Cdk5纳米抗体和筛选方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910057953.4 (22)申请日 2019.01.22 (71)申请人 山西农业大学 地址 030600 山西省晋中市太谷县杨家庄 (72)发明人 范瑞文齐淑慧董常生姬凯元 刘博 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569 代理人 代芳 (51)Int.Cl. C07K 16/40(2006.01) C12N 15/70(2006.01) G01N 33/68(2006.01) C40B 40/10(2006.01) C40B 50/06(2006.01) 。

2、(54)发明名称 一种Cdk5纳米抗体和筛选方法 (57)摘要 本发明提供了一种Cdk5纳米抗体和筛选方 法， 涉及生物工程技术领域， 所述Cdk5纳米抗体 具有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。 本发明提 供的Cdk5纳米抗体检测活性为0.3125ug/ml， 可 作为Cdk5蛋白检测的科研性纳米抗体。 权利要求书2页 说明书21页 序列表29页 附图2页 CN 109678962 A 2019.04.26 CN 109678962 A 1.一种Cdk5纳米抗体， 其特征在于， 所述Cdk5纳米抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸 序列。 2.权利要求1所述的Cdk5纳米抗体的筛选方。

3、法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)将黑素瘤纳米抗体库进行第一轮淘洗， 得到B16-Cdk5-VHH1； 所述第一轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为1822 g/ml； 2)将所述步骤1)得到的B16-Cdk5-VHH1依次进行第二轮、 第三轮和第四轮淘洗， 得到噬 菌体液； 所述第二轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为812 g/ml； 所述第三轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为38 g/ml； 所述第四轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为38 g/ml； 3)将所述步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、 感染后进行培养， 得到菌株； 4)将所述步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、 感染，。

4、 将得到的感染物进行第一 振荡培养后进行第一离心， 将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后， 进行第二离心， 将得到的第二上清液与封闭液混合、 孵育后进行间接ELISA检测， 检测第二 上清液同Cdk5蛋白的反应性， 以确定所述菌株与Cdk5蛋白具有反应性； 所述第一振荡的温度为3542， 所述第二振荡的温度为2832； 所述第一离心的离心力为17001900g， 所述第二离心的离心力为20002100g； 5)将所述步骤4)与Cdk5蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取， 以所述质粒为模版， 用 质粒引物对进行PCR扩增， 得到纳米抗体VHH片段， 将所述纳米抗体VHH片段与表达载。

5、体连 接， 得到重组质粒； 所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物， 所述质粒上游引物具有SEQ IDNo.2 所示的核苷酸序列； 所述质粒下游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列； 6)将所述步骤5)得到的重组质粒、 pBAD18转入大肠杆菌， 得到纳米抗体表达菌株， 对所 述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后， 提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白， 根据 蛋白分子量及His-tag标签对所述蛋白进行Western Blotting鉴定， 蛋白分子量为15kDa的 蛋白为Cdk5纳米抗体。 3.根据权利要求2所述的筛选方法， 其特征在于， 所述黑素瘤纳米抗体库的构建方法， 。

6、包括以下步骤： A.将Cdk5基因中的CDS区的基因与载体连接， 得到表达载体； B.将所述步骤A得到的表达载体转染黑色素瘤细胞、 培养， 得到培养细胞， 提取所述培 养细胞中的蛋白； C.将所述步骤B得到的蛋白免疫动物后， 提取动物血液中淋巴细胞总RNA， 将所述淋巴 细胞总RNA反转录为cDNA； D.以所述步骤C得到的cDNA为模版， 用Call001-F和Call002-R引物对进行第一PCR扩 增， 得到700bp扩增产物； 所述Call001-F引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列； 所述Call002-R引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列； E.以所述步骤D。

7、得到的700bp扩增产物为模版， 用VHH2-F和VHH2-R引物对进行第二PCR 权利要求书 1/2 页 2 CN 109678962 A 2 扩增， 得到VHH片段； 所述VHH2-F引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列； 所述VHH2-R引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列； F.将所述步骤E得到的VHH片段和pCANTAB5e分别经两次酶切后连接， 得到连接产物； G.将所述步骤F得到的连接产物与TG1电转化感受态细胞混合后进行电转化， 得到黑素 瘤纳米抗体库。 4.根据权利要求2所述的筛选方法， 其特征在于， 所述步骤3)培养的温度为2535。 5.根据权利要求2。

