制备高纯度人树突状细胞的方法及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910138724.5 (22)申请日 2019.02.25 (71)申请人 上海尚泰生物技术有限公司 地址 200433 上海市杨浦区国泰路11号1层 展示厅A164室 (72)发明人 李晨蔚刘平磊 (74)专利代理机构 上海一平知识产权代理有限 公司 31266 代理人 王正君徐迅 (51)Int.Cl. C12N 5/0784(2010.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种制备高纯度人树突状细胞。

2、的方法及其 应用 (57)摘要 本发明提供了一种制备高纯度人树突状细 胞的方法及其应用， 具体地， 本发明提供了一种 诱导单核细胞分化为树突状细胞(DC)的方法， 用 本发明的方法获得的树突状细胞具有非常高的 分化率、 纯度和得率， 并且， 本发明的树突状细胞 可用于制备治疗癌症的树突状细胞疫苗。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 109679908 A 2019.04.26 CN 109679908 A 1.一种诱导单核细胞分化为树突状细胞(DC)的方法， 其特征在于， 包括步骤： (a)在第一培养条件下， 在培养体系中贴壁培养单核细胞， 从而获得贴壁的单核细胞， 为第一贴壁单核细。

3、胞； (b)在第二培养条件下， 在培养体系中诱导培养步骤(a)获得的第一贴壁单核细胞， 从 而获得含有所述第一贴壁单核细胞和悬浮细胞的第一混合物； (c)在第一培养条件下， 在培养体系中贴壁培养步骤(b)获得的第一混合物中的悬浮细 胞， 从而获得第二贴壁单核细胞； 和 (d)在第二培养条件下， 在培养体系中分别诱导培养步骤(b)和(c)获得的第一贴壁单 核细胞和第二贴壁单核细胞， 从而获得树突状细胞。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述方法还包括步骤(e)， 在第二培养条件 下， 在培养体系中诱导培养步骤(d)获得的树突状细胞， 获得经诱导培养的树突状细胞。 3.如权利要求2所述。

4、的方法， 其特征在于， 所述方法还包括步骤(f)， 在第三培养条件 下， 对步骤(e)中获得的经诱导培养的树突状细胞进行负载肿瘤抗原或病毒感染和诱导培 养， 从而获得成熟的树突状细胞。 4.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述第一培养条件含有第一培养基。 5.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述第一培养基选自下组： RPMI 1640、 X- VIVO-15、 AIM-V、 或其组合。 6.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述单核细胞来源于选自下组的细胞： 外周 单个核细胞(PBMC)、 脐带单个核细胞、 或其组合。 7.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述第二。

5、培养条件含有第二培养基。 8.如权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述第二培养基包括DC诱导分化培养基。 9.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(a)中， 将单核细胞在第一培养条件下培 养0.5-4h， 较佳地， 0.8-2h， 更佳地， 1-1.5h。 10.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(c)中， 将悬浮细胞在第一培养条件下 培养5-25min， 较佳地， 8-20min， 更佳地， 10-15min。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109679908 A 2 一种制备高纯度人树突状细胞的方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术和细胞治疗领域。 。

6、具体地， 本发明涉及一种制备高纯度人树 突状细胞的方法及其应用。 背景技术 0002 充分调动机体的免疫系统来使肿瘤的治疗获益， 长久以来一直是免疫学和肿瘤学 的共同目标。 肿瘤细胞免疫治疗作为一种新兴的肿瘤治疗模式， 通常是指通过触发机体免 疫系统， 对肿瘤相关抗原(TAAs)产生反应并攻击肿瘤细胞， 从而抑制或阻止肿瘤生长。 肿瘤 细胞免疫治疗已经成为目前肿瘤治疗研究的热点， 并逐渐被认为是一种行之有效的治疗方 法。 0003 树突状细胞(Dendritic cells， DC)是人体内功能最强的专职抗原提呈细胞 (APC)， 它能激活CD8+细胞毒性T细胞(CTL)和CD4+辅助性T细胞。

