抑制肝糖异生的非苦味苦瓜三萜组合物及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911191519.1 (22)申请日 2019.11.28 (71)申请人 广东省农业科学院蚕业与农产品加 工研究所 地址 510610 广东省广州市天河区东莞庄 一横路133号 (72)发明人 邓媛元贾栩超张名位魏振承 张雁刘光唐小俊李萍 王佳佳廖娜王智明钟立煌 (74)专利代理机构 广州知友专利商标代理有限 公司 44104 代理人 宣国华刘艳丽 (51)Int.Cl. A23L 33/10(2016.01) A23L 33/105(2016.01) C07J 71/。

2、00(2006.01) (54)发明名称 一种抑制肝糖异生的非苦味苦瓜三萜组合 物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种抑制肝糖异生的非苦味 苦 瓜 三 萜 组 合 物 ， 其 活 性 成 分 主 要 由 CharantosideC和MomordicosideF1组成， 所述 CharantosideC和MomordicosideF1的质量份 配比为1:0.61.5。 还公开了上述苦瓜三萜组合 物在制备具有抑制肝糖异生效果的健康食品中 的应用。 本发明中的三萜组合物可以抑制肝脏葡 萄糖异生， 并且该组合物无明显苦味， 可以作为 功能性配料添加在食品中， 开发成为风味较好、 接受度高、 有利于。

3、血糖控制的健康食品。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 111067094 A 2020.04.28 CN 111067094 A 1.一种抑制肝糖异生的非苦味苦瓜三萜组合物， 其特征是： 其活性成分主要由 Charantoside C和Momordicoside F1组成， 所述Charantoside C和Momordicoside F1的质 量份配比为1:0.61.5。 2.根据权利要求1所述的抑制肝糖异生的非苦味苦瓜三萜组合物， 其特征是： 所述 Charantoside C、 Momordicoside F1以及所述苦瓜三萜组合物均属于非苦味物质。 3.权利要求1或2所述苦。

4、瓜三萜组合物在制备具有抑制肝糖异生效果的健康食品中的 应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征是： 所述苦瓜三萜组合物在健康食品中添加的质 量百分含量为0.12。 5.根据权利要求3所述的应用， 其特征是： 所述Charantoside C和Momordicoside F1的 制备方法如下： (1)选取苦瓜， 预处理后得苦瓜干粉； (2)在苦瓜干粉中加入体积百分含量为70的乙醇提取后， 得苦瓜三萜提取液； (3)将苦瓜三萜提取液依次用石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 然后浓缩， 依次得到石油 醚相、 乙酸乙酯相和正丁醇相； (4)将正丁醇相用大孔树脂粗纯化后， 依次用水、 体积百分含量。

5、为20的乙醇-水及体 积百分含量为80的乙醇-水洗脱， 其中体积百分含量为80的乙醇-水洗脱部分为三萜富 集部分； (5)将体积百分含量为80的乙醇-水洗脱部分用正相硅胶柱分离纯化， 以氯仿/甲醇 为洗脱剂， 依次采用体积比为50:1的氯仿/甲醇和体积比为20:1的氯仿/甲醇洗脱； (6)收集体积比为20:1的氯仿/甲醇洗脱液， 采用反相柱色谱分离， 分别采用体积百分 含量为50和体积百分含量为60的甲醇水梯度洗脱； (7)收集体积百分含量为60的甲醇水梯度洗脱液， 采用高效液相色谱仪进一步纯化， 并用体积百分含量为80的乙腈洗脱， 得到苦瓜三萜化合物Charantoside C和 Momor。