8、所述的筛选方法， 其特征在于， 所述步骤4)感染的时间为2535min。 6.根据权利要求2所述的筛选方法， 其特征在于， 所述步骤4)孵育的时间为5070min。 7.根据权利要求3所述的筛选方法， 其特征在于， 所述步骤B转染的时间为5060h。 8.根据权利要求3所述的筛选方法， 其特征在于， 所述步骤B培养使用的培养基为含有 体积分数为812FBS的DMEM高糖培养基。 9.根据权利要求3所述的筛选方法， 其特征在于， 所述步骤D第一PCR扩增的程序包括： 955min； 9530s， 5330s， 7240s， 30个循环； 725min。 10.根据权利要求3所述的筛选方法， 其特。

9、征在于， 所述步骤E第二PCR扩增的程序包括： 955min； 9530s， 5630s， 7230s， 30个循环； 725min。 权利要求书 2/2 页 3 CN 109678962 A 3 一种Cdk5纳米抗体和筛选方法 技术领域 0001 本发明涉及生物工程技术领域， 具体涉及一种Cdk5纳米抗体和筛选方法。 背景技术 0002 骆驼科动物(羊驼、 骆驼)和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性 的特异性抗体称单域抗体， 单域抗体的抗原结合位点(VHH)具有独立的抗原识别能力， 独立 表达的VHH又被称为纳米抗体。 与传统的四联体抗体相比， 单域抗体的主要特点有： 分子量 小。

10、， 结构简单， 理化性质稳定等。 纳米抗体得优良特性使其在多种方面具有优势： 在抗体进 入机体方面纳米抗体能够穿过动物机体内的一些保护性的屏障进入发病部位发挥作用， 如 血脑屏障、 血睾屏障等； 在抗原抗体结合方面能够结合一些隐蔽的抗原表位， 特别适用于比 较难得到抗体的靶点， 如GPCR、 离子通道和酶活中心等； 在降低生产成本方面纳米抗体结构 简单易于体外表达， 同时体外表达不易产生包涵体， 生产工艺简单； 同时纳米抗体的分子量 小， 结构简单， 更有利于进行基因改造， 纳米抗体人源化修饰等特性。 0003 黑色素瘤是由黑色素细胞癌化形成的一种最具侵袭性的发生于皮肤部位的恶性 癌症。 细胞。

11、周期素依赖性激酶5(cyclindependentkinase 5； Cdk5)， 属于丝氨酸/苏氨酸激 酶(serine/threonineproteinkinase)家属成员之一。 Cdk5的作用与神经细胞的成熟和移 动、 中枢神经系统的正常发育有关， 同时与感觉通路， 例如痛觉信号机制有关。 一旦Cdk5异 常， 将导致各种神经退行性疾病， 例如阿兹罕默综合症。 我们发现CDK5在小鼠黑色素瘤 (B16)细胞中异常性高表达， Cdk5可以促进黑色素瘤细胞的生长和增殖， 制备Cdk5纳米抗 体， 一方面可以成为利用分子成像技术研究Cdk5作用机制的示踪工具， 另一方面可以作为 抑制黑素瘤生。

12、长的小分子工具。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种Cdk5纳米抗体， 对Cdk5蛋白具有较好的灵敏度。 0005 本发明提供了一种Cdk5纳米抗体， 其特征在于， 所述Cdk5纳米抗体具有SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列。 0006 本发明还提供了上述技术方案所述的Cdk5纳米抗体的筛选方法， 其特征在于， 包 括以下步骤： 0007 1)将黑素瘤纳米抗体库进行第一轮淘洗， 得到B16-Cdk5-VHH1； 0008 所述第一轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为1822 g/ml； 0009 2)将所述步骤1)得到的B16-Cdk5-VHH1依次进行第二轮、 第三轮和第四轮淘洗， 。