7、(Th)， 在抗肿瘤、 抗病毒等免 疫应答过程中发挥重要作用， 是机体免疫应答的始动者， 一种天然的 “免疫佐剂” 。 通过DC可 诱导特异性抗肿瘤免疫应答， 调动患者的免疫系统清除肿瘤或预防微小残留病灶的复发， 是基础及临床研究追求的共同目标。 0004 自Steinman发现DC及其在获得性免疫应答中的关键作用以来， 全球范围的DC疫苗 研究持续进行了数十年， 相关的临床试验也正在进行或已经完成， 并已经在黑色素瘤、 前列 腺癌、 肾癌等肿瘤中展现了较好的疗效， 同时研究显示， DC疫苗是一种十分安全的治疗方 法， 目前在临床试验中尚未观察到DC疫苗明显的不良反应以及毒性反应。 0005 。

8、DC的分离培养是DC基础与临床研究的关键步骤之一， 高效大量获得高纯度、 高活 性DC是制备DC疫苗的关键。 目前DC获得的方法主要有三种： 第一种是直接分离富集外周血 DC， 由于DC不表达特异性分子， 因此可以通过各系细胞特异性抗体负选出DC， 或者通过成熟 DC表达CD83等分子的特性正选出活化的DC； 第二种方法是由自体CD34+干细胞诱导DC； 这两 种方法由于外周血DC含量不到1， 脐带血和骨髓中CD34+细胞仅有1左右， 获取成本较 高、 操作复杂， 因此在实际的临床应用中较少采用。 当前临床常规的DC制备方法多采用病人 自体的单核细胞诱导DC(MoDC)， 主要原因是单核细胞容。

9、易获取， 其数量占PBMC的比例也较 高(10左右)。 0006 即便采用自体单核细胞诱导DC， 但获取的方法也有很大的不同， 主要也包括三种 方法， 一是采用CD14单抗磁珠分选； 二是采用连续密度梯度离心分离法， 如Percoll； 这两种 方法操作复杂， 成本较高， 虽然制备的DC纯度较高， 但是得率较低。 因此目前临床单核细胞 的获取多采用第三种方法， 即贴壁分离法。 该方法操作简单、 成本低， 但最大的缺点是诱导 获得的DC纯度不高， 在临床应用中也未能达到理想的效果， 因为DC纯度偏低， 会存在免疫耐 受的问题。 0007 因此， 目前常规的单核细胞来源的DC制备方案存在诱导时间较。

10、长(一般79天)、 DC纯度低(一般不超过50)、 细胞功能缺失、 细胞质量不均一等问题， 导致DC疫苗的临床效 果不佳。 说明书 1/8 页 3 CN 109679908 A 3 0008 因此， 本领域迫切需要开发新的制备高纯度人树突状细胞的方法， 从而获得高纯 度、 高得率的树突状细胞。 发明内容 0009 本发明公开了一种新的制备高纯度人树突状细胞的方法， 从而获得高纯度、 高得 率的树突状细胞。 0010 在本发明第一方面， 提供了一种诱导单核细胞分化为树突状细胞(DC)的方法， 包 括步骤： 0011 (a)在第一培养条件下， 在培养体系中贴壁培养单核细胞， 从而获得贴壁的单核细 。

11、胞， 为第一贴壁单核细胞； 0012 (b)在第二培养条件下， 在培养体系中诱导培养步骤(a)获得的第一贴壁单核细 胞， 从而获得含有所述第一贴壁单核细胞和悬浮细胞的第一混合物； 0013 (c)在第一培养条件下， 在培养体系中贴壁培养步骤(b)获得的第一混合物中的悬 浮细胞， 从而获得第二贴壁单核细胞； 和 0014 (d)在第二培养条件下， 在培养体系中分别诱导培养步骤(b)和(c)获得的第一贴 壁单核细胞和第二贴壁单核细胞， 从而获得树突状细胞。 0015 在另一优选例中， 所述方法还包括步骤(e)， 在第二培养条件下， 在培养体系中诱 导培养步骤(d)获得的树突状细胞， 获得经诱导培养。

12、的树突状细胞。 0016 在另一优选例中， 所述方法还包括步骤(f)， 在第三培养条件下， 对步骤(e)中获得 的经诱导培养的树突状细胞进行负载肿瘤抗原或病毒感染和诱导培养， 从而获得成熟的树 突状细胞。 0017 在另一优选例中， 所述第一培养条件含有第一培养基。 0018 在另一优选例中， 所述第一培养基选自下组： RPMI 1640、 X-VIVO-15、 AIM-V、 或其 组合。 0019 在另一优选例中， 所述第一培养基包括RPMI 1640。 0020 在另一优选例中， 所述单核细胞来源于选自下组的细胞： 外周单个核细胞(PBMC)、 脐带单个核细胞、 或其组合。 0021 在另。