6、dicoside F1。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征是： 步骤(1)中所述的预处理包括清洗、 去籽、 切 片、 烘干、 粉碎和过筛处理。 7.根据权利要求5所述的应用， 其特征是： 步骤(3)中苦瓜三萜提取液与石油醚、 乙酸乙 酯、 正丁醇的萃取体积比均为1:3， 采用石油醚提取1次， 乙酸乙酯萃取2次， 正丁醇萃取3次。 8.根据权利要求5所述的应用， 其特征是： 步骤(4)中采用D101大孔树脂粗纯化。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111067094 A 2 一种抑制肝糖异生的非苦味苦瓜三萜组合物及其应用 技术领域 0001 本发明属于食品精深加工技术领域， 具体涉及一种。

7、抑制肝糖异生的非苦味苦瓜三 萜组合物及其应用。 背景技术 0002 苦瓜(Momordica charantia L.)是热带-亚热带特色药食两用蔬菜， 性味苦寒， 可 用于预防和改善糖尿病、 肥胖等多种能量代谢失衡相关疾病。 三萜类化合物是苦瓜调节糖 脂代谢的重要物质基础， 同时也是其最主要的苦味物质。 虽然大量体内外实验确证了苦瓜 三萜提取物具有显著的降血糖生物活性， 但强烈的苦味限制了其在食品领域的应用。 0003 三萜类化合物被普遍认为具有苦味。 目前从苦瓜中分离得到的三萜类化合物近 150个， 但单一化合物的苦味强度并无研究报道。 此外， 目前已知的具有降糖活性的苦瓜三 萜化合物约1。

8、4个， 其降糖活性主要包括激活AMPK信号通路、 刺激GLUT4在细胞膜对葡萄糖的 转运， 抑制 -葡萄糖苷酶的活性， 控制餐后血糖水平等， 但关于三萜化合物对肝糖异生的影 响并不清楚。 2型糖尿病的病理特征在于血液中葡萄糖含量过高， 或/且外周组织的糖利用 率降低。 而血液中过高的葡萄糖含量正来源于肝脏葡萄糖输出。 肝糖异生在糖尿病患者中 的发生率高达90。 抑制肝糖异生是治疗糖尿病的重要靶点。 0004 综上所述， 目前关于苦瓜三萜的苦味强度尚未可知， 且其对肝糖异生的影响亦不 清楚。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种苦瓜三萜组合物， 该组合物具有良好的抑制肝糖异生 活性， 且。

9、无明显苦味。 0006 本发明的目的还在于提供上述苦瓜三萜组合物在制备具有抑制肝糖异生效果健 康食品中的应用。 0007 本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现： 一种抑制肝糖异生的非 苦味苦瓜三萜组合物， 其活性成分主要由Charantoside C和Momordicoside F1组成， 所述 Charantoside C和Momordicoside F1的质量份配比为1:0.61.5。 0008 本发明以咖啡因为标准品， 采用电子舌对苦瓜中分离获得的系列苦瓜三萜化合物 进行了苦味强度定量分析。 同时以大鼠原代肝细胞为模型， 分析了该系列三萜化合物的肝 糖异生抑制活性。 从中筛选。

10、获得2个具有强活性的非苦味三萜化合物Charantoside C和 Momordicoside F1。 在此基础之上， 结合活性与苦味分析评价， 发明了具有增强其活性的组 合比例， Charantoside C和Momordicoside F1的质量份配比为1:0.61.5。 该组合物具有 显著的抑制肝糖异生活性， 且无明显苦味。 可以作为糖尿病人专用健康食品的功能性配料。 0009 其中Charantoside C和Momordicoside F1的化学结构式分别如下： 说明书 1/6 页 3 CN 111067094 A 3 0010 0011 其中所述Charantoside C、 Mo。

11、mordicoside F1以及所述苦瓜三萜组合物的苦味强 度均低于电子舌( -ASTREELiquidTaste Analyser， Alpha M.O.S.,Toulouse,France)检测 阈值， 属于非苦味物质。 0012 具体的， 上述两个化合物Charantoside C、 Momordicoside F1经电子舌定量分析， 其苦味强度低于电子舌检测阈值(110-4g/mL咖啡因)， 咖啡因标准曲线预测值分别为1.50 10-6和3.3910-10g/mL咖啡因(即1g/mL的Charantoside C和Momordicoside F1乙醇溶液 的苦味强度分别相当于1.501。