13、得 到噬菌体溶液； 0010 所述第二轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为812 g/ml； 0011 所述第三轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为38 g/ml； 0012 所述第四轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为38 g/ml； 0013 3)将所述步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、 感染后进行培养， 得到菌株； 说明书 1/21 页 4 CN 109678962 A 4 0014 4)将所述步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、 感染， 将得到的感染物进行 第一振荡培养后进行第一离心， 将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养 后， 进行第二离心， 将得到的第二上清液与封闭。

14、液混合、 孵育后进行间接ELISA检测， 检测第 二上清液同Cdk5蛋白的反应性， 以确定所述菌株与Cdk5蛋白具有反应性； 0015 所述第一振荡的温度为3542， 所述第二振荡的温度为2832； 0016 所述第一离心的离心力为17001900g， 所述第二离心的离心力为20002100g； 0017 5)将所述步骤4)与Cdk5蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取， 以所述质粒为模 版， 用质粒引物对进行PCR扩增， 得到纳米抗体VHH片段， 将所述纳米抗体VHH片段与表达载 体连接， 得到重组质粒； 0018 所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物， 所述质粒上游引物具有SEQ ID 。

15、No.2所示的核苷酸序列； 0019 所述质粒下游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列； 0020 6)将所述步骤5)得到的重组质粒、 pBAD18转入大肠杆菌， 得到纳米抗体表达菌株， 对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后， 提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白， 根据蛋白分子量及His-tag标签对所述蛋白进行Western Blotting鉴定， 蛋白分子量为 15kDa的蛋白为Cdk5纳米抗体。 0021 优选的， 所述黑素瘤纳米抗体库的构建方法， 包括以下步骤： 0022 A.将Cdk5基因中的CDS区的基因与载体连接， 得到表达载体； 0023 B.将所述步骤A得到。

16、的表达载体转染黑色素瘤细胞、 培养， 得到培养细胞， 提取所 述培养细胞中的蛋白； 0024 C.将所述步骤B得到的蛋白免疫动物后， 提取动物血液中淋巴细胞总RNA， 将所述 淋巴细胞总RNA反转录为cDNA； 0025 D.以所述步骤C得到的cDNA为模版， 用Call001-F和Call002-R引物对进行第一PCR 扩增， 得到700bp扩增产物； 0026 所述Call001-F引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列； 0027 所述Call002-R引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列； 0028 E.以所述步骤D得到的700bp扩增产物为模版， 用VHH2-F和V。

17、HH2-R引物对进行第二 PCR扩增， 得到VHH片段； 0029 所述VHH2-F引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列； 0030 所述VHH2-R引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列； 0031 F.将所述步骤E得到的VHH片段和pCANTAB5e分别经两次酶切后连接， 得到连接产 物； 0032 G.将所述步骤F得到的连接产物与TG1电转化感受态细胞混合后进行电转化， 得到 黑素瘤纳米抗体库。 0033 优选的， 所述步骤3)培养的温度为2535。 0034 优选的， 所述步骤4)感染的时间为2535min。 0035 优选的， 所述步骤4)孵育的时间为5070min。

18、。 0036 优选的， 所述步骤B转染的时间为5060h。 0037 优选的， 所述步骤B培养使用的培养基为含有体积分数为812FBS的DMEM高糖 说明书 2/21 页 5 CN 109678962 A 5 培养基。 0038 优选的， 所述步骤D第一PCR扩增的程序包括： 955min； 9530s， 5330s， 72 40s， 30个循环； 725min。 0039 优选的， 所述步骤E第二PCR扩增的程序包括： 955min； 9530s， 5630s， 72 30s， 30个循环； 725min。 0040 本发明提供了一种Cdk5纳米抗体， 对Cdk5蛋白具有较好的灵敏度。 00。

19、41 本发明实施例的结果显示： 本发明提供的Cdk5纳米抗体不仅能够特异性结合Cdk5 蛋白， 对该蛋白的灵敏度最低为0.3125ug/ml。 附图说明 0042 图1为第一轮PCR-VHH凝胶电泳图； 0043 图2为第二轮PCR-VHH电泳图； 0044 图3为平板检测B16-VHH纳米文库库容结果； 0045 图4为平板检测B16-VHH纳米文库丰度结果； 0046 图5为PCR检测B16-VHH纳米文库插入率结果。 具体实施方式 0047 本发明提供了一种Cdk5纳米抗体， 其特征在于， 所述Cdk5纳米抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。 0048 在本发明中， 所述纳米。