13、一优选例中， 所述第二培养条件含有第二培养基。 0022 在另一优选例中， 所述第二培养基包括DC诱导分化培养基。 0023 在另一优选例中， 所述第二培养基含有选自下组的成分： 血浆、 rhGM-CSF、 rhIL-4、 或其组合。 0024 在另一优选例中， 所述血浆为自体血浆。 0025 在另一优选例中， 所述第二培养基中， 所述血浆的含量(体积百分比)为0.5- 10， 较佳地， 1-8， 更佳地， 2-4。 0026 在另一优选例中， 所述第二培养基中， 所述rhGM-CSF的浓度(ng/mL)为10-200ng/ mL， 较佳地， 20-150ng/mL， 更佳地， 50-100n。

14、g/mL。 0027 在另一优选例中， 所述第二培养基中， 所述rhIL-4的浓度为5-200ng/mL， 较佳地， 10-100ng/mL， 更佳地， 20-50ng/mL。 0028 在另一优选例中， 所述单核细胞来源于人的外周血或脐带血收集的单个核细胞。 说明书 2/8 页 4 CN 109679908 A 4 0029 在另一优选例中， 步骤(a)中， 将单核细胞在第一培养条件下培养0.5-4h， 较佳地， 0.8-2h， 更佳地， 1-1.5h。 0030 在另一优选例中， 步骤(b)中， 将第一贴壁细胞在第二培养条件下培养4-24h， 较佳 地， 6-16h， 更佳地， 8-12h。

15、。 0031 在另一优选例中， 步骤(c)中， 将悬浮细胞在第一培养条件下培养5-25min， 较佳 地， 8-20min， 更佳地， 10-15min。 0032 在另一优选例中， 步骤(d)中， 将第一贴壁培养细胞在第二培养条件下培养24- 120h， 较佳地， 48-108h， 更佳地， 72-96h。 0033 在另一优选例中， 步骤(d)中， 将第二贴壁培养细胞在第二培养条件下培养24- 120h， 较佳地， 48-96h。 0034 在另一优选例中， 步骤(a)中， 在培养体系中， 所述起始单核细胞(单个核细胞)的 密度为2106-2107个细胞/mL， 较佳地， 3106-1.5。

16、107个细胞/mL， 更佳地， 5106-1 107个细胞/mL。 0035 在另一优选例中， 步骤(c)中， 在培养体系中， 所述悬浮细胞的密度为5105-1 107个细胞/mL， 较佳地， 1106-8106个细胞/mL， 更佳地， 2.5106-5106个细胞/mL。 0036 在另一优选例中， 步骤(e)中， 将树突状细胞在第二培养条件下培养24-120h， 较佳 地， 48-108h， 更佳地， 76-96h。 0037 在另一优选例中， 所述步骤(e)中， 在培养体系中， 所述树突状细胞的密度为3 105-3106个细胞/mL， 较佳地， 5105-2106个细胞/mL， 更佳地，。

17、 7105-1106个细胞/ mL。 0038 在另一优选例中， 所述第三培养条件含有DC诱导成熟试剂。 0039 在另一优选例中， 所述DC诱导成熟试剂包括： rhIFN-、 LPS、 或其组合。 0040 在另一优选例中， 所述DC诱导成熟试剂中， 所述rhIFN-的浓度为10-200ng/mL， 较佳地， 25-150ng/mL， 更佳地， 50-100ng/mL。 0041 在另一优选例中， 所述LPS的浓度为10-200EU/mL， 较佳地， 25-150ng/EU/mL， 更佳 地， 50-100EU/mL。 0042 在另一优选例中， 步骤(f)中， 将经诱导培养的树突状细胞在第。

18、三培养条件下培养 8-36h， 较佳地， 12-24h， 更佳地， 16-20h。 0043 在另一优选例中， 步骤(f)中， 对经诱导培养的树突状细胞进行负载肿瘤抗原或病 毒感染8-48h， 较佳地， 12-36h， 更佳地， 16-24h。 0044 在另一优选例中， 所述方法具有选自下组的一个或多个特征： 0045 (i)高树突状细胞的分化率， 所述分化率为90； 0046 (ii)高树突状细胞的纯度， 所述纯度为70-80； 0047 (iii)高树突状细胞的得率， 所述得率为9-11。 0048 在另一优选例中， 所述方法包括治疗性和非治疗性的。 0049 本发明第二方面提供了一种树。