12、0-6和3.3910-10g/mL的咖啡因乙醇溶液苦味强度)， 属于非 苦味化合物。 0013 由Charantoside C和Momordicoside F1按照1:0.61.5的质量份配比组成的苦 瓜三萜组合物， 其苦味强度同样低于电子舌检测阈值， 1g/mL组合物苦味强度的咖啡因标准 曲线预测值为3.4010-85.6710-6g/mL咖啡因， 也属于非苦味物质。 0014 因此， 本发明中苦瓜三萜类化合物Charantoside C、 Momordicoside F1以及由这 两个组合物制成的苦瓜三萜组合物是非苦味的。 0015 本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现： 上述。

13、苦瓜三萜组合物在 制备具有抑制肝糖异生活性的健康食品中的应用。 0016 本发明实施例中的实验结果表明， Charantoside C和Momordicoside F1在20 M浓 度时的肝糖异生抑制活性分别为22.94和38.34， 高于黄连素(糖尿病治疗传统中草药 黄连的主要成分)在20 M时的抑制率15.61， 肝糖异生抑制活性显著。 0017 根据Charantoside C和Momordicoside F1结构差异及由结构引起的活性差异分 析与预测， 由Charantoside C和Momordicoside F1按照1:0.61.5的质量份配比组成的苦 瓜三萜组合物， 其肝糖异生抑。

14、制活性显著性高于相同剂量下的单一化合物。 0018 优选的， 所述苦瓜三萜组合物在健康食品中添加的质量百分含量为0.12。 0019 作为本发明一种优选的实施方式， 所述Charantoside C和Momordicoside F1的制 备方法如下： 0020 (1)选取苦瓜， 预处理后得苦瓜干粉； 0021 (2)在苦瓜干粉中加入体积百分含量为70的乙醇提取后， 得苦瓜三萜提取液； 0022 (3)将苦瓜三萜提取液依次用石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 然后浓缩， 依次得到 石油醚相、 乙酸乙酯相和正丁醇相； 0023 (4)将正丁醇相用大孔树脂粗纯化后， 依次用水、 体积百分含量为20的。

15、乙醇-水 及体积百分含量为80的乙醇-水洗脱， 其中体积百分含量为80的乙醇-水洗脱部分为三 萜富集部分； 说明书 2/6 页 4 CN 111067094 A 4 0024 (5)将体积百分含量为80的乙醇-水洗脱部分用正相硅胶柱分离纯化， 以氯仿/ 甲醇为洗脱剂， 依次采用体积比为50:1的氯仿/甲醇和体积比为20:1的氯仿/甲醇洗脱； 0025 (6)收集体积比为20:1的氯仿/甲醇洗脱液， 采用反相柱色谱分离， 分别采用体积 百分含量为50和体积百分含量为60的甲醇水梯度洗脱； 0026 (7)收集体积百分含量为60的甲醇水梯度洗脱液， 采用高效液相色谱仪进一步 纯化， 并用体积百分含。

16、量为80的乙腈洗脱， 得到苦瓜三萜化合物Charantoside C和 Momordicoside F1。 0027 在上述Charantoside C和Momordicoside F1的制备方法中： 0028 优选的， 步骤(1)中所述的预处理包括清洗、 去籽、 切片、 烘干、 粉碎和过筛处理。 0029 优选的， 步骤(3)中苦瓜三萜提取液与石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇的萃取体积比均 为1:3， 采用石油醚提取1次， 乙酸乙酯萃取2次， 正丁醇萃取3次。 0030 优选的， 步骤(4)中采用D101大孔树脂粗纯化。 0031 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 0032 (1)现有。