20、抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列， 具体序列如下： 0049 SCSSWSPGEAWCSLGGLDSPVQPLDLPSETMTAGSARLQERGPSGSQLLILVVVAHTMQTPRADSPSP ETTPRTRCICKTAHLRTRPCITVREEERLIMAMTTGARGPRSPSPQRTTAKTPAP。 0050 本发明还提供了上述技术方案所述的Cdk5纳米抗体的筛选方法， 包括以下步骤： 0051 1)将黑素瘤纳米抗体库进行第一轮淘洗， 得到B16-Cdk5-VHH1； 0052 所述第一轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为1822 g/ml； 0053 2)将所述步骤1)。

21、得到的B16-Cdk5-VHH1依次进行第二轮、 第三轮和第四轮淘洗， 得 到噬菌体溶液； 0054 所述第二轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为812 g/ml； 0055 所述第三轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为38 g/ml； 0056 所述第四轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为38 g/ml； 0057 3)将所述步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、 感染后进行培养， 得到菌株； 0058 4)将所述步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、 感染， 将得到的感染物进行 第一振荡培养后进行第一离心， 将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养 后， 进行第二离心， 将得到的第二。

22、上清液与封闭液混合、 孵育后进行间接ELISA检测， 检测第 二上清液同Cdk5蛋白的反应性， 以确定所述菌株与Cdk5蛋白具有反应性； 0059 所述第一振荡的温度为3542， 所述第二振荡的温度为2832； 0060 所述第一离心的离心力为75008500g， 所述第二离心的离心力为20002100g； 0061 5)将所述步骤4)与Cdk5蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取， 以所述质粒为模 版， 用质粒引物对进行PCR扩增， 得到纳米抗体VHH片段， 将所述纳米抗体VHH片段与表达载 说明书 3/21 页 6 CN 109678962 A 6 体连接， 得到重组质粒； 0062 所述质粒。

23、引物包括质粒上游引物和质粒下游引物， 所述质粒上游引物具有SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列， 具体序列如下： 0063 CTAGCTAGCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCCG， 其中， GCTAGC为NheI酶切位点。 0064 所述质粒下游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列； 0065 CGAGCTCTGGAGCTGGGGTCTTCGC， 其中， GAGCTC为NheI酶切位点。 0066 6)将所述步骤5)得到的重组质粒、 pBAD18转入大肠杆菌， 得到纳米抗体表达菌株， 对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后， 提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白， 根据蛋白。

24、分子量及His-tag标签对所述蛋白进行Western Blotting鉴定， 蛋白分子量为 15kDa的蛋白为Cdk5纳米抗体。 0067 本发明将黑素瘤纳米抗体库进行第一轮淘洗， 得到B16-Cdk5-VHH1； 所述第一轮淘 洗的Cdk5蛋白的包被浓度为1822 g/ml。 0068 本发明对所述黑素瘤纳米抗体库没有特殊限定， 采用常规使用的黑素瘤纳米库即 可， 在本发明实施例中， 所述黑素瘤纳米抗体库的构建方法优选包括以下步骤： 0069 A.将Cdk5基因中的CDS区的基因与载体连接， 得到表达载体； 0070 B.将所述步骤A得到的表达载体转染黑色素瘤细胞、 培养， 得到培养细胞，。

25、 提取所 述培养细胞中的蛋白； 0071 C.将所述步骤B得到的蛋白免疫动物后， 提取动物血液中淋巴细胞总RNA， 将所述 淋巴细胞总RNA反转录为cDNA； 0072 D.以所述步骤C得到的cDNA为模版， 用Call001-F和Call002-R引物对进行第一PCR 扩增， 得到700bp扩增产物； 0073 所述Call001-F引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列， 具体序列如下： 0074 GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG； 0075 所述Call002-R引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列， 具体序列如下： 0076 GGTACGTGCTGTTG。