19、突状细胞， 所述树突状细胞为成熟的树突状细胞， 90的细胞处于半悬浮状态。 0050 在另一优选例中， 所述的树突状细胞具有选自以下一种或多种特征： 0051 (a)85-98的细胞为CD80表达阳性(CD80+)； 说明书 3/8 页 5 CN 109679908 A 5 0052 (b)85-98的细胞为CD83表达阳性(CD83+)； 0053 (c)85-98的细胞为HLA-DR表达阳性(HLA-DR+)； 0054 (d)85-98的细胞为CD11c表达阳性(CD11c+)； 0055 (e)85-98的细胞中的CD80、 CD83和HLA-DR的表达量增加； 0056 (f)细胞为。

20、IL-12表达阳性； 0057 (g)细胞中的IL-12的表达量增加。 0058 在另一优选例中， 所述的树突状细胞由本发明第一方面所述方法制备获得。 0059 在另一优选例中， 所述的树突状细胞由单核细胞诱导获得。 0060 在另一优选例中， 所述的树突状细胞具有选自下组的一个或多个特征： 0061 (a)CD80基因高表达； 0062 (b)CD83基因高表达； 0063 (c)HLA-DR基因高表达； 0064 (d)IL-12基因高表达。 0065 本发明第三方面提供了一种本发明第二方面所述的树突状细胞的用途， 用于制备 治疗癌症的树突状细胞疫苗。 0066 在另一优选例中， 所述癌症。

21、选自下组： 肺癌、 肝癌、 结直肠癌、 胃癌、 肾癌、 胰腺癌、 卵巢癌、 前列腺癌、 黑色素瘤、 胶质母细胞瘤、 或其组合。 0067 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在 此不再一一累述。 附图说明 0068 图1所示为本发明具体实施方式中成熟人DC的形态图。 0069 图2所示为本发明具体实施方式中成熟人DC的得率及纯度统计分析图。 0070 图3所示为本发明具体实施方式中成熟人DC的标志物流式分析图。 0071 图4所示为本发明具体实施方式中成熟人DC分泌IL。

22、-12p70的检测分析图。 具体实施方式 0072 本发明人经过广泛而深入的研究， 首次意外地发现， 在培养体系中通过两轮贴壁 培养， 可获得高分化率(90)、 高纯度(70-80)、 高得率(9-11)的树突状细胞。 0073 具体地， 本发明在第一培养条件下贴壁培养单核细胞(即第一轮差速贴壁培养)， 可获得第一贴壁单核细胞， 将第一贴壁单核细胞在第二培养条件下培养， 可获得含第一贴 壁单核细胞和悬浮细胞的第一混合物， 随后在第一培养条件下， 对第一混合物中的悬浮细 胞再一次进行贴壁培养(即第二轮差速贴壁培养)， 从而获得第二贴壁单核细胞， 之后在第 二培养条件下， 对第一贴壁单核细胞和第二。

23、贴壁单核细胞进行诱导培养， 从而获得具有高 分化率、 高纯度和高得率的树突状细胞。 本发明的树突状细胞可用于制备治疗癌症(如肺 癌、 肝癌、 结直肠癌、 胃癌、 肾癌、 胰腺癌、 卵巢癌、 前列腺癌、 黑色素瘤、 胶质母细胞瘤等)的 树突状细胞疫苗。 在此基础上， 本发明人完成了本发明。 0074 术语 说明书 4/8 页 6 CN 109679908 A 6 0075 如本文所用， 如非特指单个细胞， 术语 “树突状细胞” 指的是经本发明方法制备获 得的树突状细胞， 所述树突状细胞具有明显的树突样突起， 多呈集落形式生长， 并且90细 胞处于半悬浮状态， 并且其还具有以下一种或多种特征： 0。

24、076 (a)CD80基因高表达； 0077 (b)CD83基因高表达； 0078 (c)HLA-DR基因高表达； 0079 (d)IL-12基因高表达。 0080 如本文所用， 术语 “自体血浆” 指患者自体分离获得的血浆。 0081 单核细胞 0082 单核细胞指外周血或脐带血单个核细胞中体积最大的一类细胞， 其贴壁能力较快 于淋巴细胞， 它是巨噬细胞和树突状细胞的前身， 在GM-CSF和IL-4等条件下可向树突状细 胞诱导分化。 0083 在本发明中， 单核细胞没有特别限制， 一种优选的单核细胞来源于包括外周血单 个核细胞(PBMC)和脐带血单个核细胞。 0084 悬浮细胞 0085 悬。

