FGF21融合蛋白及抑制其降解的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911359029.8 (22)申请日 2019.12.25 (71)申请人 东莞市东阳光生物药研发有限公司 地址 523867 广东省东莞市长安镇长安振 安中路368号3号楼214室 (72)发明人 李宇晟李利佳陈超欧晓涛 尚龙万志滔杨佩向婷 陈小锋李文佳 (74)专利代理机构 北京睿阳联合知识产权代理 有限公司 11758 代理人 王莹张颖 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/85(20。

2、06.01) C12N 5/10(2006.01) (54)发明名称 FGF21融合蛋白及抑制其降解的方法 (57)摘要 本发明公开了一种FGF21融合蛋白， 所述融 合蛋白包括： (1)： SEQIDNO:4所示的氨基酸序 列的胰高血糖素样多肽1(GLP-1)变体、 SEQID NO:6所示的氨基酸序列的连接肽、 SEQIDNO:8 所示的氨基酸序列的人IgG4变体抗体的Fc部分 和SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的成纤维细 胞生长因子21(FGF21)变体； 或(2)： 在(1)中的氨 基酸序列经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基 酸且具有FGF21融合蛋白活性的由(1)衍生的融 合蛋。

3、白。 本发明还公开了抑制FGF21融合蛋白降 解的方法， 包括在培养基中添加C1蛋白酶抑制 剂。 本发明的方法可有效抑制FGF21融合蛋白的 降解。 权利要求书1页 说明书9页 序列表6页 附图5页 CN 111087475 A 2020.05.01 CN 111087475 A 1.FGF21融合蛋白， 其特征在于， 所述融合蛋白包括： (1)： SEQ ID NO:4所示的氨基酸序 列的胰高血糖素样多肽1(GLP-1)变体、 SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的连接肽、 SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的人IgG4变体抗体的Fc部分和SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的 成。

4、纤维细胞生长因子21(FGF21)变体； 或(2)： 在(1)中的氨基酸序列经过取代、 缺失或添加 一个或几个氨基酸且具有FGF21融合蛋白活性的由(1)衍生的融合蛋白。 2.编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列， 其特征在于， 所述核苷酸序列包括： (1)： 编码胰高血糖素样多肽1(GLP-1)变体的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列、 编码连接肽 的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列、 编码人IgG4变体抗体的Fc部分的SEQ ID NO:7所示的核 苷酸序列和编码成纤维细胞生长因子21(FGF21)变体的SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列； 或 (2)： 与(1)的核苷酸序。

5、列互补的序列； 或(3)： 与(1)的核苷酸序列具有95以上同源性的序 列。 3.一种表达载体， 其特征在于， 所述表达载体包含权利要求2所述的核苷酸序列。 4.一种表达系统， 其特征在于， 所述表达系统包含权利要求3所述的表达载体。 5.根据权利要求4所述的表达系统， 其特征在于， 所述表达系统为宿主细胞， 优选CHO宿 主细胞。 6.用于培养权利要求4或5所述的表达系统的培养基， 其特征在于， 所述培养基中包含 C1蛋白酶抑制剂； 优选地， 所述C1蛋白酶抑制剂具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。 7.根据权利要求6所述的培养基， 其特征在于， 所述培养基中C1蛋白酶抑制剂的浓度。

6、为 1-16 g/mL， 优选为2-8 g/mL。 8.抑制FGF21融合蛋白降解的方法， 其特征在于， 在培养所述FGF21融合蛋白的培养基 中添加C1蛋白酶抑制剂； 优选地， 所述FGF21融合蛋白具有Arg与Tyr之间的肽键； 更优选地， 所述FGF21融合蛋白具有从N端开始第19位Arg与第20位Tyr之间的肽键。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述C1蛋白酶抑制剂具有SEQ ID NO:11所 示的氨基酸序列。 10.根据权利要求8或9所述的方法， 其特征在于， 培养基中所述C1蛋白酶抑制剂的浓度 为1-16 g/mL， 优选为2-8 g/mL。 权利要求书 1/1 。

7、页 2 CN 111087475 A 2 FGF21融合蛋白及抑制其降解的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种FGF21融合蛋白及抑制FGF21融合蛋白降 解的方法。 背景技术 0002 成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21， FGF21)， 是一种具有多 效性的类荷尔蒙蛋白， 本身并无促纤维素生长的作用， 是糖脂代谢的关键调控蛋白， 作为葡 萄糖和脂质内稳态的重要代谢调节物质发挥作用。 0003 有文献报道， 在稳定表达重组FGF21的CHO细胞中， FGF21容易出现降解， 降解处于 从N端开始第19位Arg与第20位T。

