%的氯化钙溶液中， 随后经 超纯水洗涤后进行冷冻干燥得到海藻酸钠载凝血酶微球。 其中静电喷雾的工作参数为： 电 压5KV， 流率1 mL/h,针头到接收器的距离8cm。 0。

17、025 (2) 以PBS缓冲液为溶剂， 配置质量浓度为1%的羧甲基壳聚糖接枝甲基丙烯酸溶 液。 0026 (3) 将质量浓度为50%的胱氨酸和0.05%的海藻酸钠载凝血酶微球加入到上述羧 甲基壳聚糖接枝甲基丙烯酸溶液中。 0027 (4) 将质量浓度为0.01%的光引发剂369加入上述混合溶液中， 剧烈搅拌发泡， 随 后在光照强度为50 w/cm2紫外光辐照600 s， 用超纯水洗涤2次后， 经冷冻干燥， 得到一种载 凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料。 0028 实施例2： 一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料的制备方法， 包括以下步骤: (1) 透明质酸钠载凝血酶微球的制备， 将质量浓度为。

18、5%的透明质酸钠溶液与凝血酶溶 液混合后(酶活力为50 iu/mL)进行静电喷雾并收集到质量浓度为5%的戊二醛溶液中， 随后 经超纯水洗涤后进行冷冻干燥得到透明质酸钠载凝血酶微球。 其中静电喷雾的工作参数 为： 电压10KV， 流率2 mL/h,针头到接收器的距离12cm。 0029 (2) 以PBS缓冲液为溶剂， 配置质量浓度为50%的海藻酸钠接枝马来酰亚胺溶液。 0030 (3) 将质量浓度为10%的胱氨酸和5%的透明质酸钠载凝血酶微球加入到上述海藻 酸钠接枝马来酰亚胺溶液中。 0031 (4) 将质量浓度为1%的光引发剂1173加入上述混合溶液中， 剧烈搅拌发泡， 随后 在光照强度为10。

19、0 w/cm2紫外光辐照300 s， 用超纯水洗涤3次后， 经冷冻干燥， 得到一种载 凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料。 0032 实施例3： 一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料的制备方法， 包括以下步骤: (1) 葡聚糖载凝血酶微球的制备， 将质量浓度为3%的葡聚糖溶液与凝血酶溶液混合后 (酶活力为100 iu/mL)进行静电喷雾并收集到质量浓度为1%的京尼平溶液中， 随后经超纯 水洗涤后进行冷冻干燥得到葡聚糖载凝血酶微球。 其中静电喷雾的工作参数为： 电压12KV， 流率8 mL/h,针头到接收器的距离15cm。 0033 (2) 以PBS缓冲液为溶剂， 配置质量浓度为10%的透明质酸。

20、接枝异氰酸酯溶液。 0034 (3) 将质量浓度为5%的巯基-聚乙二醇-巯基 （重均分子量2000-10000） 和5%的葡 聚糖载凝血酶微球加入到上述透明质酸接枝异氰酸酯溶液中。 0035 (4) 将质量浓度为5%的光引发剂2959加入上述混合溶液中， 剧烈搅拌发泡， 随后 在光照强度为600 w/cm2紫外光辐照30 s， 用超纯水洗涤5次后， 经冷冻干燥， 得到一种载凝 说明书 3/5 页 5 CN 111053944 A 5 血酶微球-膨胀海绵复合止血材料。 0036 实施例4： 一种载凝血酶微球-膨胀海绵复合止血材料的制备方法， 包括以下步骤: (1) 羟乙基纤维素/壳聚糖载凝血酶微。

21、球的制备， 将质量浓度为2%的羟乙基纤维素/壳 聚糖 (羟乙基纤维素和壳聚糖的质量比为1比1) 溶液与凝血酶溶液混合后(酶活力为200 iu/mL)进行静电喷雾并收集到质量浓度为1%的戊二醛溶液中， 随后经超纯水洗涤后进行冷 冻干燥得到羟乙基纤维素/壳聚糖载凝血酶微球。 其中静电喷雾的工作参数为： 电压10KV， 流率5 mL/h,针头到接收器的距离10 cm。 0037 (2) 以PBS缓冲液为溶剂， 配置质量浓度为30%的淀粉接枝降冰片烯溶液。 0038 (3) 将质量浓度为25%的巯基-聚乙二醇-巯基 （重均分子量2000-10000） 和20%的 羟乙基纤维素/壳聚糖载凝血酶微球加入到。