26、AACTGTTCC。 0077 E.以所述步骤D得到的700bp扩增产物为模版， 用VHH2-F和VHH2-R引物对进行第二 PCR扩增， 得到VHH片段； 0078 所述VHH2-F引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列， 具体序列如下： 0079 TTTCTATTACTAGGCCCAGCCGGCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTCNGGNGG； 0080 所述VHH2-R引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列， 具体序列如下： 0081 AAACCGTTGGCCATAATGGCCTGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGT。 0082 F.将所述步骤E得到的VHH片。

27、段和pCANTAB5e分别经两次SfiI酶切后连接， 得到连 接产物； 0083 G.将所述步骤F得到的连接产物与TG1电转化感受态细胞混合后进行电转化， 得到 黑素瘤纳米抗体库。 0084 本发明优选将Cdk5基因中的CDS区的基因与载体连接， 得到表达载体。 0085 在本发明中， 所述Cdk5为细胞周期素依赖性激酶5。 0086 在本发明中， 所述载体优选为pCDNA3.1， 本发明对所述连接的方法没有特殊限定， 采用常规即可。 说明书 4/21 页 7 CN 109678962 A 7 0087 本发明优选将表达载体转染黑色素瘤细胞、 培养， 得到培养细胞、 提取所述培养细 胞中的蛋白。

28、。 0088 在本发明中， 所述转染的时间优选为5060g， 更优选为56h， 本发明将表达载体转 染黑素瘤细胞后， 高表达的Cdk5能够加快黑素瘤细胞的增殖。 0089 在本发明中， 所述培养使用的培养基优选为含有体积分数为812FBS的DMEM高 糖培养基， 更优选为含有体积分数为10FBS的DMEM高糖培养基。 本发明对提取所述培养细 胞中的蛋白的方法没有特殊限定， 采用常规提取蛋白的方法即可。 0090 本发明优选将所述蛋白免疫动物后， 提取动物血液中淋巴细胞总RNA， 将所述淋巴 细胞总RNA反转录为cDNA。 0091 在本发明中， 所述动物优选为羊驼。 0092 本发明对所述免疫。

29、的方法没有特殊限定， 采用常规免疫原免疫动物的方法即可。 0093 本发明对所述提取动物血液中淋巴细胞总RNA的方法没有特殊限定， 采用常规RNA 提取的方法即可。 0094 在本发明中， 所述反转录优选包括： 将5 g总RNA、 1 l Random6 Primer、 1 l Oligo (dT)18Primer、 1 l dNTP Mix和7 l ddH2O混合后在65下处理5min， 将得到的处理物在冰 上静置5min， 将所述静置物与4 l 5X PrimeScript II buffer、 0.5 l RNase inhibiter、 1 l Primer Scrip II Rtas。

30、e和4.5 l ddH2O混合后， 依次40处理40min和70处理15min， 得到cDNA。 0095 本发明以cDNA为模版， 用Call001-F和Call002-R引物对进行第一PCR扩增， 得到 700bp扩增产物； 0096 所述Call001-F引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列； 所述Call002-R引物具 有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。 0097 在本发明中， 所述Call001-F引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列， 具体序列 如下： 0098 GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG； 0099 所述Call002-R引物具有。

31、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列， 具体序列如下： 0100 GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC。 0101 在本发明中， 所述Call001-F引物对应羊驼抗体的Leader区， 所述Call002-R引物 对应于羊驼抗体的第二恒定区(CH2)， 可分别对常规抗体(900bp)及重链抗体(700bp)的 leader区及CH2区域进行扩增。 本发明将扩增得到的700bp扩增产物进行第二扩增。 0102 在本发明中， 所述第一PCR扩增的体系优选每50 l包括： 2 l cDNA、 浓度为10umol/ l的Call001-F 1 l、 浓度为10umol/ul的Call00。

32、1-R 1 l、 25 l Taq Green PCR Mix和21 l ddH2O。 0103 在本发明中， 所述第一PCR扩增的程序优选包括： 955min； 9530s， 5330s， 72 40s， 30个循环； 725min。 0104 本发明以所述700bp扩增产物为模版， 用VHH2-F和VHH2-R引物对进行第二PCR扩 增， 得到VHH片段； 所述VHH2-F引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列； 所述VHH2-R引物具 有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。 0105 在本发明中， 所述VHH2-F引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列， 具体序列如下。