8、yr之间肽键位置， 该降解源于CHO细胞自身的蛋白酶。 0004 Takeshi Shimomura等公开了CHO-322细胞表达的重组人载脂蛋白E(Apo-E)在无 血清培养基中降解为24KDa及23KDa的片段， 在含胎牛血清培养基中， 降解得到抑制。 从胎牛 血清中分离纯化抑制剂分子， 将其加至无血清培养的CHO-322培养基， 添加剂量与降解情况 呈明显依赖性， 上清中可检测到完整的Apo-E。 (Takeshi Shimomura， Suppression of the degradation of recombinant human apolipoprotein E by a pr。

9、otease inhibitor o bta i n ed f r o m f e ta l bo v i n e s e r u m i n s e r u m -f r e e c u l t u r e ， Cytotechnology.1991May； 6(1):1-11.) 0005 Weng,Yan等公开了在稳定表达重组FGF21的CHO细胞中， FGF21容易出现降解， 降解 处于从N端开始第19位Arg与第20位Tyr之间肽键位置， 该降解源于CHO细胞自身的蛋白酶。 (Weng,Yan,et al.Glyco-engineered Long Acting FGF21 Vari。

10、ant with Optimal Pharmaceutical and Pharmacokinetic Properties to Enable Weekly to Twice Monthly Subcutaneous Dosing.Scientific Reports 8.1(2018):1-15.) 0006 近年来， 为了开发FGF21在制药方面的用途， 人们在增加FGF21在体内的稳定性、 延 长半衰期等方面做出了多种尝试， 如在FGF21天然序列的基础上进行不同位点的突变或插 入氨基酸或脂肪链或删除部分氨基酸、 采用成熟的偶联和修饰技术等。 0007 但对序列进行的各类突变和修饰， 。

11、存在非常高的技术门槛。 第一， 若添加或修改的 氨基酸数量过多， 在很大程度上会引起分子免疫原性的增加， 诱发机体产生有害的免疫反 应， 导致抗药抗体的产生。 第二， 对分子的改造往往需要考虑改造前后氨基酸残基的电荷、 亲疏水性、 二级结构倾向性及药效活性， 是基于计算机理论模拟的结果， 需要丰富的知识储 备。 另外， 设计分子变体及后续验证， 需要耗费大量时间。 0008 因此， 需要开发操作简单且能更有效的抑制FGF21降解的试剂和/或方法。 发明内容 0009 为了解决上述技术问题， 本发明提供如下技术方案。 0010 第一方面， 本发明提供一种FGF21融合蛋白， 所述融合蛋白包括： 。

12、(1)： SEQ ID NO:4 所示的氨基酸序列的胰高血糖素样多肽1(GLP-1)变体、 SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的 说明书 1/9 页 3 CN 111087475 A 3 连接肽、 SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的人IgG4变体抗体的Fc部分和SEQ ID NO:10所示 的氨基酸序列的成纤维细胞生长因子21(FGF21)变体； 或(2)： 在(1)中的氨基酸序列经过取 代、 缺失或添加一个或几个氨基酸且具有FGF21融合蛋白活性的由(1)衍生的融合蛋白。 0011 第二方面， 本发明提供一种编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列， 所述核苷 酸序列包括： (1)：。

13、 编码胰高血糖素样多肽1(GLP-1)变体的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列、 编码连接肽的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列、 编码人IgG4变体抗体的Fc部分的SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列和编码成纤维细胞生长因子21(FGF21)变体的SEQ ID NO:9所示的 核苷酸序列； 或(2)： 与(1)的核苷酸序列互补的序列； 或(3)： 与(1)的核苷酸序列具有95 以上同源性的序列。 0012 第三方面， 本发明提供一种表达载体， 所述表达载体包含前述的核苷酸序列。 0013 第四方面， 本发明提供一种表达系统， 所述表达系统包含前述的表达载体。 0014 作为本发明的。

