杆菌肽及其组分的分析方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911285218.5 (22)申请日 2019.12.13 (71)申请人 上海市食品药品检验所 地址 200120 上海市浦东新区张衡路1500 号 (72)发明人 张含智刘浩赵敬丹秦峰 闻宏亮裘亚 (74)专利代理机构 上海申新律师事务所 31272 代理人 郎祺 (51)Int.Cl. C07K 7/66(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 33/68(2006.01) A61K 38/12(2。

2、006.01) A61P 31/04(2006.01) (54)发明名称 一种杆菌肽及其组分的分析方法 (57)摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 新 的 杆 菌 肽 (Bacitracin)组分及其高效液相色谱-质谱 (HPLC-MS)分析方法。 该组分经HPLC-MS及二级质 谱分析验证为双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A 或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y， 这种新型的 组分被命名为杆菌肽HZ(bacitracinHZ)。 本发 明揭示存在新的非蛋白质氨基酸， 如2-氨基-3- 乙烯基-5-己烯酸、 2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸、 3-乙烯基半胱氨酸、 2-乙烯基半胱氨酸。 杆菌肽 HZ具。

3、有不同于常见杆菌肽组分的抗菌活性或毒 性， 有潜在的应用价值， 并且该类化合物的结构 确证也为严格控制杆菌肽的质量提供了研究基 础。 权利要求书3页 说明书9页 附图5页 CN 111057131 A 2020.04.24 CN 111057131 A 1.一种杆菌肽， 其特征在于， 所述杆菌肽为双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A(式 或式 )或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y(式)： 2.根据权利要求1所述的杆菌肽， 其特征在于， 所述的杆菌肽1位、 5位或8位的异亮氨酸 可转化为亮氨酸， 转化后形成的组分发生双亚甲基化或不发生双亚甲基化； 其中， 双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A的1位异亮氨酸被亮氨。

4、酸取代的化学结构式A- I和双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的1位异亮氨酸被亮氨酸取代的化学结构式Y-I分别如 下所示： 权利要求书 1/3 页 2 CN 111057131 A 2 3.根据权利要求2所述的杆菌肽， 其特征在于， 所述的杆菌肽存在新的非蛋白质氨基 酸： 2-氨基-3-乙烯基-5-己烯酸A、 2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸B、 3-乙烯基半胱氨酸C、 2-乙 烯基半胱氨酸D， 结构式如下： 4.根据权利要求1的一种新的杆菌肽， 其特征在于， 所述的杆菌肽包括所述杆菌肽的氧 化产物、 差向异构化产物、 水解产物、 硫酸化产物或磺酸化产物。 5.一种包含如权利要求1-4任一项所述杆菌。

5、肽的原料药或药物组合物。 6.一种包含如权利要求5所述原料药或药物组合物的药物制剂， 其特征在于， 所述制剂 包括注射剂、 软膏剂或眼膏。 7.一种获得如权利要求1所述的杆菌肽的组分及其结构的分析方法， 其特征在于， 所述 方法为高效液相色谱-质谱。 8.根据权利要求7所述的分析方法， 其特征在于， 所述MS的质量分析器可以选择四级杆 飞行时间质谱、 线性或三维离子肼质谱、 三重四级杆质谱、 轨道离子肼质谱等。 权利要求书 2/3 页 3 CN 111057131 A 3 9.根据权利要求7所述的分析方法， 其特征在于， 所述的MS离子化方式可以选择电喷雾 离子化、 大气压离子化等。 10.根。

6、据权利要求7所述的分析方法， 其特征在于， 所述的MS及MS/MS扫描范围为50- 2000amu。 权利要求书 3/3 页 4 CN 111057131 A 4 一种杆菌肽及其组分的分析方法 技术背景 0001 本发明涉及药物分析化学领域， 具体而言， 涉及一种杆菌肽及其组分的分析方法。 背景技术 0002 0003 杆菌肽(结构式结合图1和表1)是由枯草杆菌和地衣芽孢杆菌产生的多组分抗菌 肽， 能强烈抑制革兰氏阳性菌， 主要用于治疗耐青霉素的葡萄球菌感染。 杆菌肽具有特殊的 抑菌机理， 会干扰细菌细胞壁的合成， 同时在肽聚糖的合成中抑制磷脂受体的再生， 使得其 具有抗菌谱广、 不易产生耐药。