17、技术中苦瓜三萜提取物具有显著的降血糖活性， 但对于肝脏葡萄糖异生 的影响未知， 且其苦味强烈， 限制了其在食品中的应用， 本发明从前期分离获得的19个苦瓜 三萜化合物中筛选得到2个具有肝糖异生抑制活性的非苦味三萜化合物， 并获得了具有增 强其活性的组合比例， 突破了长期以来苦瓜三萜提取物因苦味强烈、 消费接受度低在食品 精深加工领域的应用限制。 0033 (2)本发明中的三萜组合物可以抑制肝脏葡萄糖异生， 其效果优于黄连素， 是苦瓜 三萜提取物抑制肝糖异生的主要活性成分， 并且该组合物无明显苦味， 可以作为功能性配 料添加在食品中， 开发成为风味较好、 接受度高的糖尿病人专用健康食品。 附图说。

18、明 0034 图1是实施例4中苦瓜三萜组合物对肝实质细胞葡萄糖生成的影响， 其中DMSO， 二 甲基亚砜(0.4)； Metfoumin， 二甲双胍(2mM)； Berberine黄连素(20 M)； triterpenoid extracts， 苦瓜三萜提取物(50 g/mL)； 组合物1,Charantoside C:Momordicoside F11: 0.25(质量份配比， 下同)； 组合物2,Charantoside C:Momordicoside F11:0.6； 组合物3, Charantoside C:Momordicoside F11:1； 组合物4,Charantoside。

19、 C:Momordicoside F1 1:1.5； 组合物5,Charantoside C:Momordicoside F11:4； 组合物终浓度均为20 M。 具体实施方式 0035 下面将结合具体的实施方式进一步说明本发明， 但本发明要求保护的范围并不局 限与下列实施方式。 0036 以下实施例中采用的各原料， 如无特殊说明， 均为市售产品。 0037 实施例1 0038 本实施例提供的抑制肝糖异生的非苦味苦瓜三萜组合物， 其活性成分主要由 Charantoside C和Momordicoside F1组成， Charantoside C和Momordicoside F1的质量份 配比为。

20、1:1.5。 0039 该组合物以2.0的质量百分含量添加于功能性口服液中， 可以有效抑制肝糖异 说明书 3/6 页 5 CN 111067094 A 5 生， 控制餐后血糖升高。 0040 本实施例中的Charantoside C和Momordicoside F1可以通过化学合成获得， 也可 以直接采用下文实施例4中的方法制备获得。 0041 实施例2 0042 本实施例提供的抑制肝糖异生的非苦味苦瓜三萜组合物， 其活性成分主要由 Charantoside C和Momordicoside F1组成， Charantoside C和Momordicoside F1的质量份 配比为1:1。 00。

21、43 该组合物以1.0的质量百分含量添加于冲调类饮料中， 可以有效抑制肝糖异生， 控制餐后血糖升高。 0044 实施例3 0045 本实施例提供的抑制肝糖异生的非苦味苦瓜三萜组合物， 其活性成分主要由 Charantoside C和Momordicoside F1组成， Charantoside C和Momordicoside F1的质量份 配比为1:0.6。 0046 该组合物以0.1的质量百分含量添加于营养餐粉中， 可以有效抑制肝糖异生， 控 制餐后血糖升高。 0047 实施例4 0048 下面以原代分离SD大鼠肝实质细胞为模型， 二甲双胍(metformin)、 黄连素 (Berberi。

22、ne)、 苦瓜三萜提取物(triterpenoid extracts， 下文中制备获得)为阳性对照， 评 价苦瓜三萜化合物Charantoside C和Momordicoside F1， 及其不同比例组合物对肝糖异生 的影响， 进一步阐述本发明的有益效果。 0049 过程如下： 0050 1、 试验材料 0051 1.1样品制备 0052 新鲜苦瓜清洗、 去籽、 切片， 55烘干12小时， 粉碎过80目筛， 得苦瓜干粉。 0053 苦瓜干粉用70乙醇按照料液比1:5常温提取2次， 得到苦瓜三萜提取液。 0054 粗提液浓缩后依次用石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取(萃取体积比1:3， 石油醚提取。