14、一个具体实施方式， 所述表达系统为宿主细胞， 优选CHO宿主细胞。 0015 第五方面， 本发明提供一种用于培养前述的表达系统的培养基， 所述培养基中包 含C1蛋白酶抑制剂； 优选地， 所述C1蛋白酶抑制剂具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。 0016 作为本发明的一个具体实施方式， 所述培养基中C1蛋白酶抑制剂的浓度为1-16 g/mL， 优选为2-8 g/mL。 0017 第六方面， 本发明提供一种抑制FGF21融合蛋白降解的方法， 所述方法包括在培养 所述FGF21融合蛋白的培养基中添加C1蛋白酶抑制剂； 优选地， 所述FGF21融合蛋白具有Arg 与Tyr之间的肽键； 更优选。

15、地， 所述FGF21融合蛋白具有从N端开始第19位Arg与第20位Tyr之 间的肽键。 0018 作为本发明的一个具体实施方式， 所述C1蛋白酶抑制剂具有SEQ ID NO:11所示的 氨基酸序列； 优选地， 培养基中所述C1蛋白酶抑制剂的浓度为1-16 g/mL， 更优选为2-8 g/ mL。 0019 通过本发明的方法， 可使分泌至培养基中的FGF21融合蛋白避免被蛋白酶降解。 在 培养基中添加C1蛋白酶抑制剂， 可有效解决FGF21融合蛋白的降解问题， 尤其是具有Arg与 Tyr之间的肽键的FGF21融合蛋白的降解问题。 0020 本发明所用的C1蛋白酶抑制剂为人血浆C1抑制剂(huma。

16、n plasma C1 inhibitor)， 又称C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor， C1-INH)或C1抑制物(C1 inhibitor)， 属于丝氨酸蛋白酶抑制剂。 在探索过程中， 发明人尝试使用其他类型广谱蛋白 酶抑制剂或培养添加物， 结果对降解并无改善效果。 另外， 发明人还通过更改培养基改变表 达产物的糖基化程度， 结果对降解情况也没有改善。 0021 经过大量的努力和实验， 发明人意外地发现在FGF21融合蛋白的细胞培养阶段添 加C1蛋白酶抑制剂至培养基中， 培养结束后采用质谱检测分泌表达的融合蛋白降解情况， C1蛋白酶抑制剂的高浓度添加组(2 g/mL。

17、)可抑制蛋白降解， 中浓度添加组(1 g/mL)可部分 抑制降解， 然而低浓度添加组(0.5 g/mL)降解蛋白占比较多， 因此可得出结论， 即添加一定 浓度C1蛋白酶抑制剂可有效抑制FGF21融合蛋白的降解， 所述降解为FGF21融合蛋白的Arg 与Tyr之间肽键位置的降解。 0022 发明人进一步将C1蛋白酶抑制剂的浓度增大至8 g/mL和16 g/mL， 发现两组添加 浓度， 均可有效抑制产物降解， 但16 g/mL添加组的细胞活率及活细胞密度略低。 综合发明 说明书 2/9 页 4 CN 111087475 A 4 人的研究成果可得出， C1蛋白酶抑制剂的添加浓度可为1-16 g/mL。

18、， 优选的添加浓度可为2- 8 g/mL。 0023 有益效果 0024 本发明通过大量的实验研究发现， 在抑制FGF21融合蛋白的降解方面， 更换不同培 养基， 或是添加培养添加物人血清白蛋白HSA， 以及尝试了很多种蛋白酶抑制剂， 却都不能 改善FGF21融合蛋白的降解(详见对比例2-6)。 然而， 发明人最终意外地发现在细胞培养(特 别是CHO细胞培养)过程中添加某种特定的蛋白酶抑制剂(即C1蛋白酶抑制剂或C1-INH)， 可 以有效降低表达的FGF21融合蛋白的降解。 在培养基中添加本发明的C1蛋白酶抑制剂， 可有 效抑制FGF21融合蛋白的Arg与Tyr之间肽键位置的降解。 本发明的。

19、方法操作简便， 抑制 FGF21融合蛋白降解的效果稳定。 0025 根据本发明的技术方案， 在不改变蛋白的活性或功能的情况下， 可以对氨基酸序 列中的某些氨基酸进行保守取代， 参见以下表格： 0026 残基保守性替换残基保守性替换 AlaSerLeuIle； Val ArgLysLysArg； Gln AsnGln； HisMetLeu； Ile AspGluPheMet； Leu； Tyr GlnAsnSerThr； Gly CysSerThrSer； Val GluAspTrpTyr GlyProTyrTrp； Phe HisAsn； GlnValIle； Leu IleLeu； Val 。