7、性等特性。 在药用过程中添加锌离子以增强活性。 0004 表1杆菌肽结构通式A和B的Rn的表达式 0005 0006 由于是发酵产品， 杆菌肽组分较多， 在 美国药典 40版中收录了杆菌肽A、 B、 C、 F等 组分，欧洲药典 9.6版中收录了19种组分或有关物质， 另外还有其他未知组分。 而 美国药 典 40版、欧洲药典 9.6版采用的高效液相色谱法(磷酸氢二钾/乙腈/甲醇体系)选择非挥 发性流动相体系， 不适合直接进行质谱分析， 无法实现在线确定未知组分的结构。 发明内容 0007 针对上述现有技术存在的问题， 本发明中公布了一种杆菌肽及其组分的分析方 法， 该方法为高效液相色谱-质谱(H。

8、PLC-MS)分析方法。 经一级质谱及二级质谱分析验证这 种杆菌肽为双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y， 命名为杆 菌肽HZ(bacitracin HZ)。 0008 为了实现上述目的， 本发明提供的技术方案包括： 0009 本发明的第一方面是提供一种新的杆菌肽， 命名为杆菌肽HZ(bacitracin HZ)。 该 种杆菌肽的组分为双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y。 0010 进一步地， 亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A的组成单元包括1位异亮氨酸、 2位半胱 氨酸、 3位亮氨酸、 4位谷氨酸、 5位异亮氨酸、 6位赖氨酸、 7位鸟氨酸、 8位。

9、异亮氨酸、 9位苯丙 氨酸、 10位组氨酸、 11位天冬氨酸、 12位天冬酰胺， 1位异亮氨酸与2位半胱氨酸形成噻唑啉 环， 6至12位氨基酸形成环7肽； 双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A是指原杆菌肽A的1位异亮 氨酸处的 -甲基及 -甲基发生亚甲基化， 2位半胱氨酸处的 ” 位发生乙烯基化， 其结构 如下： 说明书 1/9 页 5 CN 111057131 A 5 0011 0012 或原杆菌肽A的1位异亮氨酸处的 -甲基及 -甲基发生亚甲基化， 2位半胱氨酸 处的 ” 位发生乙烯基化， 其结构如下： 0013 0014 进一步地， 所述双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的组成单元包括1位异亮氨酸、。

10、 2位 半胱氨酸、 3位亮氨酸、 4位谷氨酸、 5位异亮氨酸、 6位赖氨酸、 7位鸟氨酸、 8位异亮氨酸、 9位 苯丙氨酸、 10位组氨酸、 11位天冬氨酸、 12位天冬酰胺， 1位异亮氨酸与2位半胱氨酸形成噻 唑环， 6至12位氨基酸形成环7肽； 双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y是指原杆菌肽Y的1位异亮 氨酸处的 -甲基及 -甲基发生亚甲基化， 2位半胱氨酸处的 ” 位发生乙基化， 其结构如 下： 0015 0016 进一步地， 双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A， 及 ” 、 ” -碳的构型是R构型或S构 型。 0017 进一步地， 双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A的组成氨基酸是L型或D型。 001。

11、8 进一步地， 双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的 -碳的构型是R构型或S构型。 0019 进一步地， 双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的组成氨基酸是L型或D型。 0020 进一步地， 杆菌肽HZ的1位、 5位或8位的异亮氨酸可转化为亮氨酸， 转化后形成的 说明书 2/9 页 6 CN 111057131 A 6 组分发生双亚甲基化或不发生双亚甲基化。 0021 进一步地， 双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A的1位异亮氨酸被亮氨酸取代的化学 结构式A-I和双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的1位异亮氨酸被亮氨酸取代的化学结构式Y- I分别如下所示： 0022 0023 0024 本发明的第二方面提供存在于杆菌肽。