23、 1次， 乙酸乙酯萃取2次， 正丁醇萃取3次)， 之后采用旋转蒸发仪真空浓缩， 分别得到石油醚 相、 乙酸乙酯相和正丁醇相。 0055 正丁醇相通过D101大孔树脂粗纯化， 依次用水洗脱， 20乙醇-水洗脱及80乙 醇-水洗脱。 0056 其中80乙醇-水洗脱部分为三萜富集部分， 进一步采用正相硅胶柱分离纯化。 0057 以氯仿/甲醇为洗脱剂， 依次采用氯仿/甲醇50:1和氯仿/甲醇20:1洗脱。 0058 收集氯仿/甲醇20:1部分， 采用反相柱色谱分离， 50、 60甲醇水梯度洗脱。 0059 收集60甲醇水洗脱液， 经制备型高效液相色谱仪进一步纯化， 80乙腈洗脱， 得 到多个洗脱峰。 。

24、0060 通过核磁等现有的波谱分析手段解析其化学结构， 同时对比现有文献， 确认其中 两个洗脱峰为苦瓜三萜化合物Charantoside C和Momordicoside F1。 0061 上述过程中， 提取得到的苦瓜三萜提取液， 经真空旋转蒸发浓缩得到三萜提取物 (triterpenoid extracts)， 细胞实验备用。 说明书 4/6 页 6 CN 111067094 A 6 0062 1.2实验细胞 0063 采用原位灌注消化法， 利用type胶原酶消化SD大鼠肝脏， 分散肝细胞后转移至 49Percoll分离液离心， 弃去上清后将细胞接入以0.2明胶包被的24孔板中贴壁6h。 再 。

25、以无血清低糖培养基饥饿8h后， 弃去上清， PBS缓冲液清洗后加入反应液(含2mM丙酮酸钠和 20mM乳酸钠的无糖DMEM培养基)， 等待样品测试。 0064 2、 试验方法 0065 三萜化合物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中配制成10 M母液， 用上述反应液稀释后， 最终加入到细胞培养孔中的终浓度为20 M， DMSO终浓度0.4。 阳性对照三萜提取物用DMSO 配置成50mg/mL， 测试终浓度为50 g/mL， 并维持溶液中DMSO终浓度0.4。 阴性对照为含相 同浓度DMSO(0.4)的反应液。 阳性对照盐酸二甲双胍， 用超纯水配置成250mM， 测试终浓度 为2mM， 并维持DMSO。

26、终浓度0.4。 阳性对照黄连素(Berberine)， 用超纯水配置成40mM， 测试 终浓度为20 M， 并维持DMSO终浓度0.4。 细胞反应液中加入受试物， 继续培养6h。 之后以标 准曲线法测定每孔培养基(即反应液)中葡萄糖浓度， 而后弃去培养基， PBS换洗后以250mM NaOH裂解细胞并以考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。 通过读取吸光值， 以标准曲线法测定所有 样品孔内培养基中葡萄糖浓度与裂解后蛋白质浓度， 并以其比值衡量该孔细胞的平均糖异 生水平。 0066 2.1数据分析 0067 采用LSD法分析差异性。 结果以均数标准差表示， p0.05为差异有显著性。 0068 2.2实验结。

27、果 0069 苦瓜三萜化合物Charantoside C和Momordicoside F1， 及其不同比例组合物对肝 脏糖异生活性的影响见图1。 结果发现二甲双胍在常用量2mM时的肝糖异生抑制率为 61 .01。 20M时黄连素的抑制率为15.61。 50g/mL浓度时的三萜提取物抑制率为 54.22。 20 M的Charantoside C和Momordicoside F1的肝糖异生抑制活性分别为22.94 和38.34， 高于黄连素， 接近三萜提取物(苦瓜三萜提取物是一个混合物， 里面有三萜、 蛋 白、 多糖等很多物质， 因为物质间有协同增效作用， 而且提取物剂量大， 通常提取物的活性 会。