25、浮细胞指外周血和脐带血单个核细胞中未贴壁的淋巴细胞、 单核细胞、 NK细胞 等细胞的总称。 0086 树突状细胞的诱导培养方法 0087 本发明的树突状细胞的起始细胞为人的单核细胞(如PBMC)， 在第一培养条件下 (含有如RPMI 1640、 X-VIVO-15、 AIM-V等的培养基)进行贴壁培养(即第一轮差速贴壁培 养)， 从而获得贴壁的单核细胞， 为第一贴壁单核细胞。 0088 接着， 在第二培养条件下(如DC诱导分化培养基)， 对第一贴壁单核细胞进行进一 步培养， 获得含有所述第一贴壁单核细胞和悬浮细胞的第一混合物。 0089 在第一培养条件下(含有如RPMI 1640、 X-VIV。

26、O-15、 AIM-V等的培养基)， 对第一混 合物中的悬浮细胞进行第二轮差速贴壁培养， 获得第二贴壁单核细胞。 0090 在第二培养条件下(如DC诱导分化培养基)， 对第一贴壁单核细胞和第二贴壁单核 细胞分别进行诱导培养， 获得树突状细胞。 0091 在一优选实施方式中， 所述方法还包括： 在第二培养条件下(含有如RPMI 1640、 X- VIVO-15、 AIM-V等的培养基)， 在培养体系中诱导培养获得的树突状细胞， 获得经诱导培养 的树突状细胞。 0092 在一优选实施方式中， 所述方法还包括： 在第三培养条件下(含有DC诱导成熟试 剂)， 对获得的经诱导培养的树突状细胞进行负载肿瘤。

27、抗原或病毒感染和诱导培养， 从而获 得成熟的树突状细胞。 0093 在一优选实施方式中， 第一培养条件下的第一培养基为RPMI 1640， 购自Thermo Fisher Scientific公司。 0094 在一优选实施方式中， 第二培养条件下的第二培养基为DC诱导分化培养基为在第 一培养基中添加2的自体血浆、 100ng/ml的rhGM-CSF和50ng/ml的rhIL4。 0095 在一优选实施方式中， 发明的诱导单核细胞分化为树突状细胞的方法包括以下步 骤： 说明书 5/8 页 7 CN 109679908 A 7 0096 步骤1： 自体血浆的制备和外周血单个核细胞(PBMC)的分离。

28、； 0097 步骤2： 分离获取的PBMC采用两轮差速贴壁分离法获得单核细胞， 并向DC诱导分 化； 0098 步骤3： 成熟DC的制备和纯度及活性的检测。 0099 作为本发明的进一步改进， 所述步骤1具有如下分步骤： 0100 a)取50100mL外周血， 200300g离心10min收集血浆和血细胞； 0101 b)收集的血浆以10002000g离心10min， 去除血小板， 56水浴30min灭活补体， 10002000g离心10min， 上清4或-20保存备用； 0102 c)收集的血细胞加入1.01.5倍血浆体积的稀释缓冲液， 悬浮血细胞； 0103 d)在离心管中加入Ficoll。

29、分离液， 沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的血细胞(Ficoll 和稀释血的体积比为1:2)； 0104 e)500600g离心1520min， 收集白膜层细胞， 并用缓冲液洗12次， 500600g 离心510min收集PBMC， 并计数； 0105 作为本发明的进一步改进， 所述步骤2具有如下分步骤： 0106 a)将步骤1收集的PBMC以(510)X106/mL细胞密度重悬于无血清培养基， 铺布到 培养瓶中， 进行第一轮差速贴壁12h后， 收集上清中的淋巴细胞(收集的淋巴细胞可冻存 或用于DC-CIK或DC-CTL等免疫细胞的制备)； 0107 b)贴壁的单核细胞用缓冲液吹洗12次后， 加入DC。