12、HZ新的非天然蛋白质氨基酸： 2-氨基-3-乙 烯基-5-己烯酸A、 2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸B、 3-乙烯基半胱氨酸C、 2-乙烯基半胱氨酸D， 结构式如下： 0025 0026 进一步地， 杆菌肽包括杆菌肽HZ的氧化产物、 差向异构化产物、 水解产物、 硫酸化 产物、 磺酸化产物等， 或者其他杆菌肽产物。 0027 本发明的第三方面是提供包括杆菌肽HZ的杆菌肽原料药或杆菌肽锌原料药或药 物组合。 0028 本发明的第四方面是提供包括上述原料药或药物组合物的药物制剂为注射剂、 软 说明书 3/9 页 7 CN 111057131 A 7 膏剂或眼膏。 0029 本发明的第五方面是提供。

13、获得杆菌肽的组分及其结构的方法为高效液相色谱-质 谱(HPLC-MS)分析方法。 0030 进一步地， MS离子化方式可以选择电喷雾离子化、 大气压离子化等， 优选为电喷雾 离子化。 0031 进一步地， MS的质量分析器可以选择四级杆飞行时间质谱、 线性或三维离子肼质 谱、 三重四级杆质谱、 轨道离子肼质谱等， 优选为四级杆飞行时间质谱。 0032 进一步地， 杆菌肽HZ及其他杆菌肽组分可以通过一级质谱及二级质谱的信息进行 结构判断。 0033 进一步地， MS及MS/MS扫描范围为50-2000amu。 0034 进一步地， 二级质谱碰撞能量设置范围为10-30eV， 优选为20eV、 3。

14、0eV。 0035 进一步地， 测得的杆菌肽HZ的分子量为736.8908(M+2H2+)， 二级质谱的特征离子 为m/z 604.32、 491.23、 382.14、 362.19、 334.19、 253.10、 249.11和110.07。 0036 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 0037 (1)本发明首次发现杆菌肽HZ， 即双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A或双亚甲基化 及乙基化的杆菌肽Y， 可能具有不同于常见杆菌肽组分的抗菌活性或毒性， 有潜在的应用价 值， 并且该类化合物的结构确证也为严格控制杆菌肽的质量提供了研究基础； 0038 (2)本发明首次通过MS及MS/MS数。

15、据鉴定了双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A或双 亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的结构； 0039 (3)本发明揭示存在新的非天然蛋白质氨基酸， 如2-氨基-3-乙烯基-5-己烯酸、 2- 氨基-4-乙烯基-5-己烯酸、 3-乙烯基半胱氨酸、 2-乙烯基半胱氨酸； 0040 (4)本发明中的HPLC-MS/MS方法可用于直接分析杆菌肽中的其他组分的结构， 即 综合采用一级质谱获得分子量、 二级质谱碎片离子及氨基酸残基离子推测组分结构， 该解 析策略也可推广至其他多肽类抗生素的结构解析中。 附图说明 0041 图1为本发明背景技术中杆菌肽组分的结构通式； 0042 图2为本发明一实施例中杆菌肽供试品的质谱。

16、总离子流图； 0043 图3为本发明一实施例中杆菌肽HZ的一级质谱图； 0044 图4为本发明一实施例中杆菌肽HZ的二级质谱图； 0045 图5为本发明一实施例中杆菌肽A的裂解规律图； 0046 图6为本发明一实施例中杆菌肽HZ： 双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A的化学结构 式； 0047 图7为本发明一实施例中杆菌肽HZ： 双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的化学结构 式； 0048 图8为本发明一实施例中杆菌肽HZ： 双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A-I(1位异亮 氨酸被亮氨酸取代)的化学结构式； 0049 图9本发明一实施例中为杆菌肽HZ： 双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y-I(1位异亮氨 酸被亮氨酸。