20、0027 此外， 因为碱基的简并性， 在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下， 可以对 多核苷酸序列的碱基进行取代， 参见以下表格： 0028 说明书 3/9 页 5 CN 111087475 A 5 0029 附图说明 0030 图1.表达GLP-1类似物和FGF21类似物的表达载体图谱。 0031 图2.添加不同浓度的C1蛋白酶抑制剂的培养上清纯化后的质谱检测图。 0032 图3.对一系列融合蛋白进行非还原SDS-PAGE的检测图， 其中： 0033 M： 蛋白标记物， 6： 8 g/mL C1抑制剂添加组， 0034 8： 16 g/mL C1抑制剂添加组， 9： 未添加C1抑制剂添加。

21、组。 0035 图4.分别采用KD-CHOM(M1M5)培养基的还原质谱检测图。 0036 图5.分别采用Cellvento 200和KD-CHOM(B1-1， B1-2， B1-3)培养基的还原质谱检 测图。 0037 图6.添加不同浓度的蛋白酶抑制剂SIMGA-P1860的非还原质谱检测图。 0038 图7.添加不同浓度的蛋白酶抑制剂PMSF的还原质谱检测图。 0039 图8.添加不同浓度的蛋白酶抑制剂EGTA的还原质谱检测图。 0040 图9.添加不同浓度的蛋白酶抑制剂Chymostatin的还原质谱检测图。 0041 图10.添加不同浓度的蛋白酶抑制剂Ebelactone B的还原质谱。

22、检测图。 0042 图11.添加不同浓度的培养添加物HSA的还原质谱检测图。 0043 附图标记说明： 0044 1： 降解的蛋白 2： 未降解的蛋白 具体实施方式 0045 下面通过实施例对本发明作进一步说明， 应该理解的是， 本发明的实施例仅仅是 说明书 4/9 页 6 CN 111087475 A 6 用于说明本发明， 而不是本发明的限制， 在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属 于本发明要求保护的范围。 0046 实施例1： 表达载体的构建 0047 构建一种融合表达GLP-1类似物和FGF21类似物的基因工程细胞株。 0048 依据CHO的偏好密码子优化融合蛋白序列A-B-C-D。

23、-E-F， 其中A为信号肽， B为胰高 血糖素样肽-1变体(GLP-1)， C为连接肽， D为IgG4变体， E为连接肽， F为FGF21变体。 0049 A： 信号肽 0050 核苷酸序列(SEQ ID NO:1) 0051 atgcggtttttcttcgtgttcctggccatcgtgctgtttcagggcatccacgga 0052 氨基酸序列(SEQ ID NO:2) 0053 MRFFFVFLAIVLFQGIHG 0054 B： GLP-1变体 0055 核苷酸序列(SEQ ID NO:3) 0056 cacggagaaggaacctttacctccgacgtgtcttctta。

24、cctggaggaacaggcagctaaggagtttat cgcttggctggtgaaaggaggagga 0057 氨基酸序列(SEQ ID NO:4) 0058 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGG 0059 C： 连接肽 0060 核苷酸序列(SEQ ID NO:5) 0061 ggaggaggaggatccggaggaggaggatccggaggaggaggatcc 0062 氨基酸序列(SEQ ID NO:6) 0063 GGGGSGGGGSGGGGS 0064 D： IgG4变体 0065 核苷酸序列(SEQ ID NO:7) 0066 gaatct。

25、aagtacggacctccttgtcctccttgtccagctccagaagcagcaggaggaccttcagtgtt tctgtttcctcctaagcctaaggataccctgatgatctccagaacaccagaagtgacttgcgtggtggtggacgtg tctcaggaagatccagaagtgcagttcaattggtacgtggacggagtggaagtgcataacgctaagaccaagccta gagaggagcagttcaactccacctatagagtggtgtccgtgctgacagtgctgcatcaggattggctgaacggaaa ggagta。

26、caagtgcaaggtgtccaacaagggactgccttcttccatcgagaagacaatctccaaggctaagggacag cctagagaacctcaggtgtatacactgcctccttctcaggaagagatgaccaagaaccaggtgtctctgacttgtc tggtgaagggcttctatccttctgatatcgccgtcgagtgggaatctaacggacagccagagaacaactacaagac cacacctccagtgctggattcagacggatccttcttcctgtactccaagctgaccgtggacaaatctaggtggca。