30、诱导分化培养基， 置于37、 5CO2培养箱中诱导培养612h(Day 0)； 0108 c)收集培养瓶中悬浮的细胞。 贴壁的单核细胞再次加入新鲜DC诱导分化培养基继 续诱导培养； 而收集的悬浮细胞以(2.55)X106/mL细胞密度重悬于培养基， 铺布到培养瓶 中， 进行第二轮差速贴壁515min后， 弃去悬浮的细胞， 二次贴壁的单核细胞用缓冲液吹洗 12次后， 加入DC诱导分化培养基继续诱导培养(Day1)； 0109 d)为进一步提高DC的纯度， 二次贴壁的单核细胞可选择在诱导培养24h后， 再次 弃去悬浮的细胞， 更换新鲜DC诱导分化培养基继续诱导培养。 0110 作为本发明的进一步改。

31、进， 所述步骤3具有如下分步骤： 0111 a)步骤2中两轮贴壁的单核细胞在继续诱导7296h后， 收集悬浮的未成熟DC (iDC)， 并重悬于DC诱导培养基中， 计数， 调整细胞密度为(0.51)X106/mL， 转移到相应培 养板中用于肿瘤抗原的装载或基因的修饰(Day 34)； 0112 b)DC细胞在负载肿瘤抗原或病毒感染24h后， 半量换液， 并加入DC诱导成熟试剂 (Day 45)； 0113 c)在诱导培养1624h后收获成熟的DC(Day 56)， 并进行纯度和活性的检测。 0114 作为本发明的进一步改进， 所述缓冲液为PBS、 DPBS和生理盐水中的一种。 0115 作为本。

32、发明的进一步改进， 所述无血清培养基为RPMI 1640、 X-VIVO-15和AIM-V中 的一种。 0116 作为本发明的进一步改进， 所述DC诱导培养基为含有210自体血浆、 50 100ng/mL rhGM-CSF和25100ng/mL rhIL-4的无血清培养基。 0117 作为本发明的进一步改进， 步骤3所述DC促成熟剂优选的组合为50100ng/mL rhIFN-和50100EU/mL LPS。 说明书 6/8 页 8 CN 109679908 A 8 0118 采用此优选的技术方案， 使得诱导的DC具有更高的成熟度和更好的活性， 主要表 现为诱导成熟的DC分泌较高水平的IL-1。

33、2。 0119 本发明的主要优点包括： 0120 (1)本发明首次发现， 本发明在培养体系中培养单核细胞， 可获得高分化率( 90)、 高纯度(70-80)、 高得率(911)的树突状细胞。 0121 (2)本发明首次发现， 本发明诱导的DC具有更高的成熟度和更好的活性， 主要表现 为诱导成熟的DC分泌较高水平的IL-12。 0122 (3)本发明首次发现， 采用本发明所制备的人树突状细胞不仅纯度和活性高， 同时 得率高、 制备成本低、 操作简便、 制备周期短(由常规的79天， 缩短到5天)， 因此可用于人 树突状细胞疫苗的大量制备， 并广泛应用于基础研究和肿瘤的临床治疗中。 0123 下面结。

34、合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件， 例如Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。 0124 除非另有说明， 否则本发明实施例中所用的试剂和材料均为市售产品。 0125 实施例1自体血浆的制备和外周血单个核细胞(PBMC)的分离： 0126 取志愿者外周静脉血5。

35、0mL， 250g离心10min， 分别收集血浆(上层)和血细胞(下 层)； 收集的血浆以1000g离心10min， 去除血小板， 56水浴30min灭活补体， 1500g离心 10min收集上清， 即获得自体血浆， 4或-20保存以用于DC等细胞的培养。 0127 收集的血细胞加入1.5倍血浆体积的稀释缓冲液DPBS悬浮； 在离心管中加入预温 密度1.077的Ficoll分离液， 沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的血细胞(Ficoll和稀释血的体积 比为1:2)； 600g离心15min， 升降速分别为1和1， 收集白膜层细胞， 并用DPBS洗2次， 500g离心 10min收集PBMC， 并计数，。

36、 细胞密度在1X108/mL左右。 0128 实施例2单核细胞的获取及向DC诱导分化： 0129 分离获得的PBMC以5X106/mL细胞密度重悬于RPMI 1640培养基中， 铺布到T75培养 瓶中， 置于37、 5CO2培养箱中进行第一轮差速贴壁1.5h后， 拍打培养瓶， 让未贴壁的细 胞悬起， 以收集上清中的淋巴细胞； 贴壁的单核细胞用DPBS吹洗12次后， 加入DC诱导分化 培养基(2自体血浆+100ng/mL rhGM-CSF+50ng/mL rhIL-4)， 37、 5CO2培养箱诱导培 养(Day 0)； 0130 诱导培养1012h后， 收集培养瓶中悬浮的细胞。 贴壁的单核细胞。