17、取代)的化学结构式； 说明书 4/9 页 8 CN 111057131 A 8 0050 图10本发明一实施例中为新的非天然蛋白质氨基酸的化学结构式； 0051 其中， A： 2-氨基-3-乙烯基-5-己烯酸、 B： 2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸、 C： 3-乙烯基 半胱氨酸、 D： 2-乙烯基半胱氨酸。 具体实施方式 0052 下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍， 以使更好的理解本 发明， 但是下述实施例并不限制本发明范围。 0053 本发明中涉及的杆菌肽， 以杆菌肽 美国药典 对照品为具体实施案例， 但也可适 用于其他杆菌肽对照品及制剂中。 0054 实施例1 005。

18、5 本实施例提供一种新的杆菌肽， 命名为杆菌肽HZ(bacitracin HZ)。 该种杆菌肽的 组分为双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A或双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y。 其中， 亚甲基 化及乙烯基化的杆菌肽A的组成单元包括1位异亮氨酸、 2位半胱氨酸、 3位亮氨酸、 4位谷氨 酸、 5位异亮氨酸、 6位赖氨酸、 7位鸟氨酸、 8位异亮氨酸、 9位苯丙氨酸、 10位组氨酸、 11位天 冬氨酸、 12位天冬酰胺， 1位异亮氨酸与2位半胱氨酸形成噻唑啉环， 6至12位氨基酸形成环7 肽。 双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的组成单元包括1位异亮氨酸、 2位半胱氨酸、 3位亮氨 酸、 4位谷氨酸、 5位异亮氨。

19、酸、 6位赖氨酸、 7位鸟氨酸、 8位异亮氨酸、 9位苯丙氨酸、 10位组氨 酸、 11位天冬氨酸、 12位天冬酰胺， 1位异亮氨酸与2位半胱氨酸形成噻唑环， 6至12位氨基酸 形成环7肽。 0056 双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A是指原杆菌肽A的1位异亮氨酸处的 -甲基及 -甲基发生亚甲基化， 2位半胱氨酸处的 ” 位发生乙烯基化， 其结构如( )所示； 或1位异 亮氨酸处的 -甲基及 -甲基发生亚甲基化， 2位半胱氨酸处的 ” 位发生乙烯基化， 其结 构如()所示； 双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y是指原杆菌肽Y的1位异亮氨酸处的 -甲基 及 -甲基发生亚甲基化， 2位半胱氨酸处的 ” 位发生。

20、乙基化， 其结构如()所示。 说明书 5/9 页 9 CN 111057131 A 9 0057 0058 双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A中的 及 ” 、 ” -碳的构型是R构型或S构型， 组 成氨基酸是L型或D型。 双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的 -碳的构型是R构型或S构型， 组 成氨基酸是L型或D型。 0059 杆菌肽HZ的1位、 5位或8位的异亮氨酸可转化为亮氨酸， 转化后形成的组分发生双 亚甲基化或不发生双亚甲基化。 其中， 双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A的1位异亮氨酸被 亮氨酸取代的化学结构式A-I和双亚甲基化及乙基化的杆菌肽Y的1位异亮氨酸被亮氨酸取 代的化学结构式Y-I分别如下所。

21、示： 说明书 6/9 页 10 CN 111057131 A 10 0060 0061 实施例2 0062 本实施例提供杆菌肽HZ在药物中的应用。 一种包括杆菌肽HZ的杆菌肽原料药或药 物组合以及包括上述原料药或药物组合物的药物制剂。 0063 所述药物制剂的组成包括注射用杆菌肽、 杆菌肽软膏、 杆菌肽眼膏。 0064 其中， 注射剂的规格为每毫升1000单位(溶于等渗氯化钠注射液)； 0065 软膏剂的规格为1g： 500单位、 5g:4000单位； 0066 眼膏的规格为1g： 500单位、 2g:1000单位。 0067 验证实验 0068 本研究前期开发了一种甲酸铵-乙腈分离体系(中国。