28、好过单体， 而本申请中的两个化合物是分离出来的单体化合物， 其活性接近三萜提取物 表明这两个化合物是苦瓜三萜提取物里面的主要活性单体)， 因此， 可以判定， 苦瓜三萜化 合物Charantoside C和Momordicoside F1具有显著的肝糖异生抑制活性， 且是苦瓜三萜提 取物发挥肝糖异生抑制活性的主要成分。 0070 当Charantoside C和Momordicoside F1按不同比例组合后， 其肝糖异生活性有显 著增加。 其中组合物4(Charantoside C:Momordicoside F11:1.5， 抑制率为43.54)抑 制率显著高于单一化合物相同剂量下的抑制率。。

29、 0071 实施例5 0072 下面采用电子舌( -ASTREELiquidTaste Analyser， Alpha M.O.S.,Toulouse, France)检测苦瓜三萜化合物Charantoside C和Momordicoside F1， 及其不同比例组合物 的苦味强度， 进一步阐述本发明的有益效果过程如下： 0073 1、 试验材料 0074 1.1样品制备 0075 称取1mg Charantoside C、 Momordicoside F1， 及其不同比例组合物， 加30mL无水 说明书 5/6 页 7 CN 111067094 A 7 乙醇， 溶解后将样品放置于电子舌专用烧。

30、杯(25mL)中待测。 无水乙醇样品为空白对照。 同时 以无水乙醇配制不同浓度的咖啡因标准品， 通过浓度量化的咖啡因标准曲线对各样品进行 苦味的预测。 咖啡因浓度量化标准曲线的相关系数R2为0.9823。 0076 1.2电子舌测定过程 0077 处理好的样品直接放置于电子舌专用烧杯中进行分析， 每个样品在实验时重复7 次， 实验的分析条件如下： 样品体积： 25mL， 样品采集时间： 120s， 每次分析时间： 180s。 0078 1.3数据处理 0079 采用Alpha soft软件进行数据分析。 苦味强度表述定义为： 1g/mL样品乙醇溶液的 苦味强度相当于咖啡因乙醇溶液的苦味强度(g。

31、/mL)。 0080 1.4实验结果 0081 化合物Charantoside C和Momordicoside F1经电子舌定量分析， 其苦味强度低于 电子舌检测阈值， 咖啡因标准曲线预测值分别为1.5010-6和3.3910-10g/mL啡因(即1g/ mL的Charantoside C和Momordicoside F1乙醇溶液的苦味强度分别相当于1.5010-6和 3.3910-10g/mL的咖啡因乙醇溶液苦味强度)， 属于非苦味化合物。 0082 实施例1中的苦瓜三萜组合物的苦味强度低于电子舌检测阈值， 1g/mL组合物4的 苦味强度预测值(咖啡因标准曲线预测值)为1.2210-8g/m。

32、L咖啡因， 属于非苦味化合物。 0083 实施例2中的苦瓜三萜组合物的苦味强度低于电子舌检测阈值， 1g/mL组合物3的 苦味强度预测值(咖啡因标准曲线预测值)为7.5110-7g/mL咖啡因， 属于非苦味化合物。 0084 实施例3中的苦瓜三萜组合物的苦味强度低于电子舌检测阈值， 1g/mL组合物2的 苦味强度预测值(咖啡因标准曲线预测值)为5.2410-6g/mL咖啡因， 属于非苦味化合物。 0085 以上实施例仅用于阐述本发明， 并不限制本发明的保护范围。 本技术领域的普通 技术人员依据以上公开的范围， 均可实现本发明的目的。 说明书 6/6 页 8 CN 111067094 A 8 图1 说明书附图 1/1 页 9 CN 111067094 A 9 。