27、g gaaggaaacgtgttctcttgttccgtgatgcacgaagctctgcataaccactacacccagaagtctctgtctctgt ctctggga 0067 氨基酸序列(SEQ ID NO:8) 0068 ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD。

28、SDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLG 说明书 5/9 页 7 CN 111087475 A 7 0069 E： 连接肽， 序列同C 0070 F： FGF21变体 0071 核苷酸序列(SEQ ID NO:9) 0072 catcctattccagattcttctcctctgctgcagtttggaggtcaggtgagacagagatacctgtacac agatgacgctcagcagacagaagctcatctggaaatcagagaagacggaacagtgggaggagcagcagatcagtct ccagaatctctgc。

29、tgcagctgaaagctctgaagccaggagtgattcagatcctgggagtgaagacctccagatttc tgtgtcagagaccagacggagctctgtacggatctctgcattttgacccagaggcttgttccttcagagaaagact gctggaagacggatacaacgtgtatcagagcgaagctcacggactgcctctgcatctgccaggaaataagtctcct catagagatccagctcctagaggaccagctagatttctgcctctgccaggactgcctccagctctgccagaacctc caggc。

30、atcctggctcctcagcctccagacgtgggatcttcagatcctctgcatatggtgggagcttctcagggact gtctccttcttacgcttct 0073 氨基酸序列(SEQ ID NO:10) 0074 HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVK TSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRERLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAL PEPPGILAPQPPDVGSSDPLHMVGASQGLS。

31、PSYAS 0075 由基因合成服务公司合成上述序列， 通过酶切将片段(X， 即A-B-C-D-E-F对应的核 苷酸序列)连接至载体pcDNA3.1的对应酶切位点之间， 将该载体转化大肠杆菌DH5 感受态， 经酶切验证得到克隆正确的pcDNA3.1-X菌株。 经质粒抽提得到表达融合蛋白A-B-C-D-E-F 的表达载体， 构建的表达载体如图1所示。 0076 实施例2： 构建CHO稳转细胞池 0077 构建表达融合蛋白A-B-C-D-E-F的CHO稳转细胞池。 0078 将实施例1中构建的表达载体使用限制性内切酶线性化处理， 乙醇沉淀后经过酚 氯仿抽提后， 溶解待用。 0079 将CHOK1宿。

32、主细胞用Cellvento CHO 200培养基复苏培养后， 当细胞密度约8 105cell/mL时收集细胞进行转染。 转染细胞约1107cell， 线性化质粒约40 g， 通过电击方 法转染(Bio-Rad， Gene pulser Xcell)。 电击后细胞于20mL Cellvento CHO 200培养基中 培养。 培养第二天， 离心收集细胞， 并在20mL Cellvento CHO 200培养基中重悬加压培养。 当细胞密度约0.6106cell/mL时， 对获得的混合克隆株用Cellvento CHO 200培养基进行 传代， 传代细胞密度约0.3106cell/mL。 当细胞存活。

33、率约90时， 获得CHOK1稳转细胞池。 0080 实施例3： 质谱检测 0081 将获得的CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200培养基， 加入C1抑制剂至培养 基， 分别为高浓度添加组(2 g/mL)、 中浓度添加组(1 g/mL)、 低浓度添加组(0.5 g/mL)， 37 ， 8CO2条件下培养3天后， 降温至30继续培养4天。 经ProteinA纯化及DTT还原后， 进行 质谱检测。 完整未降解的分子量约51.5Kda， 主要降解蛋白的分子量约34.2Kda。 0082 结果表明， 高浓度添加组能抑制FGF21融合蛋白降解， 且抑制效果呈剂量依赖性， 添加浓度越高， 降解。

34、蛋白占比越少(参见图2)。 0083 C1蛋白酶抑制剂的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)如下： 0084 NP_000053.2血浆蛋白酶C1抑制剂前体现代人(Homo sapiens) 0085 MASRLTLLTLLLLLLAGDRASSNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTN 说明书 6/9 页 8 CN 111087475 A 8 STTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDAL VDFSLKLYHAFSAMKKVETNM。

35、AFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQ IFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWK TTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPS VFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGV EAAAASAIS。

36、VARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA 0086 实施例4： 非还原SDS-PAGE检测 0087 将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200培养基， 加入C1蛋白酶抑制剂至培养 基， 分别为8 g/mL、 16 g/mL， 37， 8CO2条件下培养3天后， 降温至30继续培养4天。 收集 培养上清， Protein A层析柱进行纯化， 对一系列的融合蛋白进行非还原SDS-PAGE检测。 完 整未降解的分子量约103Kda， 主要降解蛋白的分子量约68.4Kda(参见图3)。 0088 从图3中可看出， 泳道6和泳道8均未见降解蛋白条带， 而泳。