22、药学杂志， 2018， 53(23): 2041-2046及中国发明专利： 201811467424.3)， 对杆菌肽各组分的分离效果较佳， 并可直接 用于质谱分析。 本验证实验将采用甲酸铵-乙腈分离体系的质谱分析方法来对杆菌肽HZ的 结构进行解析。 0069 一、 仪器与试药 0070 Agilent 1290型高效液相色谱仪-6550QTOF-MS(美国Agilent Technologies公 司)。 说明书 7/9 页 11 CN 111057131 A 11 0071 杆菌肽 美国药典 对照品(批号： R048CO)。 0072 二、 实验条件 0073 本发明中采用中国发明专利(张。

23、含智等， 一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色 谱方法， 中国发明专利， 201811467424.3)中的液相方法， 即以50mmol/L甲酸铵溶液(用甲酸 调节pH值至4.0)为流动相A， 乙腈为流动相B， 按下表2中的线性梯度条件洗脱， 流速为1ml/ min； 柱温为30； 进样量为4 l； 检测波长为254nm。 以ESI-Q/TOF-MS为检测器， 以正离子扫 描模式采集一级质谱图和二级质谱图， 采集范围m/z 50-1700， 二级质谱碰撞能量为10- 30eV。 0074 表2流动相A和流动相B的线性洗脱条件 0075 0076 三、 杆菌肽对照品样品溶液配制及分析 0077 精。

24、密称杆菌肽 美国药典 对照品20mg， 置10ml量瓶中， 加流动相A-流动相B(77: 23， V:V)溶解并定量稀释至刻度， 摇匀， 浓度为2mg/ml。 经HPLC-ESI-Q/TOF-MS分析， 其总离 子流图见图2所示， 杆菌肽A及杆菌肽HZ的洗脱位置见图中所示(杆菌肽HZ的一级质谱图见 图3所示， 杆菌肽HZ的二级质谱图见图4所示)。 0078 四、 杆菌肽A的结构解析 0079 以杆菌肽A为例介绍结构解析过程， 其准分子离子峰M+H+的m/z为1422.76。 在溶 液状态或是在电喷雾过程中， 杆菌肽A容易加和两个H+而主要以M+2H2+(m/z， 711.89)存 在。 以M+。

25、2H2+为母离子， 调整碎裂电压得到杆菌肽A的二级质谱图， 其裂解规律见图5所示。 杆菌肽A从线性链端(N端)开始裂解时， 首先脱去异亮氨酸脱羧正离子(a1离子， m/z， 86.10) 得到x11离子(m/z， 1337.67)， 再失去噻唑啉环酰基得到y10离子， 然后失去亮氨酰基、 谷氨 酰基、 异亮氨酰基得到y9、 y8、 y7离子， 最终为环七肽； 以上肽均易失去天冬酰胺上的氨基。 相应的b离子如b5、 b4、 b3及b2， 另外b离子也可以失去酰基(如b3离子失去酰基得到碎片离 子m/z 284.18)或a1离子得到低端分子量的碎片峰。 环肽的特征离子丰度较低， 有两条裂解 路径，。

26、 其一是经历失去苯丙氨酰基和异亮氨酰基(同时失去， 碎片离子m/z 627.29)、 天冬氨 酰氨基(碎片离子m/z 513.25)及天冬氨酰基(碎片离子m/z 398.22)的过程， 最后的碎片离 子(m/z， 243.18)只包括赖氨酸和鸟氨酸； 其二是失去鸟氨酰基和赖氨酰基、 天冬氨酰氨基、 天冬氨酰基得到特征碎片。 在低端分子量可以观测到组成杆菌肽A的氨基酸残基， 如亮氨酰 基或异亮氨酰基失去酰基后的碎片离子(m/z， 86.10)、 谷氨酰基残基(m/z， 102.06)、 鸟氨酰 说明书 8/9 页 12 CN 111057131 A 12 基残基(m/z， 115.09及87.0。