33、 说明书 5/21 页 8 CN 109678962 A 8 所示： 0106 TTTCTATTACTAGGCCCAGCCGGCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTCNGGNGG； 0107 所述VHH2-R引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列， 具体序列如下所示： 0108 AAACCGTTGGCCATAATGGCCTGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGT。 0109 根据第一轮PCR产物的测序结果， 在羊驼单域抗体(VHH结构域)的两端恒定区FR1、 FR4区域分别设计第二轮扩增引物VHH2-F和VHH2-R， 以扩增VHH序列。 0110 本发明将得到的VHH片段和p。

34、CANTAB5e分别经两次SfiI酶切后连接， 得到连接产 物。 0111 本发明对所述VHH片段和pCANTAB5e的酶切没有特殊限定， 采用常规酶切的方法即 可。 在本发明中， 经两次酶切后能够消除空载率。 0112 在本发明中， 所述连接使用的酶优选为T4连接酶。 在本发明中， 所述连接的体系优 选每200 l包括： VHH片段1 g、 pCANTAB5e载体3 g、 T4DNA Ligase 10 l、 10Buffer 20 l， ddH2O补充至200 l。 本发明对所述连接的条件没有特殊限定， 采用常规连接条件即可。 0113 本发明将所述连接产物与TG1电转化感受态细胞混合后进。

35、行电转化， 得到黑素瘤 纳米库。 0114 在本发明中， 所述电转化优选包括： 所述电转化的电压优选为1.52.0KV， 更优选 为1.8KV； 所述电转化的电阻优选为180220， 更优选为200； 所述电转化的电容优选为 2030 F， 更优选为25 F； 所述电转化的时间优选为46ms， 更优选为5ms。 0115 本发明电转化后还包括： 将得到的电转化物在37下孵育1h， 将得到的孵育物在 5000g下离心5min， 将得到的沉淀加入SOC液体培养基后， 得到黑素瘤纳米抗体库。 0116 在本发明中， 所述第一轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为1822 g/ml， 优选为10 g/ml。。

36、 本发明对所述第一轮淘洗的方法没有特殊限定， 采用本领域常规淘洗的方法即可。 0117 本发明将得到的B16-Cdk5-VHH1依次进行第二轮、 第三轮和第四轮淘洗， 得到噬菌 体溶液； 所述第二轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为812 g/ml； 所述第三轮淘洗的Cdk5蛋 白的包被浓度为38 g/ml； 所述第四轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为38 g/ml。 0118 在本发明中， 所述第二轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为812 g/ml， 优选为10 g/ ml； 所述第三轮淘洗的Cdk5蛋白的包被浓度为38 g/ml， 优选为5 g/ml； 所述第四轮淘洗 的Cdk5蛋白的包被浓度为3。

37、8 g/ml， 优选为5 g/ml。 本发明对所述第二轮淘洗、 第三轮淘 洗和第四轮淘洗的方法没有特殊限定， 采用本领域常规淘洗的方法即可。 0119 本发明将得到的噬菌体液与TG1菌液混合、 感染后进行培养， 得到菌株。 0120 在本发明中， 所述噬菌体液与TG1菌液的体积比优选为1:4。 在本发明中， 所述TG1 菌液的OD600值优选为0.4。 在本发明中， 所述培养的温度优选为2535， 更优选为30。 0121 本发明将得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、 感染， 将得到的感染物进行第一振 荡培养后进行第一离心， 将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后， 进 行第二离。

38、心， 将得到的第二上清液与封闭液混合、 孵育后进行间接ELISA检测， 检测第二上 清液同Cdk5蛋白的反应性， 以确定所述菌株与Cdk5蛋白具有反应性； 所述第一振荡的温度 为3542， 所述第二振荡的温度为2832； 所述第一离心的离心力为17001900g， 所 述第二离心的离心力为20002100g。 0122 在本发明中， 所述菌株与KM13辅助噬菌体混合后优选以静置的方式进行感染， 所 说明书 6/21 页 9 CN 109678962 A 9 述感染的时间优选为2535min， 优选为30min。 0123 在本发明中， 所述第一振荡的温度优选为3542， 更优选为37； 所述第。