37、再次加入新鲜DC 诱导分化培养基继续诱导培养； 而收集的悬浮细胞以2.5X106/mL细胞密度重悬于RPMI 1640培养基， 铺布到T75培养瓶中， 置于37、 5CO2培养箱中进行第二轮差速贴壁10min 后， 弃去悬浮的淋巴细胞， 二次贴壁的单核细胞用吹洗12次后， 加入DC诱导分化培养基继 续诱导培养(Day 1)。 为了节省培养基的使用， 该步骤中离心收集的DC诱导培养基可以回 收， 以混合新鲜的DC诱导培养基二次利用。 0131 实施例3成熟DC的制备和纯度及活性的检测 0132 两轮贴壁的单核细胞在继续诱导72h后， 收集悬浮的未成熟DC(iDC)， 并重悬于DC 诱导培养基中，。

38、 计数， 调整细胞密度为1X106/mL， 转移到6孔板或24孔板中用于肿瘤抗原的 说明书 7/8 页 9 CN 109679908 A 9 装载或基因的修饰(Day 3)； 0133 DC细胞在负载肿瘤抗原或病毒感染24h后， 半量换液， 并加入DC诱导成熟试剂(终 浓度为100ng/mL rhIFN-和50EU/mL LPS)(Day 4)； 在诱导培养1624h后， 收获成熟的DC (Day 5)。 0134 通过显微镜观察DC细胞的形态(如附图1所示)， 可见成熟的DC有多个树突样突起， 多呈集落形式生长， 并且90细胞处于半悬浮状态。 进一步的流式细胞分群检测显示成熟 的DC的比例大。

39、于70， 而淋巴细胞的比例则低于20， 表明DC细胞具有较高的纯度。 0135 同时， 本实施例分别采集了6位志愿者的外周静脉血各100mL左右， 平分两份， 分别 同时采用常规差速贴壁和本发明的间隔两轮差速贴壁进行DC细胞的诱导制备， 对制备的成 熟DC进行得率和纯度的统计(如附图2所示)， 统计数据显示常规法获得的成熟DC得率为 (10.672.43)106/108PBMC， 纯度为(43.007.13)； 而本发明获得的成熟DC得率为 (9.581.59)106/108PBMC， 纯度为(73.868.85)。 0136 结果表明采用本发明所制备的人DC， 在保证与常规贴壁分离法得率基本。

40、一致的情 况下， 纯度得到显著的提高， 约为常规方法的1.5倍。 0137 进一步通过流式细胞仪检测成熟DC细胞表明标志物CD80、 CD83和HLA-DR， 结果显 示， 本发明所制备的人DC， 在诱导培养的第5天， 其细胞表面的CD80、 CD83及HLA-DR的表达量 增强(如附图3所示)， 各标志物高表达的DC比例均大于90， 表明培养的DC细胞具有较高的 成熟度。 进一步通过ELISA对成熟DC进行IL-12分泌量的检测发现， 本发明所制备的人DC表 达较高水平的IL-12(如附图4所示)， 表明培养的DC细胞同时具有较高的活性。 0138 综上所述， 本发明是对目前常规单核细胞来源。

41、DC制备方法的改进， 主要体现在采 用间隔的两轮差速贴壁分离法分离获得单核细胞并诱导DC， 相比常规的贴壁分离法， 在保 证一定得率的基础上， 显著提高了获得DC的纯度； 另一方面， 在提升DC纯度的基础上， 我们 同时采用了更为优化和简单的DC促成熟剂组合， 即保证了DC的成熟度， 又促进了DC的活性， 主要体现在IL-12的分泌量显著增加。 0139 总之， 本发明所制备的人树突状细胞具有纯度高、 操作简便快捷、 制备成本低等优 点， 可用于人树突状细胞疫苗的大量制备。 0140 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。 说明书 8/8 页 10 CN 109679908 A 10 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 11 CN 109679908 A 11 图4 说明书附图 2/2 页 12 CN 109679908 A 12 。