37、道9出现大量降解蛋白 条带。 0089 8 g/mL C1抑制剂添加组放瓶的活细胞密度为4.94106cells/mL， 细胞活率为 98.99； 16 g/mL C1抑制剂添加组放瓶的活细胞密度为9.05105cells/mL， 细胞活率为 93.18。 0090 对比例1 0091 将CHOK1稳转细胞池分别接种至KD-CHOM(M1M5， B1-1， B1-2， B1-3)及Cellvento 200共9种培养基， 37， 8CO2， 130rpm培养3天后， 降温至30培养， 其余条件不变， 4天后 收集培养上清， ProteinA纯化经DTT还原后， 进行质谱检测。 理论上， 完整未。

38、降解的分子量约 51.5Kda， 主要降解蛋白的分子量约34.2Kda。 0092 结果表明大部分产物发生降解， 说明更换培养基对改善FGF21融合蛋白的降解无 明显作用(参见图4和图5)。 0093 对比例2 0094 SIMGA-P1860蛋白酶抑制剂为多种蛋白酶抑制剂混合物， 组成成分为抑肽酶 Aprotinin、 抑氨肽酶Bestatin、 E-64、 亮肽素Leupeptin、 胃蛋白酶抑制剂A， 可抑制细胞释 放到培养基中的氨肽酶(如亮氨酸氨基肽酶、 氨基肽酶B和三氨基肽酶)、 丝氨酸蛋白酶(如 胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶、 纤溶酶、 胰蛋白酶原、 尿激酶、 激肽释放酶、 人白细胞弹。

39、性蛋白 酶)、 半胱氨酸蛋白酶(如钙蛋白酶， 木瓜蛋白酶， 组织蛋白酶B和组织蛋白酶L)、 天冬氨酸蛋 白酶。 0095 将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200(原工艺配方)， 37， 130rpm， 8CO2条 件下培养3天， 第3天实验组加入蛋白酶抑制剂， 添加终浓度分别为抑制剂稀释200倍、 400 倍、 800倍。 第5天收集培养上清， ProteinA纯化后样品进行质谱检测。 因样品未经DTT还原， 理论上， 完整未降解的分子量约103Kda， 主要降解蛋白的分子量约68.4Kda。 0096 结果表明大部分产物发生降解， 表明添加广谱蛋白酶抑制剂对改善FGF21融合。

40、蛋 白的降解无明显作用(参见图6)。 0097 对比例3 0098 将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200， 同时添加终浓度0.1mM、 0.5mM、 1mM的 PMSF。 37， 130rpm， 8CO2条件下培养培养3天， 降温至30继续培养至4天。 收集上清经 说明书 7/9 页 9 CN 111087475 A 9 ProteinA纯化及DTT还原后， 进行质谱检测。 理论上完整未降解的分子量约51.5Kda， 主要降 解蛋白的分子量约34.2Kda。 0099 结果表明大部分产物发生降解， 表明添加PMSF对改善FGF21融合蛋白的降解无明 显作用(参见图7)。 01。

41、00 对比例4 0101 将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200， 同时添加终浓度1 M、 5 M、 10 M的 EGTA。 37， 130rpm， 8CO2条件下培养培养3天， 降温至30继续培养至4天。 收集上清经 ProteinA纯化及DTT还原后， 进行质谱检测。 理论上完整未降解的分子量约51.5Kda， 主要降 解蛋白的分子量约34.2Kda。 0102 结果表明大部分产物发生降解， 表明添加EGTA对改善FGF21融合蛋白的降解无明 显作用(参见图8)。 0103 对比例5 0104 将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200， 同时添加终浓度50M、。

42、 100M的 Chymostatin。 37， 130rpm， 8CO2条件下培养培养3天， 降温至30继续培养至4天。 收集 上清经ProteinA纯化及DTT还原后， 进行质谱检测。 理论上完整未降解的分子量约51.5Kda， 主要降解蛋白的分子量约34.2Kda。 0105 结果表明大部分产物发生降解， 表明添加Chymostatin对改善FGF21融合蛋白的降 解无明显作用(参见图9)。 0106 对比例6 0107 将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200， 同时添加终浓度5M、 10M的 Ebelactone B。 37， 130rpm， 8CO2条件下培养培养3天，。