22、上述淀粉接枝降冰片烯溶液中。 0039 (4) 将质量浓度为3%的光引发剂184加入上述混合溶液中， 剧烈搅拌发泡， 随后在 光照强度为400 w/cm2紫外光辐照20 s， 用超纯水洗涤4次后， 经冷冻干燥， 得到一种载凝血 酶微球-膨胀海绵复合止血材料。 0040 对比例1： 一种膨胀海绵止血材料的制备方法， 包括以下步骤: (1) 以PBS缓冲液为溶剂， 配置质量浓度为10%的透明质酸接枝异氰酸酯溶液。 0041 (2) 将质量浓度为5%的巯基-聚乙二醇-巯基 （重均分子量2000-10000） 加入到上 述透明质酸接枝异氰酸酯溶液中。 0042 (3) 将质量浓度为5%的光引发剂295。

23、9加入上述混合溶液中， 剧烈搅拌发泡， 随后 在光照强度为600 w/cm2紫外光辐照30 s， 用超纯水洗涤5次后， 经冷冻干燥， 得到一种膨胀 海绵止血材料。 0043 对比例2： 一种微球-膨胀海绵复合止血材料的制备方法， 包括以下步骤: (1) 葡聚糖微球的制备， 将质量浓度为3%的葡聚糖溶液进行静电喷雾并收集到质量浓 度为1%的京尼平溶液中， 随后经超纯水洗涤后进行冷冻干燥得到葡聚糖微球。 其中静电喷 雾的工作参数为： 电压12KV， 流率8 mL/h,针头到接收器的距离15cm。 0044 (2) 以PBS缓冲液为溶剂， 配置质量浓度为10%的透明质酸接枝异氰酸酯溶液。 0045 。

24、(3) 将质量浓度为5%的巯基-聚乙二醇-巯基 （重均分子量2000-10000） 和5%的葡 聚糖微球加入到上述透明质酸接枝异氰酸酯溶液中。 0046 (4) 将质量浓度为5%的光引发剂2959加入上述混合溶液中， 剧烈搅拌发泡， 随后 在光照强度为600 w/cm2紫外光辐照30 s， 用超纯水洗涤5次后， 经冷冻干燥， 得到一种微 球-膨胀海绵复合止血材料。 0047 结论 本发明将能够激活凝血途径的活性止血成分凝血酶包载在天然多聚糖微球中， 继而再 将该包载有凝血酶的微球负载在可膨胀海绵内， 该方法制备的载凝血酶微球-膨胀海绵复 合止血材料充分发挥膨胀海绵和凝血酶的止血优势， 在保持凝。

25、血酶活性的情况下避免凝血 酶的渗出造成血管堵塞的严重风险， 相较于对比例， 具有更低的出血量和出血时间， 更高的 生物相容性， 其吸水倍率为其自身重量的1550倍。 说明书 4/5 页 6 CN 111053944 A 6 0048 各位技术人员须知： 虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述， 但是本发明 的发明思想并不仅限于此发明， 任何运用本发明思想的改装， 都将纳入本专利专利权保护 范围内。 0049 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 本发明的保护范围并不仅局限于上述实施 例， 凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。 应当指出， 对于本技术领域 的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰， 这些改进和润饰也 应视为本发明的保护范围。 说明书 5/5 页 7 CN 111053944 A 7 图1 图2 说明书附图 1/4 页 8 CN 111053944 A 8 图3 图4 说明书附图 2/4 页 9 CN 111053944 A 9 图5 图6 说明书附图 3/4 页 10 CN 111053944 A 10 图7 说明书附图 4/4 页 11 CN 111053944 A 11 。