39、二振荡 的温度优选为2832， 更优选为30； 所述第一离心的离心力优选为17001900g， 更优 选为所述第二离心的离心力为1800g； 所述第二离心的离心力优选为20002100g， 更优选 为2020g。 0124 本发明将与Cdk5蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取， 以所述质粒为模版， 用质 粒引物对进行PCR扩增， 得到纳米抗体VHH片段， 将所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接， 得到重组质粒； 所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物， 所述质粒上游引物具有 SEQ ID No.2所示的核苷酸序列； 所述质粒下游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。 0125 本发。

40、明对质粒的提取没有特殊限定， 采用常规提取质粒的方法即可。 本发明对所 述PCR扩增使用的体系和程序没有特殊限定， 采用常规使用的体系和程序即可。 在本发明 中， 所述所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物， 所述质粒上游引物优选具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列， 具体如下： 0126 CTAGCTAGCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCCG； 0127 所述质粒下游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列， 具体序列如下： 0128 CGAGCTCTGGAGCTGGGGTCTTCGC。 0129 本发明对所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接的方法没有特殊限定， 采用本。

41、领 域常规连接方法即可。 0130 本发明将得到的重组质粒、 pBAD18转入大肠杆菌， 得到纳米抗体表达菌株， 对所述 纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后， 提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白， 根据蛋 白分子量(15kDa左右)及His-tag标签对所述蛋白进行Western Blotting鉴定， 蛋白分子量 为15kDa的蛋白为Cdk5纳米抗体。 0131 本发明对所述重组质粒、 pBAD18转入大肠杆菌的转入方法没有特殊限定， 采用常 规方法即可。 本发明对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导的诱导方法没有特殊限定， 采 用常规诱导方法即可。 本发明对提取得到诱导后的纳米抗体表达。

42、菌株的蛋白的提取方法没 有特殊限定， 采用常规提取微生物中的蛋白的方法即可。 本发明对所述SDS-PAGE鉴定的方 法没有特殊限定， 采用常规即可。 0132 下面结合具体实施例对本发明所述的一种Cdk5纳米抗体和筛选方法做进一步详 细的介绍， 本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。 0133 实施例1 0134 细胞培养及抗原制备： 研究发现B16细胞内高表达的Cdk5是黑色素瘤细胞增殖加 快的重要因素之一。 通过PCR技术将小鼠Cdk5基因的CDS区与pCDNA3.1真核表达载体相连， 构建Cdk5真核表达载体， Lipofectamine 2000转染B16细胞， 转染56h后用含10。

43、FBS的DMEM 高糖培养基培养B16细胞， PBS清洗细胞3次后收集到15ml离心管， 3000g， 4离心10min。 弃 上清， 10ml的无菌生理盐水重悬沉淀， B16细胞破碎： -70和37反复冻融， 冻融时间为 15min/次， 超生破碎30min， 离心取上清。 用BCA检测蛋白浓度。 待作抗原。 0135 免疫程序及鉴定： 免疫之前采集10ml实验羊驼的促凝血液， 分离血清， 保存备用。 将上一步骤制备的蛋白分装成4管， 每管200 g， 挑选体况良好的成年雄性羊驼， 采取肩胛部 皮下注射的方式进行免疫， 免疫间隔为2周， 共免疫4次， 每次免疫的蛋白量为200 g， 其中初 。

44、说明书 7/21 页 10 CN 109678962 A 10 次免疫使用完全弗氏佐剂(Sigama)， 第二到第四次免疫使用不完全弗氏佐剂(Sigama)， 第 三次免疫后采集羊驼促凝血， 分离血清ELISA检测免疫效果， ELISA按说明书进行， 在此过程 中， 使用的二抗来源于llama。 0136 淋巴细胞总RNA的提取和VHH模板cDNA的合成 0137 按RNA提取试剂盒说明书提取RNA后， 并按长链cDNA反转录试剂盒说明书合成VHH 第一条链， 反应体系如表1： 0138 表1反应体系 0139 0140 0141 反应体系瞬时涡旋， PCR仪按40、 40min； 70、 1。