43、 降温至30继续培养至4天。 收集 上清经ProteinA纯化及DTT还原后， 进行质谱检测。 理论上完整未降解的分子量约51.5Kda， 主要降解蛋白的分子量约34.2Kda。 0108 结果表明大部分产物发生降解， 表明添加Ebelactone B对改善FGF21融合蛋白的 降解无明显作用(参见图10)。 0109 对比例7 0110 将CHOK1稳转细胞池接种至Cellvento 200培养基， 加入HSA至培养基， HSA添加量 为1、 0.3、 0.5、 0.1， 37， 130rpm， 8CO2条件下培养4天， 转移至30继续培养2天 后收集培养上清， 经ProteinA纯化及DT。

44、T还原后， 进行质谱检测。 理论上完整未降解的分子 量约51.5Kda， 主要降解蛋白的分子量约34.2Kda。 0111 添加HSA组， 大部分目的产物发生降解(参见图11)。 0112 由以上对比例1-7的结果可知， 在不同的培养基以及各种浓度的不同蛋白酶抑制 剂的作用下， FGF21均出现大部分降解。 与之相比， 结合图2和图3， 由本发明的实施例3和4的 检测结果可知， 本发明的C1蛋白酶抑制剂能够明显抑制FGF21融合蛋白的降解。 0113 以上详细描述了本发明的优选实施方式， 但是， 本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节， 在本发明的技术构思范围内， 可以对本发明的技术方案进行。

45、多种简单变型， 这 些简单变型均属于本发明的保护范围。 0114 另外需要说明的是， 在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征， 在不矛 盾的情况下， 可以通过任何合适的方式进行组合， 为了避免不必要的重复， 本发明对各种可 说明书 8/9 页 10 CN 111087475 A 10 能的组合方式不再另行说明。 0115 此外， 本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合， 只要其不违背本 发明的思想， 其同样应当视为本发明所公开的内容。 说明书 9/9 页 11 CN 111087475 A 11 SEQUENCE LISTING 东莞市东阳光生物药研发有限公司 FGF21融合蛋。

46、白及抑制其降解的方法 RYP1910528.8 11 PatentIn version 3.5 1 54 DNA 人工序列 1 atgcggtttt tcttcgtgtt cctggccatc gtgctgtttc agggcatcca cgga 54 2 18 PRT 人工序列 2 Met Arg Phe Phe Phe Val Phe Leu Ala Ile Val Leu Phe Gln Gly Ile 1 5 10 15 His Gly 3 93 DNA 人工序列 3 cacggagaag gaacctttac ctccgacgtg tcttcttacc tggaggaaca ggca。

47、gctaag 60 gagtttatcg cttggctggt gaaaggagga gga 93 4 31 PRT 人工序列 4 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly 20 25 30 5 45 序列表 1/6 页 12 CN 111087475 A 12 DNA 人工序列 5 ggaggaggag gatccggagg aggaggatcc ggaggaggag 。

48、gatcc 45 6 15 PRT 人工序列 6 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 7 684 DNA 人工序列 7 gaatctaagt acggacctcc ttgtcctcct tgtccagctc cagaagcagc aggaggacct 60 tcagtgtttc tgtttcctcc taagcctaag gataccctga tgatctccag aacaccagaa 120 gtgacttgcg tggtggtgga cgtgtctcag gaagatccag aagtg。

49、cagtt caattggtac 180 gtggacggag tggaagtgca taacgctaag accaagccta gagaggagca gttcaactcc 240 acctatagag tggtgtccgt gctgacagtg ctgcatcagg attggctgaa cggaaaggag 300 tacaagtgca aggtgtccaa caagggactg ccttcttcca tcgagaagac aatctccaag 360 gctaagggac agcctagaga acctcaggtg tatacactgc ctccttctca ggaagagatg 420。

50、 accaagaacc aggtgtctct gacttgtctg gtgaagggct tctatccttc tgatatcgcc 480 gtcgagtggg aatctaacgg acagccagag aacaactaca agaccacacc tccagtgctg 540 gattcagacg gatccttctt cctgtactcc aagctgaccg tggacaaatc taggtggcag 600 gaaggaaacg tgttctcttg ttccgtgatg cacgaagctc tgcataacca ctacacccag 660 aagtctctgt ctctgtct。