27、9)、 苯丙氨酰残基(m/z， 120.08)、 组氨酰基残基(m/z， 138.07及 110.07)、 天冬氨酸残基(m/z， 88.04)、 天冬酰胺残基(m/z， 87.06)及赖氨酰胺残基(m/z， 129.10)， 各氨基酸残基的详细数据及以上碎片离子信息可以还原出杆菌肽A的序列， 也能 为其他组分的结构推导提供借鉴。 0080 五、 杆菌肽HZ的结构解析 0081 杆菌肽HZ的m/z为736.89(M+2H2+)， 与杆菌肽A相比， 分子量增加50。 与杆菌肽A的 二级质谱碎片离子比对发现， 特征离子m/z 491.23、 362.19、 334.19、 249.11比杆菌肽A相。

28、应 的离子441.22、 312.17、 284.18、 199.09分子量增加50， 说明线性肽段发生变化。 特征离子a1 的m/z为110.07比杆菌肽A的a1增加24， 推测1位异亮氨酸的 -甲基及 -甲基发生亚甲基 化。 碎片离子253.09比杆菌肽A的相应离子227.09大26， 结合m/z 249.11及110.07， 可判断 发生修饰的位点在噻唑啉环上， 推测在原2位半胱氨酸处的 ” 或 ” 位发生乙烯基化， 即双亚 甲基化及乙烯基化的杆菌肽A， 见图6中的结构式。 0082 也有可能噻唑啉环转化为噻唑环， ” 位发生乙基化， 即双亚甲基化及乙基化的杆 菌肽Y， 见图7中的结构式。

29、。 0083 1位异亮氨酸也有可能转化为亮氨酸， 即 处的两个甲基发生亚甲基化， 则杆菌 肽HZ结构式也有可能如图8(即双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A-I)、 图9(即双亚甲基化及 乙基化的杆菌肽Y-I)中所示。 0084 四种新的非天然蛋白质氨基酸， 如2-氨基-3-乙烯基-5-己烯酸(A)、 2-氨基-4-乙 烯基-5-己烯酸(B)、 3-乙烯基半胱氨酸(C)、 2-乙烯基半胱氨酸(D)， 其结构式如图10所示， 未标识 -碳的手性， R或S构型均有可能。 其中， A或者B对应的是杆菌肽的1位氨基酸， C或D对 应的是杆菌肽的2位氨基酸。 0085 综上所述， 本发明中发现了新的杆菌肽组分。

30、， 并可通过HPLC-MS及MS/MS方法解析 其结构， 将其命名为杆菌肽HZ， 即双亚甲基化及乙烯基化的杆菌肽A及双亚甲基化及乙基化 的杆菌肽Y。 另外， 本发明揭示存在新的非天然蛋白质氨基酸， 如2-氨基-3-乙烯基-5-己烯 酸、 2-氨基-4-乙烯基-5-己烯酸、 3-乙烯基半胱氨酸、 2-乙烯基半胱氨酸。 这种新型的多双 键化组分可能具有不同的抗菌活性及生物活性， 具有潜在的应用前景。 0086 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述， 但其只是作为范例， 本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。 对于本领域技术人员而言， 任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。 因此， 在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改， 都应涵盖在本发明的范围内。 说明书 9/9 页 13 CN 111057131 A 13 图1 图2 说明书附图 1/5 页 14 CN 111057131 A 14 图3 图4 说明书附图 2/5 页 15 CN 111057131 A 15 图5 说明书附图 3/5 页 16 CN 111057131 A 16 图6 图7 说明书附图 4/5 页 17 CN 111057131 A 17 图8 图9 图10 说明书附图 5/5 页 18 CN 111057131 A 18 。