45、5min； 12保存的反应体系进行 反转录。 0142 第一轮PCR扩增VHH片段： 纳米抗体免疫文库构建采用巢式PCR法， 第一轮PCR扩增 的引物Call001-F和Call002-R， 其中Call001-F对应羊驼抗体的Leader区， Call002-R对应 于羊驼抗体的第二恒定区(CH2)， 可分别对常规抗体(900bp)及重链抗体(700bp)的leader 区及CH2区域进行扩增， 具体方法如下： 0143 第一轮PCR引物见表2： 0144 表2引物序列 0145 Call001-F：SEQ ID No.4GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG Call002-R：S。

46、EQ ID No.5GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC 说明书 8/21 页 11 CN 109678962 A 11 0146 以合成的第一链cDNA为模板进行PCR扩增， 反转录产物分成30个反应， 每个PCR反 应体系为50ul， 反应所用试剂为康为世纪的2xTap酶， 反应体系见表3： 0147 表3反应体系 0148 0149 0150 PCR扩增反应程序见表4： 0151 表4扩增程序 0152 0153 琼脂糖凝胶电泳分析第一轮PCR反应产物主要包含大小为900bp和700bp的两种扩 增产物， 紫外灯下切胶回收700bp的核酸， 胶回收试剂盒(康为世纪)回收纯化70。

47、0bp的核酸 片段， 1ul胶回收产物与pMD19-T simple载体相连， 反应体系见表5： 0154 表5反应体系 0155 pMD19-T simple1 l 胶回收产物1 l Solution I5 l WaterUp to 10ul 总体积10 l 说明书 9/21 页 12 CN 109678962 A 12 0156 瞬时涡旋反应体系， 4反应过夜， 热激连接产物与DH5 感受态细胞混匀， 冰上孵 育25min， 42精确热激90s， 冰上孵育4min， 加入400ul的LB培养基37、 200rpm孵育40min， 50ul转化后的菌液均匀的涂布到含有氨苄青霉素(AMP)的L。

48、B固体培养基表面， 培养板倒置， 37过夜培养。 次日挑取20个单克隆菌落接种到5ml含有AMP抗性的LB液体培养基过夜培养 后测定其碱基序列。 VectorNTI软件分析测序结果， 设计建库用的第二轮PCR引物VHH2-F和 VHH2-R。 0157 第二轮PCR扩增VHH： 以第一轮PCR产生的700bp的回收片段为模板， 以测序设计的 引物VHH2-F和VHH2-R进行VHH片段扩增。 50 l的反应体系， 共做24个PCR反应， 具体反应体系 见表6： 0158 表6反应体系 0159 胶回收产物80ug/ul6 l VHH2-F(10umol/ul)2 l VHH2-R(10umol。

49、/ul)2 l Taq Green PCR Mix25 l Water15 l 总体积50 l 0160 PCR扩增反应条件见表7： 0161 表7扩增程序 0162 0163 0164 取2ul二轮PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 扩增产物为单一条带。 二轮 VHH-PCR产物可直接使用核酸纯化试剂盒说明书进行纯化。 0165 VHH片段及载体酶切纯化： 摇菌质粒小提含有pCANTAB5e质粒的大肠杆菌。 抽取 10ul的质粒进行质粒测序， 检测所用质粒质量， 有无突变碱基等。 VHH片段及质粒pCANTAB5e 进行二轮酶切， 反应所用酶为SfiI(Thermo)， 酶切体系见表8：。

50、 0166 表8酶切体系 说明书 10/21 页 13 CN 109678962 A 13 0167 0168 VHH片段及pCANTAB5e载体进行2轮酶切以消除空载率， 第一轮VHH和载体都做20个 反应的酶切， 反应条件： 50水浴酶切1h。 PCR产物纯化试剂盒纯化VHH体系； 载体酶切体系 先进行琼脂糖纯化， 然后采用胶回收试剂盒纯化。 一轮酶切后的纯化产物按照上面的酶切 体系再度50水浴、 酶切1h， 两种产物再度纯化。 0169 酶切产物连接及纯化： 两轮酶切纯化后的VHH片段和载体pCANTAB5e进行连接， 连 接采用T4连接酶(Thermo)， 反应体系见表9： 0170 。